Pinças ópticas para estudar interações RNA-proteína no regulamento de tradução

A transferência de informações genéticas do DNA para as proteínas através dos mRNAs é um processo bioquímico complexo, que é precisamente regulado em todos os níveis através de interações macromoleculares dentro das células. Para a regulação translacional, as interações RNA-proteína conferem um papel crítico para reagir rapidamente a vários estímulos e ^sinais1,2. Algumas interações RNA-proteína afetam a estabilidade do mRNA e, assim, alteram o tempo em que um RNA é tratilicamente ativo. Outras interações RNA-proteína estão associadas a mecanismos de recodificação, como leitura stop-codon, bypass ou mudança de quadro ribossômico programada (PRF)3,4,5,6,7. Recentemente, uma série de proteínas de ligação de RNA (RBPs) foram demonstradas para interagir com elementos estimulantes de mRNA e a máquina de tradução para ditar quando e quanta reco codificação ocorrerá nas células7,8,9,10,11. Assim, dissecar o papel das proteínas vinculantes ao RNA na tradução e como elas modulam a estrutura e a estabilidade do RNA, é fundamental estudar os princípios de interação e propriedades mecânicas desses complexos de proteína RNA em detalhes.

Décadas de trabalho estabeleceram as bases para estudar o processo de tradução multi-passo e multicomponente, que conta com a comunicação intrincada entre o RNA e componentes proteicos da máquina de tradução para alcançar velocidade e precisão12,13,14. Um próximo passo crucial na compreensão de eventos regulatórios complexos é determinar as forças, escalas de tempo e determinantes estruturais durante a tradução em alta precisão12,15,16,17. O estudo da dinâmica conformacional do RNA e especialmente como fatores auxiliares trans-acionam na estrutura do RNA durante a tradução foram ainda mais iluminados pelo surgimento de ferramentas de molécula única, incluindo pinças ópticas ou guias de ondas de modo ^{zero16,17,18,19,20,21,22,23,24 25,26}.

A pinça óptica (OT) representa uma técnica de molécula única altamente precisa, que tem sido aplicada para estudar muitos tipos de processos dinâmicos dependentes de RNA, incluindo transcrição, e tradução26,27,28,29,30,31,32. O uso de pinças ópticas permitiu a sondagem de interações moleculares, estruturas de ácido nucleico e propriedades termodinâmicas, cinéticas e energéticas desses processos em detalhes16,17,22,33,34,35,36,37,38,39 . O ensaio óptico da pinça é baseado na armadilha de objetos microscópicos com um raio laser focado. Em um experimento típico de OT, a molécula de interesse é amarrada entre duas contas transparentes (geralmente poliestireno) (Figura 1A)²⁷. Essas contas são então capturadas por armadilhas ópticas, que se comportam como molas. Assim, a força aplicada na molécula pode ser calculada com base no deslocamento da conta do centro do raio laser focal focado (centro da armadilha). Recentemente, pinças ópticas foram combinadas com microscopia confocal (Figura 1B), permitindo medidas de fluorescência ou transferência de energia de ressonância Förster (FRET)40,41,42. Isso abre um novo campo de possíveis experimentos permitindo medição simultânea e, portanto, correlação precisa de dados de espectroscopia de força e fluorescência.

Aqui, demonstramos experimentos usando as pinças ópticas combinadas com microscopia confocal para estudar interações proteína-RNA regulando a mudança de quadro translacional. Entre o objetivo e o condensador, uma célula de fluxo com cinco canais permite a aplicação contínua da amostra com fluxo laminar. Através dos canais microfluidos, vários componentes podem ser injetados diretamente, o que diminui o tempo prático, além de permitir muito pouco consumo amostral ao longo do experimento.

Em primeiro lugar, uma diretriz básica para auxiliar o desenho de experimentos OT é proposta e vantagens, bem como armadilhas de várias configurações são discutidas. Em seguida, são descritas amostras e fluxos de trabalho experimentais e um protocolo para a análise dos dados. Para representar um exemplo, descrevemos os resultados obtidos a partir de experimentos de alongamento de RNA para estudar o elemento RNA de mudança de quadro SARS-CoV-2 (Figura 2A) com o fator trans-ação o isoforme curto da proteína antiviral de dedo de zinco (ZAP), que altera a tradução do RNA viral de um quadro de leitura ^{alternativo43}. Além disso, demonstra-se que ribossósicos rotulados por fluorescência podem ser empregados neste ensaio confocal OT, o que seria útil para monitorar a processividade e a velocidade da máquina de tradução. O método aqui apresentado pode ser usado para testar rapidamente o efeito de diferentes buffers, ligantes ou outros componentes celulares para estudar vários aspectos da tradução. Finalmente, são discutidas armadilhas experimentais comuns e como solucioná-las. Abaixo, alguns pontos cruciais no design experimental são delineados.

Projeto de construção
Em princípio, existem duas abordagens comuns para criar um RNA compatível com OT. A primeira abordagem emprega uma molécula de RNA longa que é hibridizada com alças de DNA complementares, produzindo assim um construto composto por duas regiões híbridas de RNA/DNA flanqueando uma sequência de RNA de uma única linha no meio (Figura 2B). Essa abordagem é empregada na maioria dos experimentos de RNA OT33,44,45.

A segunda abordagem aproveita as alças dsDNA com saliências curtas (em torno de 20 nt) ^15,17. Essas saliências são então hibridizadas com a molécula de RNA. Embora mais complicado no design, o uso de alças dsDNA supera algumas das limitações do sistema DNA/RNA-híbrido. Em princípio, mesmo alças muito longas (>10kb) podem ser implementadas, o que é mais conveniente para medições confocal. Além disso, a molécula de RNA pode ser ligada às alças de DNA para aumentar a estabilidade das amarras.

Estratégia de rotulagem final
A construção deve ser amarrada a contas através de uma forte interação molecular. Embora existam abordagens disponíveis para a ligação covalente de alças a ^contas46, interações fortes, mas não covalentes, como streptavidin-biotina e digoxigenina-anticorpo são comumente usadas em experimentos OT15,33,35,45. No protocolo descrito, a construção é rotulada com biotina ou digoxigenina, e as contas são revestidas com streptavidina ou anticorpos contra digoxigenina, respectivamente (Figura 1A). Esta abordagem seria adequada para a aplicação de forças de até aproximadamente 60 pN (por tether)⁴⁷. Além disso, o uso de diferentes estratégias de rotulagem de 5′ e 3′ permitem determinar a orientação da corda formada entre as ^contas17.

Rotulagem de proteínas para medidas de fluorescência
Para a imagem confocal, existem várias abordagens comumente utilizadas para rotulagem de fluorescência. Por exemplo, fluoroforos podem ser covalentemente ligados a resíduos de aminoácidos que são encontrados nativamente em proteínas ou introduzidos por mutagênese direcionada ao local através de um grupo orgânico reativo. Corantes de tiol ou amina-reativa podem ser usados para rotulagem de resíduos de cisteína e liseina, respectivamente. Existem vários métodos de proteção reversíveis para aumentar a especificidade da ^{rotulagem48,49}, porém as proteínas nativas normalmente seriam rotuladas em múltiplos resíduos. Embora o pequeno tamanho do fluorohore possa conferir uma vantagem, a rotulagem não específica pode interferir na atividade proteica e, portanto, a intensidade do sinal pode ^variar49. Além disso, dependendo da intensidade do sinal de eficiência de rotulagem pode diferir entre diferentes experimentos. Portanto, uma verificação de atividade deve ser realizada antes do experimento.

Caso a proteína de interesse contenha uma tag terminal N ou C, como uma tag His ou marca de estreptococos, a rotulagem específica dessas tags representa outra abordagem popular. Além disso, a rotulagem direcionada a tags reduz a chance do fluorohore interferir na atividade proteica e pode aumentar a ^{solubilidade49}. No entanto, a rotulagem específica de etiquetas geralmente produz proteínas rotuladas mono-fluorforo, o que pode ser desafiador de detectar. Outra forma de rotulagem específica pode ser realizada empregando anticorpos.

Configuração de microfluidos
A combinação de OT com um sistema de microfluidos permite uma transição rápida entre diferentes condições experimentais. Além disso, os sistemas atuais aproveitam a manutenção do fluxo laminar dentro da célula de fluxo, o que impede a mistura de líquidos de outros canais na direção perpendicular em relação à direção de fluxo. Portanto, o fluxo laminar é particularmente vantajoso para o design experimental. Atualmente, células de fluxo com até 5 canais são comumente empregadas (Figura 3).