Baseplating en een miniscoop preanchored met een objectieve lens gebruiken voor calciumtransiënt onderzoek bij muizen

Fluorescerende activiteitsreporters zijn ideaal voor beeldvorming van de neuronale activiteit omdat ze gevoelig zijn en een groot dynamisch bereik hebben^{van 1,2,3}. Daarom gebruikt een toenemend aantal experimenten fluorescentiemicroscopie om neuronale activiteit direct te observeren 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ^,16. De eerste geminiaturiseerde fluorescentiemicroscoop (miniscoop) met één foton werd in 2011 ontworpen door Mark Schnitzer et ^al.5. Deze miniscoop stelt onderzoekers in staat om de fluorescentiedynamiek van cerebellaire cellen te volgen bij zich vrij gedragende dieren⁵ (d.w.z. zonder enige fysieke beperking, hoofdsteun, sedatie of anesthesie voor de dieren). Momenteel kan de techniek worden toegepast om oppervlakkige hersengebieden zoals de cortex ^6,8,15,16 te monitoren; subcorticale gebieden zoals de dorsale hippocampus 8,11,13,14 en striatum ^6,17; en diepe hersengebieden zoals de ventrale hippocampus¹⁴, amygdala ^10,18 en hypothalamus ^8,12.

In de afgelopen jaren zijn er verschillende open-source miniscopen ontwikkeld.^{4,5,6,7,11,13,17,19}. De miniscoop kan economisch worden samengesteld door onderzoekers als ze de stapsgewijze richtlijnen volgen van het Miniscope-team van de Universiteit van Californië, Los Angeles (UCLA)^4,7,11,13. Omdat optische monitoring van neurale activiteit wordt beperkt door de beperkingen van lichttransmissie⁷ van en naar de neuronale populatie van belang, werd een miniscoop ontworpen die vereist dat een objectieve gradiënt brekingsindex (GRIN) lens (of objectieve lens) aan de onderkant van de miniscoop wordt voorgeanchored om het gezichtsveld te vergroten dat wordt doorgegeven door een relais GRIN-lens (of relaislens)^{6,7,8,10,16,17}. Deze relaislens wordt geïmplanteerd in het doelhersengebied, zodat de fluorescentieactiviteit van het doelbreingebied wordt doorgegeven aan het oppervlak van de relaislens^{6,7,8,10,16,17}. Ongeveer 1/4 van een volledige sinusoïdale periode van licht reist door de objectieve GRIN-lens (~ 0,25 toonhoogte) (Figuur 1A1), wat resulteert in een vergrote fluorescentieafbeelding^6,7. De objectieflens is niet altijd aan de onderkant van de miniscoop bevestigd, noch is de implantatie van de relaislens nodig^6,7,11,13,15. Concreet zijn er twee configuraties: een met een vaste objectieflens in de miniscoop en een relaislens geïmplanteerd in de hersenen^{8,10,12,14,16} (Figuur 1B1) en een andere met alleen een verwijderbare objectieflens^6,7,11,13,15 (Figuur 1B2). In het ontwerp op basis van het vaste doel en de geïmplanteerde relaislenscombinatie worden de fluorescentiesignalen van de hersenen naar het bovenoppervlak van de relaislens gebracht (Figuur 1A1)^{7,8,10,12,14,16}. Vervolgens kan de objectieflens het gezichtsveld vanaf het bovenoppervlak van de relaislens vergroten en verzenden (Figuur 1A2). Aan de andere kant is het ontwerp van de verwijderbare objectieve GRIN-lens flexibeler, wat betekent dat pre-implantatie van een relaislens in de hersenen niet verplicht is (Figuur 1B2)^6,7,11,13,15. Bij het gebruik van een miniscoop op basis van een verwijderbaar objectieflensontwerp, moeten onderzoekers nog steeds een lens in het doelhersengebied implanteren, maar ze kunnen een objectieve lens implanteren^6,7,11,13,15 of een relaislens in de hersenen^6,7. De keuze van een objectief of een relaislens voor implantatie bepaalt de miniscoopconfiguratie die de onderzoeker moet gebruiken. De V3 UCLA Miniscope is bijvoorbeeld gebaseerd op een verwijderbaar objectief GRIN-lensontwerp. Onderzoekers kunnen ervoor kiezen om een objectieve lens rechtstreeks in het hersengebied van belang te implanteren en de “lege” miniscoop op de objectieve lens te monteren^6,7,11,13,15 (een systeem met één lens; Figuur 1B2) of om een relaislens in de hersenen te implanteren en een miniscoop te monteren die vooraf is voorzien van een objectieve lens^6,7 (een systeem met twee lenzen; Figuur 1B1). De miniscoop werkt vervolgens als een fluorescentiecamera om livestreambeelden vast te leggen van neuronale fluorescentie geproduceerd door een genetisch gecodeerde calciumindicator^1,2,3. Nadat de miniscoop op een computer is aangesloten, kunnen deze fluorescentiebeelden naar de computer worden overgebracht en als videoclips worden opgeslagen. Onderzoekers kunnen neuronale activiteit bestuderen door de relatieve veranderingen in fluorescentie te analyseren met sommige analysepakketten^20,21 of schrijf hun codes voor toekomstige analyse.

De V3 UCLA Miniscope biedt gebruikers flexibiliteit om te bepalen of ze neuronale activiteit in beeld willen brengen met een systeem met één of twee lenzen⁷. De keuze van het opnamesysteem is gebaseerd op de diepte en grootte van het doelhersengebied. Kortom, een systeem met één lens kan alleen een gebied in beeld brengen dat oppervlakkig (minder dan ongeveer 2,5 mm diep) en relatief groot (groter dan ongeveer 1,8 x 1,8 mm²) is omdat de fabrikanten slechts een bepaalde grootte objectieflens produceren. Daarentegen kan een systeem met twee lenzen worden toegepast op elk doelgebied van de hersenen. Het tandcement voor het lijmen van de bodemplaat heeft echter de neiging om een verkeerde uitlijning te veroorzaken met een veranderde afstand tussen het objectief en de relaislenzen, wat resulteert in een slechte beeldkwaliteit. Als het systeem met twee lenzen wordt gebruikt, moeten twee werkafstanden nauwkeurig worden gericht om de optimale beeldkwaliteit te bereiken (figuur 1A). Deze twee kritische werkafstanden liggen tussen de neuronen en het onderste oppervlak van de relaislens en tussen het bovenoppervlak van de relaislens en het onderste oppervlak van de objectieflens (figuur 1A1). Elke verkeerde uitlijning of misplaatsing van de lens buiten de werkafstand resulteert in beeldfalen (figuur 1C2). Het systeem met één lens daarentegen vereist slechts één precieze werkafstand. De grootte van de objectieve lens beperkt echter de toepassing ervan voor het monitoren van diepe hersengebieden (de objectieve lens die bij de miniscoop past, is ongeveer 1,8 ~ 2,0 mm 6,11,13,15). Daarom is implantatie van een objectieve lens beperkt voor de observatie van het oppervlak en relatief grote hersengebieden, zoals de cortex ^6,15 en dorsale cornu ammonis 1 (CA1) bij muizen^11,13 . Bovendien moet een groot deel van de cortex worden geaspireerd om de dorsale CA1^11,13 te targeten. Vanwege de beperking van de configuratie met één lens die beeldvorming van diepe hersengebieden voorkomt, bieden commerciële miniscoopsystemen alleen een gecombineerd objectief lens / relaislens (twee-lens) ontwerp. Aan de andere kant kan de V3 UCLA-miniscoop worden gewijzigd in een systeem met één lens of twee lenzen, omdat de objectieflens verwijderbaar is 6,11,13,15. Met andere woorden, V3 UCLA-miniscoopgebruikers kunnen profiteren van de verwijderbare lens door deze in de hersenen te implanteren (een systeem met één lens te creëren), bij het uitvoeren van experimenten met oppervlakkige hersenobservaties (minder dan 2,5 mm diep), of door deze vooraf in de miniscoop te implanteren en een relaislens in de hersenen te implanteren (waardoor een systeem met twee lenzen ontstaat), bij het uitvoeren van experimenten met diepe hersenobservaties. Het systeem met twee lenzen kan ook worden toegepast voor het oppervlakkig observeren van de hersenen, maar de onderzoeker moet de nauwkeurige werkafstanden tussen de objectieve lens en de relaislens kennen. Het grote voordeel van het systeem met één lens is dat er een kleinere kans is om de werkafstanden te missen dan bij een systeem met twee lenzen, aangezien er twee werkafstanden zijn die nauwkeurig moeten worden gericht om een optimale beeldkwaliteit in het systeem met twee lenzen te bereiken (figuur 1A). Daarom raden we aan om een systeem met één lens te gebruiken voor oppervlakkige hersenobservaties. Als het experiment echter beeldvorming in het diepe hersengebied vereist, moet de onderzoeker leren om verkeerde uitlijning van de twee lenzen te voorkomen.

Het basisprotocol voor de configuratie van miniscopen met twee lenzen voor experimenten omvat lensimplantatie en baseplating 8,10,16,17. Baseplating is het lijmen van een bodemplaat op het hoofd van een dier, zodat de miniscoop uiteindelijk bovenop het dier kan worden gemonteerd en de fluorescentiesignalen van neuronen kan worden gefilmd (figuur 1B). Deze procedure omvat het gebruik van tandcement om de bodemplaat op de schedel te lijmen (figuur 1C), maar de krimp van tandcement kan onaanvaardbare veranderingen veroorzaken in de afstand tussen de geïmplanteerde relaislens en de objectieflens ^8,17. Als de verschoven afstand tussen de twee lenzen te groot is, kunnen cellen niet scherp worden gesteld.

Gedetailleerde protocollen voor diepe calciumbeeldvormingsexperimenten in de hersenen met behulp van miniscopen zijn al gepubliceerd^8,10,16,17. De auteurs van deze protocollen hebben het Inscopix-systeem gebruikt^8,10,16 of andere aangepaste ontwerpen¹⁷ en hebben de experimentele procedures voor virale selectie, chirurgie en baseplate attachment beschreven. Hun protocollen kunnen echter niet precies worden toegepast op andere open-sourcesystemen, zoals het V3 UCLA Miniscope-systeem, NINscope⁶en Finchscope¹⁹. Verkeerde uitlijning van de twee lenzen kan optreden tijdens de opname in een configuratie met twee lenzen met een UCLA-miniscoop vanwege het type tandcement dat wordt gebruikt om de bodemplaat aan de schedel te cementeren^8,17 (Figuur 1C). Het huidige protocol is nodig omdat de afstand tussen de geïmplanteerde relaislens en de objectieflens gevoelig is voor verschuiving als gevolg van de ongewenste krimp van tandcement tijdens de baseplating-procedure. Tijdens baseplating moet de optimale werkafstand tussen de geïmplanteerde relaislens en de objectieflens worden gevonden door de afstand tussen de miniscoop en de bovenkant van de relaislens aan te passen, en de bodemplaat moet vervolgens op deze ideale locatie worden gelijmd. Nadat de juiste afstand tussen de objectieflens en de geïmplanteerde relaislens is ingesteld, kunnen longitudinale metingen worden verkregen met cellulaire resolutie (Figuur 1B; in vivo opname). Omdat het optimale bereik van werkafstanden van een relaislens klein is (50 – 350 μm)^4,8kan overmatige cementkrimp tijdens het uitharden het moeilijk maken om de objectieflens en de geïmplanteerde relaislens binnen het juiste bereik te houden. Het algemene doel van dit rapport is om een protocol te bieden om de krimpproblemen te verminderen^8,17 die optreden tijdens de baseplating-procedure en om het slagingspercentage van miniscoopregistraties van fluorescentiesignalen in een configuratie met twee lenzen te verhogen. Succesvolle miniscoopopname wordt gedefinieerd als opname van een livestream van merkbare relatieve veranderingen in de fluorescentie van individuele neuronen in een vrij gedragend dier. Hoewel verschillende merken tandcement verschillende krimpsnelheden hebben, kunnen onderzoekers een merk selecteren dat eerder is getest^{6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22}. Niet elk merk is echter gemakkelijk te verkrijgen in sommige landen / regio’s vanwege de importvoorschriften voor medische materialen. Daarom hebben we methoden ontwikkeld om de krimpsnelheden van beschikbare tandheelkundige cementen te testen en, belangrijker nog, een alternatief protocol te bieden dat het krimpprobleem minimaliseert. Het voordeel ten opzichte van het huidige baseplating protocol is een toename van het slagingspercentage van calcium beeldvorming met gereedschappen en cement dat gemakkelijk kan worden verkregen in laboratoria. De UCLA-miniscoop wordt als voorbeeld gebruikt, maar het protocol is ook van toepassing op andere miniscopen. In dit rapport beschrijven we een geoptimaliseerde baseplating-procedure en bevelen we ook enkele strategieën aan voor het monteren van het UCLA-miniscoopsysteem met twee lenzen (Figuur 2A). Zowel voorbeelden van succesvolle implantatie (n = 3 muizen) als voorbeelden van mislukte implantatie (n = 2 muizen) voor de configuratie met twee lenzen met de UCLA-miniscoop worden samen met de discussies gepresenteerd om de redenen van de successen en mislukkingen.