この記事では、アルカリホスファターゼ結合ScFv D11抗体を使用した免疫蛍光法による組織内のイソレブグランジンの測定のための詳細な方法論を提供します。マウスとヒトの両方の高血圧モデルは、組織サンプル中のイソレブグランジン測定に関連する段階的な手順と基本原理を説明するために使用されます。
イソレブグランジン(IsoLG)は、H2-イソプロスタンから脂質過酸化および架橋タンパク質を介して形成される反応性の高いガンマケトアルデヒドであり、炎症や高血圧を含むさまざまな疾患を引き起こします。組織におけるIsoLG蓄積の検出は、疾患プロセスへのIsoLGの関与を明らかにする上で非常に重要です。しかし、組織中のIsoLGsの測定は非常に困難であり、質量分析を含む現在利用可能なツールは手間がかかり、非常に高価です。ここでは、アルカリホスファターゼ結合D11 ScFvと大腸菌で産生された組換えファージディスプレイ抗体を免疫蛍光顕微鏡法により、組織中のIsoLGをin situ検出する新しい方法について説明します。染色の検証には、(1)D11の有無にかかわらず染色、(2)アルカリホスファターゼリンカーによる細菌ペリプラズム抽出物による染色、(3)無関係なscFV抗体染色、および(4)染色前のIsoLGによる競合対照の4つの対照が使用されました。アルカリホスファターゼ結合D11の有効性を、高血圧の有無にかかわらずヒトとマウスの両方の組織で実証します。この方法は、さまざまな疾患プロセスにおけるIsoLGの役割を研究するための重要なツールとして役立つ可能性があります。
イソケタールとしても知られるイソレブグランジン(IsoLG)は、脂質過酸化の産物である4-ケトアルデヒドファミリーの異性体であり、タンパク質1,2上の第一級アミンと反応して付加します。IsoLGは、心血管疾患、アルツハイマー病、肺疾患、肝臓疾患、および多くの種類の癌を含むいくつかの疾患に関与しています3。IsoLGsは、米国を含む世界的に大きな健康的および経済的負担である心血管疾患(CVD)への寄与において最も広く研究されてきました。9,210万人の米国の成人が少なくとも1種類のCVDを患っていると推定されており、2030年の推定予測は米国の成人人口の43.9%に達します4。血圧、コレステロール、禁煙を下げると、CVDイベントの全体的なリスクと発生が減少します5。
高血圧または高血圧は心血管疾患の主要な危険因子であり、米国の人口の約半数に影響を及ぼします6。以前の研究では、炎症が高血圧の根本的な原因であり、IsoLGが役割を果たすことがわかっています7。アンジオテンシンII、カテコールアミン、アルドステロン、および過剰な食事塩を含む高血圧刺激は、樹状細胞(DC)を含む抗原提示細胞にIsoLG蓄積を誘導し、次にT細胞を活性化して増殖し、高血圧に寄与する炎症性サイトカインを産生します8,9。
これまで、IsoLGsは、免疫組織化学、質量分析、酵素結合免疫吸着アッセイ、およびフローサイトメトリーによって測定されてきました10,11。IsoLGsの測定を容易にするために、IsoLGs12に対する一本鎖フラグメント可変(scfv)組換え抗体(D11)が開発された。当初、このD11抗体は11個のアミノ酸Eタグを含み、免疫組織化学検出のために二次抗体を必要とした11。しかしながら、製造業者による製造中止後にEタグに対する信頼できる二次抗体を見つけることは困難であった。そこで、アルカリホスファターゼ(D11-AP)と結合したD11を用いたIsoLGの免疫蛍光染色のための信頼性の高いプロトコルを開発し、高血圧の有無にかかわらずマウスおよびヒト組織で実証しました。
D11は、疾患8,9,20における炎症または酸化ストレスのマーカーとして、細胞または組織中のIsoLG付加タンパク質を検出するために広く使用されています。以前は、D11にはEタグが含まれており、IHCの開発にはHRP10、20、21と結合した二次抗Eタグ抗体を使用する必要がありました。ここでは、Eタグの代わりにアルカリホスファターゼを結合させたD11抗体を使用して、IsoLG付加タンパク質を検出するためのプロトコルを開発および最適化しました。
D11-APの特異性を決定するために、4回の陰性対照実験を行った。D11なしでプロトコルを実行し、最小限の開発しかありませんでした。これらの結果は、内因性アルカリホスファターゼが発生に寄与していないこと、観察された染色がD11によるものであり、他の寄与因子ではないという2つの兆候があります。次に、D11を含まないAPリンカーでスライドを染色した。この実験では染色がほとんどなく、ペリプラズム抽出物中の遊離APまたは他の因子がD11の存在下で観察される染色を引き起こさないことを示しています。D11のIsoLGに対する特異性を確保するために、スライドを染色する前に、精製されたIsoLGでD11-APをプレインキュベートしました。D11-APがIsoLGタンパク質に結合し、組織中に存在するIsoLGに結合する遊離D11-APの量を使い果たしたことを示す発達の減少が見られました。最後に、D11-APがIsoLGに結合し、IsoLGが結合していたMSAタンパク質ではないことを確認するために、D11-APをMSAのみでプレインキュベートしました。発生に変化はなく、D11-APがMSAではなくIsoLGタンパク質に結合していたことを示しています。最後に、染色プロトコルを開発した研究者は、ヒト腸組織の高血圧状態を知らなかった。高血圧患者と正常血圧患者の間で観察された染色の違いはバイアスによるものではなく、以前に説明されています22,23。
Eタグの代わりにアルカリホスファターゼを結合させたD11抗体を用いたIsoLG付加タンパク質の検出プロトコルは厳密かつ堅牢であり、二次抗体のインキュベーションは不要ですが、いくつかの制限があります。1つの制限は、ペリプラズム抽出物にアルカリホスファターゼと結合したD11を使用したことであり、ペリプラズム抽出物または腸24などの特定の組織に内因性アルカリホスファターゼの誤った染色が存在する可能性があります。しかしながら、このプロトコルを開発するための最初のステップは、組織25中に存在し得る内因性アルカリホスファターゼを無効にすることを含んでいた。最初に、冷酢酸、BME、およびレバミゾール26 の効率がテストされました。これらのいずれも、活性内因性アルカリホスファターゼの存在を完全に減少させませんでした。アルカリホスファターゼ27の失活に熱が用いられているため、アルカリホスファターゼの熱失活を異なるバッファーで試験しました。クエン酸緩衝液中でスライドを加熱マウントして水和すると、ほとんどの内因性アルカリホスファターゼが除去されることがわかりました。スライドは当初、化学発光/蛍光基質を使用して開発されましたが、この基質なしで画像化すると、大量の自家蛍光がありました。VectorRedは、アルカリホスファターゼの存在下で発達し、テキサスレッド/TRITCチャネル範囲で視覚化できる色原体を生成する基質です。この基質を用いて、バックグラウンド自家蛍光以上のシグナルをより簡便に観察することができました。染色プロセス中は、人工物の染色を最小限に抑えるように注意する必要があります。水和後のスライド上の組織の乾燥は、イメージングが促進された発達をもたらしました。D11-APは分注し、-20°Cで保存する必要があります。 D11-APを使用する場合は、複数の凍結融解サイクルを避ける必要があります。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)もアルカリホスファターゼの酵素活性に影響を与える可能性があるため、洗浄緩衝液として使用すべきではない28。他の抗体ベースのアプローチと同様に、染色が特異的であり、シグナルが過剰または過少に増幅されていないことを確認するために、徹底的なテストと最適化を実行する必要があります。
結論として、Eタグの代わりにアルカリホスファターゼを結合させたD11抗体を使用して、IsoLG付加タンパク質を検出するための強力で厳密で堅牢な最適化されたプロトコルを開発しました。このプロトコルにはいくつかの利点があります:まず、D11をアルカリホスファターゼ融合タンパク質として使用する方が安価です。D11はもともとファージ抗体ライブラリーに由来していたが、これは商業化できず、精製に費用がかかるものであった。 大腸菌 ペリプラズム抽出物中のD11は安価な代替品を提供することができたが、ほとんどのアッセイでは効果がなかった。第二に、アルカリホスファターゼ融合アプローチは、D11 scfvがそれに融合した有用なレポーター15 (アルカリホスファターゼ)を有することを可能にし、基質が市販されているので、イムノアッセイで使用するために精製する必要がないであろう。第三に、 大腸菌 アルカリホスファターゼは二量体29を形成する。したがって、D11は、アルカリホスファターゼに融合すると二量体も形成し、これにより抗体の結合活性および結合活性が増加する30。最後に、ペリプラズム抽出物中のアルカリホスファターゼと結合したD11は、シバクロンブルーセファロースを使用して簡単に洗浄できます。D11は高い等電点(~9.2pH)を有する。そのため、正に帯電しており、パイカチオン相互作用を介してシバクロンブルーに結合することができます。 大腸菌 ペリプラズム抽出物中の不純物のほとんどは、樹脂から溶出することができます。アルカリホスファターゼと結合したD11は、水中の高塩(~1.5M NaCl)を使用して溶出できます。アルカリホスファターゼと結合した溶出D11は、高塩溶液中で4〜8°Cで非常に安定です。したがって、D11抗体を低コストで入手できるだけでなく、二次抗体のインキュベーションの余分なステップと必要性を排除するプロトコルを開発しました。このプロトコルは、酸化ストレスの増加が役割を果たす複数の疾患の組織に蓄積するIsoLGの再現性のある測定を容易にします。
The authors have nothing to disclose.
この研究は、国立衛生研究所の助成金K01HL130497、R01HL147818、R01HL144941、およびR03HL155041によってA.K.に支援されました。デジタル組織学共有リソース-テネシー州ヴァンダービルトヘルスナッシュビル https://www.vumc.org/dhsr/46298 視覚化とスライドスキャンに感謝します。
1 ml TALON HiTrap column (Cobalt-CMA) | Cytiva | 28953766 | |
200 Proof Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
2xYT powder | MP Biomedicals | 3012-032 | |
384-well, clear, flat-bottom polystyrene microplates | ThermoFisher (NUNC) | 242757 | |
4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate (pNPP) | Carbosynth | EN08508 | |
5-Bromo-4-chloro-3indoxyl phosphate, p-toluidine salt (BCIP) | Carbosynth | EB09335 | |
Ampicillin, sodium salt | Research Products International (RPI) | A40040 | |
Bovine Serum Albumin | RPI | A30075 | |
Chemically competent TG1 E. coli | Amid Biosciences | TG1-201 | |
Diethanolamine, >98% | Sigma-Aldrich | D8885 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | ED | |
Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Mouting medium |
Glucose | Research Products International (RPI) | G32045 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
Histoclear | National Diagnostics | HS-200 | Xylene alternative |
Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock solution = 10 mg/mL |
Hydrochloric acid (HCl), 30%, Macron Fine Chemicals | ThermoFisher | MK-2624-212 | |
Imidazole | Research Products International (RPI) | I52000 | |
MgCl2 (anhydrous) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Mouse Serum Albumin (MSA) | Sigma-Aldrich/Calbiochem | 126674 | |
Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Carbosynth | EN13587 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P4504 | |
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | |
Pressure Cooker | Cuisinart | CPC-600 | |
Slide-a-Lyzer Dialysis cassettes, 10K MWCO, 3 ml | ThermoFisher | 66380 | |
Sodium chloride (NaCl) | Research Products International (RPI) | S23020 | |
Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | 1064461000 | |
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) | Research Products International (RPI) | S23100 | |
Sucrose | Research Products International (RPI) | S24065 | |
Tris base | Research Products International (RPI) | T60040 | |
Tris-buffered Saline | Boston Bio-Products | 25mM Tris, 2.7mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7.4 | |
Tris-HCl | Research Products International (RPI) | T60050 | |
Tween20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Vector Red | Vector Labs | SK-5105 |