Visualisatie en kwantificering van TGFβ/BMP/SMAD-signalering onder verschillende vloeistofafschuifstressomstandigheden met behulp van proximity-ligation-assay

Eiwitten van de transforming growth factors beta (TGFβ) superfamilie zijn pleiotrope cytokines met een verscheidenheid aan leden, waaronder TGFβs, botmorfogenetische eiwitten (BMP’s) en Activinen1,2. Ligandbinding induceert de vorming van receptor oligomeren die leiden tot de fosforylering en daarmee activering van cytosolische regulerende SMAD (R-SMAD). Afhankelijk van de subfamilie van liganden worden verschillende R-SMADs ^{geactiveerd1,2}. Terwijl TGFβs en Activins voornamelijk fosforylering van SMAD2/3 induceren, induceren BMP’s SMAD1/5/8 fosforylering. Er zijn echter steeds meer aanwijzingen dat BMP’s en TGFβs/Activinen ook R-SMADs van de respectieve andere subfamilie activeren, in een proces dat wordt aangeduid als ‘laterale signalering’3,4,5,6,7,8 en dat er gemengde SMAD-complexen zijn die bestaan uit zowel SMAD1/5 als SMAD2/3, ^leden3,9 . Twee geactiveerde R-SMADs vormen vervolgens trimerische complexen met de gemeenschappelijke mediator SMAD4. Deze transcriptiefactorcomplexen zijn vervolgens in staat om naar de kern te transloceren en de transcriptie van doelgenen te reguleren. SMADs kunnen interageren met een verscheidenheid aan verschillende transcriptionele co-activatoren en co-repressoren, wat leidt tot de diversificatie van de mogelijkheden om doelgenen te ^reguleren10. Deregulering van SMAD-signalering heeft ernstige gevolgen voor een verscheidenheid aan ziekten. In lijn hiermee kan onevenwichtige TGFβ / BMP-signalering leiden tot ernstige vasculaire pathologieën, zoals pulmonale arteriële hypertensie, erfelijke hemorragische teleangiëctasie of atherosclerose3,11,12,13,14.

Endotheelcellen (EC’s) vormen de binnenste laag van bloedvaten en worden daarom blootgesteld aan schuifspanning (SS), een wrijvingskracht die wordt uitgeoefend door de viskeuze bloedstroom. Interessant is dat EC’s die zich bevinden in de delen van de vasculatuur, die worden blootgesteld aan hoge niveaus van uniforme, laminaire SS, in een homeostatische en rustige toestand worden gehouden. Daarentegen zijn EC’s die lage, niet-uniforme SS ervaren, bijvoorbeeld bij bifurcaties of de kleinere kromming van de aortaboog, proliferatief en activeren ^{ontstekingsroutes15}. Op hun beurt zijn plaatsen van disfunctionele EC’s vatbaar voor het ontwikkelen van atherosclerose. Interessant is dat EC’s in deze atheroprone gebieden afwijkend hoge niveaus van geactiveerde SMAD2 / 3 en SMAD1 / ^{516, 17,18} vertonen. In deze context bleek verbeterde TGFβ/BMP-signalering een vroege gebeurtenis te zijn in de ontwikkeling van atherosclerotische ^laesies19 en interferentie met BMP-signalering bleek vasculaire ontsteking, atheromavorming en bijbehorende calcificatie aanzienlijk te ^{verminderen20}.

Proximity Ligation Assay (PLA) is een biochemische techniek om eiwit-eiwit interacties in ^situ21,22 te ^bestuderen. Het is gebaseerd op de specificiteit van antilichamen van verschillende soorten die doeleiwitten van belang kunnen binden, waardoor zeer specifieke detectie van endogene eiwitinteracties op eencellig niveau mogelijk is. Hier moeten primaire antilichamen zich binden aan hun doelepithop op een afstand van minder dan 40 nm om de detectie mogelijk te ^maken23. Daarom is PLA zeer gunstig ten opzichte van traditionele co-immunoprecipitatiebenaderingen, waarbij enkele miljoenen cellen nodig zijn om endogene eiwitinteracties te detecteren. In PLA binden soortspecifieke secundaire antilichamen, covalent gekoppeld aan DNA-fragmenten (plus- en minus-sondes genoemd), de primaire antilichamen en als de eiwitten van belang op elkaar inwerken, komen plus- en minus-sondes in de buurt. Het DNA wordt in de volgende stap geligeerd en de rollende cirkelversterking van het circulaire DNA wordt mogelijk gemaakt. Tijdens amplificatie binden fluorescerend gelabelde complementaire oligonucleotiden aan het gesynthetiseerde DNA, waardoor deze eiwitinteracties kunnen worden gevisualiseerd door conventionele fluorescentiemicroscopie.

Het hier beschreven protocol stelt wetenschappers in staat om het aantal actieve SMAD-transcriptiecomplexen bij atheroprotectieve en atheroprone SS-condities in vitro kwantitatief te vergelijken met behulp van PLA. RVS wordt gegenereerd via een programmeerbaar pneumatisch pompsysteem dat in staat is om laminaire unidirectionele stroom van gedefinieerde niveaus te genereren en stapsgewijze verhogingen van debieten mogelijk maakt. Deze methode maakt het mogelijk om interacties tussen SMAD1/5 of SMAD2/3 met SMAD4 te detecteren, evenals gemengde R-SMAD-complexen. Het kan eenvoudig worden uitgebreid om interacties van SMADs met transcriptionele co-regulatoren te analyseren of om transcriptiefactorcomplexen anders dan SMADs te analyseren. Figuur 1 toont de belangrijkste stappen van het protocol hieronder.

Figuur 1: Schematische weergave van het beschreven protocol. (A) Cellen gezaaid in 6-kanaals dia’s worden blootgesteld aan schuifspanning met een pneumatisch pompsysteem. (B) Vaste cellen worden gebruikt voor PLA-experimenten of voor controleomstandigheden. (C) Beelden van PLA-experimenten worden verkregen met een fluorescentiemicroscoop en worden geanalyseerd met behulp van ImageJ-analysesoftware. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.