Optiske pinsett for å studere RNA-proteininteraksjoner i oversettelsesregulering

Overføring av genetisk informasjon fra DNA til proteiner gjennom mRNAer er en kompleks biokjemisk prosess, som er nøyaktig regulert på alle nivåer gjennom makromolekylære interaksjoner inne i celler. For translasjonsregulering gir RNA-proteininteraksjoner en kritisk rolle for raskt å reagere på ulike stimuli og ^signaler1,2. Noen RNA-proteininteraksjoner påvirker mRNA-stabiliteten og endrer dermed tiden en RNA er translasjonelt aktiv. Andre RNA-protein interaksjoner er forbundet med omkodingsmekanismer som stop-codon readthrough, bypassing eller programmert ribosomal frameshifting (PRF)3,4,5,6,7. Nylig har en rekke RNA-bindende proteiner (RBPer) vist seg å samhandle med stimulatoriske mRNA-elementer og oversettelsesmaskineriet for å diktere når og hvor mye omkoding som vil forekomme i cellen7,8,9,10,11. For å dissekere rollen som RNA-bindende proteiner i oversettelse og hvordan de modulerer RNA-struktur og stabilitet, er det derfor avgjørende å studere interaksjonsprinsippene og mekaniske egenskapene til disse RNA-proteinkompleksene i detalj.

Tiår med arbeid har lagt grunnlaget for å studere flertrinns- og flerkomponentprosessen for oversettelse, som er avhengig av intrikat kommunikasjon mellom RNA og proteinkomponentene i oversettelsesmaskineriet for å oppnå hastighet og nøyaktighet12,13,14. Et avgjørende neste skritt for å forstå komplekse regulatoriske hendelser er å bestemme krefter, tidsskalaer og strukturelle determinanter under oversettelse med høy presisjon12,15,16,17. Studien av RNA-konformasjonsdynamikk og spesielt hvordan transvirkende hjelpefaktorer virker på RNA-strukturen under oversettelse har blitt ytterligere opplyst av fremveksten av enkeltmolekylverktøy, inkludert optiske pinsett eller nullmodusbølgeledere16,17,18,19,20,21,22,23,24 ^,25,26.

Optisk pinsett (OT) representerer en svært presis enkeltmolekylteknikk, som har blitt brukt til å studere mange slags RNA-avhengige dynamiske prosesser, inkludert transkripsjon, og oversettelse26,27,28,29,30,31,32. Bruken av optiske pinsett har gjort det mulig å undersøke molekylære interaksjoner, nukleinsyrestrukturer og termodynamiske egenskaper, kinetikk og energi av disse prosessene i detalj16,17,22,33,34,35,36,37,38,39 . Optisk pinsettanalyse er basert på entrapment av mikroskopiske objekter med en fokusert laserstråle. I et typisk OT-eksperiment er interessemolekylet bundet mellom to gjennomsiktige (vanligvis polystyren) perler (figur 1A)²⁷. Disse perlene blir deretter fanget av optiske feller, som oppfører seg som fjærer. Dermed kan kraften som påføres molekylet beregnes basert på perlens forskyvning fra midten av den fokuserte laserstrålen (fellesenteret). Nylig har optisk pinsett blitt kombinert med konfektmikroskopi (figur 1B), noe som muliggjør fluorescens eller Förster resonansenergioverføring (FRET) målinger40,41,42. Dette åpner et helt nytt felt av mulige eksperimenter som tillater samtidig måling og derfor presis korrelasjon av kraftspektroskopi- og fluorescensdata.

Her demonstrerer vi eksperimenter ved hjelp av de optiske pinsettene kombinert med konfikal mikroskopi for å studere protein-RNA-interaksjoner som regulerer translasjonell frameshifting. Mellom målsettingen og kondensatoren muliggjør en strømningscelle med fem kanaler kontinuerlig prøveapplikasjon med laminær strømning. Gjennom mikrofluidiske kanaler kan ulike komponenter injiseres direkte, noe som reduserer den praktiske tiden, samt tillater svært lite prøveforbruk gjennom hele eksperimentet.

For det første foreslås en grunnleggende retningslinje for å bistå utformingen av OT-eksperimenter, og fordeler samt fallgruver i ulike oppsett diskuteres. Deretter beskrives utarbeidelsen av prøver og eksperimentelle arbeidsflyter, og en protokoll for dataanalysen er gitt. For å representere et eksempel skisserer vi resultatene fra RNA-strekkeksperimenter for å studere SARS-CoV-2 frameshifting RNA-elementet (figur 2A) med transvirkende faktor den korte isoformen av sinkfinger antiviralt protein (ZAP), som endrer oversettelsen av viral RNA fra en alternativ ^leseramme43. I tillegg er det demonstrert at fluorescensmerkede ribosomer kan brukes i denne OT-konfiskeringsanalysen, noe som vil være nyttig for å overvåke prosessiviteten og hastigheten til oversettelsesmaskineriet. Metoden som presenteres her, kan brukes til raskt å teste effekten av forskjellige buffere, ligander eller andre cellulære komponenter for å studere ulike aspekter ved oversettelse. Til slutt diskuteres vanlige eksperimentelle fallgruver og hvordan du feilsøker dem. Nedenfor er noen viktige punkter i eksperimentell design skissert.

Konstruere design
I prinsippet er det to vanlige tilnærminger for å skape en OT-kompatibel RNA-konstruksjon. Den første tilnærmingen bruker et langt RNA-molekyl som er hybridisert med komplementære DNA-håndtak, og gir dermed en konstruksjon som består av to RNA / DNA-hybridregioner som flankerer en enkeltstrenget RNA-sekvens i midten (figur 2B). Denne tilnærmingen brukes i de fleste OT RNA-eksperimenter33,44,45.

Den andre tilnærmingen utnytter dsDNA-håndtak med korte (rundt 20 nt) ^{overheng15,17}. Disse overhengene blir deretter hybridisert med RNA-molekylet. Selv om det er mer komplisert i design, overvinner bruken av dsDNA-håndtak noen av begrensningene i DNA / RNA-hybridsystemet. I prinsippet kan selv svært lange håndtak (>10kb) implementeres, noe som er mer praktisk for konfiskeringer. I tillegg kan RNA-molekylet ligateres til DNA-håndtak for å øke tetherstabiliteten.

Strategi for sluttmerking
Konstruksjonen må knyttes til perler via en sterk molekylær interaksjon. Mens det er tilnærminger tilgjengelig for kovalent binding av håndtak til ^perler46, brukes sterke, men ikke-kovalente interaksjoner som streptavidin-biotin og digoxigenin-antistoff ofte i OT-eksperimenter15,33,35,45. I den beskrevne protokollen er konstruksjonen merket med biotin eller digoksigenin, og perlene er belagt med streptavidin eller antistoffer mot henholdsvis digoxigenin (figur 1A). Denne tilnærmingen vil være egnet for påføring av krefter opp til ca. 60 pN (per tether)⁴⁷. Videre tillater bruken av forskjellige 5′ og 3 ‘ merkingsstrategier å bestemme orienteringen av tether dannet mellom ^perlene17.

Proteinmerking for fluorescensmålinger
For den kondokale avbildningen er det flere ofte brukte tilnærminger for fluorescensmerking. For eksempel kan fluoroforer festes kovalent til aminosyrerester som finnes innfødt i proteiner eller introdusert av stedsstyrt mutagenese gjennom en reaktiv organisk gruppe. Tiol- eller aminreaktive fargestoffer kan brukes til merking av henholdsvis cystein- og lysinrester. Det finnes flere reversible beskyttelsesmetoder for å øke spesifisiteten til ^{merkingen av48,49}, men innfødte proteiner vil vanligvis bli merket ved flere rester. Selv om den lille størrelsen på fluoroforen kan gi en fordel, kan ikke-spesifikk merking forstyrre proteinaktiviteten og dermed kan signalintensiteten ^variere49. Avhengig av etiketteffektivitetssignalintensiteten kan det også variere mellom forskjellige eksperimenter. Derfor bør en aktivitetskontroll utføres før eksperimentet.

I tilfelle proteinet av interesse inneholder en N- eller C-terminal tag, for eksempel en His-tag eller strep-tag, representerer spesifikk merking av disse taggene en annen populær tilnærming. Videre reduserer tag-målrettet merking sjansen for at fluoroforen forstyrrer proteinaktiviteten og kan forbedre ^{løseligheten49}. Tag-spesifikk merking gir imidlertid vanligvis mono-fluoroformerkede proteiner, noe som kan være utfordrende å oppdage. En annen måte å spesifikk merking kan oppnås ved å bruke antistoffer.

Oppsett av mikrofluidikk
Kombinasjonen av OT med et mikrofluidikksystem muliggjør en rask overgang mellom ulike eksperimentelle forhold. Videre utnytter nåværende systemer å opprettholde laminærstrømmen inne i strømningscellen, noe som utelukker blanding av væsker fra andre kanaler i vinkelrett retning i forhold til strømningsretningen. Derfor er laminær strømning spesielt fordelaktig for eksperimentell design. For tiden brukes flytceller med opptil 5 kanaler ofte (figur 3).