النمذجة السكتة الدماغية في الفئران: انسداد الشريان الدماغي الأوسط عابرة عن طريق الشريان السباتي الخارجي
Summary
تستخدم نماذج مختلفة من انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCAo) في أبحاث السكتة الدماغية التجريبية. هنا ، يتم وصف نموذج السكتة الدماغية التجريبية من MCAo عابرة عبر الشريان السباتي الخارجي (ECA) ، والذي يهدف إلى تقليد السكتة الدماغية البشرية ، والتي تتم إزالة خثرة الأوعية الدماغية بسبب تحلل الجلطة العفوية أو العلاج.
Abstract
السكتة الدماغية هي السبب الثالث الأكثر شيوعا للوفيات والسبب الرئيسي للإعاقة المكتسبة للبالغين في البلدان المتقدمة. حتى الآن، تقتصر الخيارات العلاجية على نسبة صغيرة من مرضى السكتة الدماغية في غضون الساعات الأولى بعد السكتة الدماغية. ويجري التحقيق على نطاق واسع في استراتيجيات علاجية جديدة، ولا سيما لإطالة فترة الوقت العلاجي. وتشمل هذه التحقيقات الحالية دراسة المسارات المرضية الهامة بعد السكتة الدماغية، مثل التهاب ما بعد السكتة الدماغية، وتولد الأوعية، واللدونة العصبية، والتجدد. 10 – على مدى العقد الماضي، تزايد القلق إزاء ضعف إمكانية استنساخ النتائج التجريبية والنتائج العلمية بين أفرقة البحث المستقلة. وللتغلب على ما يسمى “أزمة التكرار”، هناك حاجة ماسة إلى نماذج موحدة مفصلة لجميع الإجراءات. كجهد داخل اتحاد أبحاث “ضربة المناعة” (https://immunostroke.de/) ، يقترح نموذج فأر موحد لانسداد الشريان الدماغي الأوسط العابر (MCAo). يسمح هذا النموذج بالاستعادة الكاملة لتدفق الدم عند إزالة خيوط الدم ، ومحاكاة تحلل الجلطة العلاجية أو العفوية التي تحدث في نسبة كبيرة من السكتات الدماغية البشرية. يتم عرض الإجراء الجراحي لهذا النموذج السكتة الدماغية “خيوط” وأدوات لتحليلها الوظيفي في الفيديو المصاحب.
Introduction
السكتة الدماغية هي واحدة من الأسباب الأكثر شيوعا للوفاة والعجز في جميع أنحاء العالم. على الرغم من أن هناك أساسا شكلين متميزين من السكتة الدماغية, نقص التروية والنزفية, 80-85٪ من جميع حالات السكتة الدماغية هي1الإقفارية . حاليا، يتوفر علاجان فقط للمرضى الذين يعانون من السكتة الدماغية: العلاج الدوائي باستخدام منشط بلازمينوجين الأنسجة المؤتلفة (rtPA) أو استئصال الجلطات الميكانيكية. ومع ذلك ، نظرا لتضييق الإطار الزمني العلاجي ومعايير الاستبعاد المتعددة ، يمكن لعدد مختار فقط من المرضى الاستفادة من خيارات العلاج المحددة هذه. على مدى العقدين الماضيين، ركزت أبحاث السكتة الدماغية قبل السريرية والترجمة على دراسة النهج العصبية. ومع ذلك، فإن جميع المركبات التي وصلت إلى التجارب السريرية أظهرت حتى الآن أي تحسينات للمريض2.
وبما أن النماذج المختبرية لا يمكنها إعادة إنتاج جميع تفاعلات الدماغ والآليات المرضية الفسيولوجية للسكتة الدماغية بدقة، فإن النماذج الحيوانية حاسمة لأبحاث السكتة الدماغية قبل السريرية. ومع ذلك ، فإن محاكاة جميع جوانب السكتة الدماغية البشرية في نموذج حيواني واحد غير ممكن ، حيث أن السكتة الدماغية مرض معقد للغاية وغير متجانس. لهذا السبب، تم تطوير نماذج مختلفة من السكتة الدماغية مع مرور الوقت في أنواع مختلفة. فوتوثيرومبوسيس من الشرايين الدماغية أو انسداد دائم من الشريان الدماغي الأوسط (MCA) هي نماذج شائعة الاستخدام التي تحفز الآفات الصغيرة والمحددة محليا في القشرة الجديدة3،4. وإلى جانب ذلك، فإن نموذج السكتة الدماغية الأكثر استخداما هو على الأرجح ما يسمى “نموذج خيوط”، حيث يتم تحقيق انسداد عابر من MCA. هذا النموذج يتكون من إدخال عابرة خيوط خياطة إلى أصل MCA, مما أدى إلى انخفاض مفاجئ في تدفق الدم الدماغي وانحشاء كبير لاحق من مناطق الدماغ تحت القشرية والقشرية5. على الرغم من أن معظم نماذج السكتة الدماغية تحاكي انسدادات MCA 6، فإن “نموذج خيوط” يسمح بتحديد دقيق للوقت الإقفاري. Reperfusion عن طريق إزالة خيوط يحاكي السيناريو السريري البشري لاستعادة تدفق الدم الدماغي بعد عفوية أو علاجية (rtPA أو استئصال الجلطات الميكانيكية) تحلل الجلطة. وحتى الآن، تم وصف تعديلات مختلفة لهذا “النموذج خيوط”. في النهج الأكثر شيوعا، وصفت لأول مرة من قبل Longa وآخرون. في عام 19895، يتم إدخال خيوط مغلفة بالسيليكون عبر الشريان السباتي الشائع (CCA) إلى أصل MCA7. على الرغم من أنه نهج يستخدم على نطاق واسع ، إلا أن هذا النموذج لا يسمح بالاستعادة الكاملة لتدفق الدم أثناء التروية ، حيث يتم ربط CCA بشكل دائم بعد إزالة خيوط.
على مدى العقد الماضي، كان عدد متزايد من مجموعات البحث مهتمة بنمذجة السكتة الدماغية في الفئران باستخدام هذا “نموذج خيوط”. ومع ذلك ، فإن التباين الكبير في هذا النموذج وعدم توحيد الإجراءات هي بعض أسباب التباين العالي وضعف استنساخ النتائج التجريبية والنتائج العلمية المبلغ عنها حتى الآن2،8. السبب المحتمل ل “أزمة النسخ المتماثل” الحالية ، في إشارة إلى انخفاض القابلية للاستنساخ بين مختبرات الأبحاث ، هو أحجام احتشاء السكتة الدماغية غير القابلة للمقارنة بين مجموعات البحث باستخدام نفس المنهجية التجريبية9. في الواقع، بعد إجراء أول دراسة تجريبية متعددة المراكز معشاة قبل السريرية10،تمكنا من تأكيد أن عدم وجود توحيد كاف لنموذج السكتة الدماغية التجريبي هذا ومعلمات النتائج اللاحقة كانت الأسباب الرئيسية لفشل الاستنساخ في الدراسات قبل السريرية بين المختبرات المستقلة11 . هذه الاختلافات الجذرية في أحجام العجش الناتجة ، على الرغم من استخدام نفس نموذج السكتة الدماغية ، تشكل بشكل مبرر ليس فقط تهديدا للبحث التأكيدي ، ولكن أيضا للتعاون العلمي بسبب عدم وجود نماذج قوية وقابلة للاستنساخ.
وفي ضوء هذه التحديات، فنحن نهدف إلى وضع ووصف مفصل للإجراءات المتعلقة بنموذج موحد عابر للماكاو على النحو المستخدم في جهود البحث التعاونية داخل اتحاد البحوث “مناعة” (https://immunostroke.de/). يهدف هذا الاتحاد إلى فهم التفاعلات بين الدماغ والمناعة الكامنة وراء المبادئ الميكانيكية لاستعادة السكتة الدماغية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم الأساليب النسيجية والوظيفية ذات الصلة لتحليل نتائج السكتة الدماغية. وتستند جميع الأساليب على إجراءات التشغيل القياسية المعمول بها المستخدمة في جميع مختبرات البحوث التابعة لاتحاد ضربة المناعة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول نموذجا تجريبيا للسكتة الدماغية يستند إلى اتفاق توافقي بين اتحاد أبحاث ألماني متعدد المراكز (“ImmunoStroke”) لإنشاء نموذج موحد عابر ل MCAo. نموذج MCAo عابرة التي أنشئت من خلال إدخال خيوط مغلفة السيليكون من خلال اللجنة الاقتصادية لأفريقيا إلى أصل MCA هي واحدة من نماذج السكتة الدماغية…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر جميع شركائنا في التعاون في اتحادات ضربة المناعة (FOR 2879 ، من الخلايا المناعية إلى استرداد السكتة الدماغية) على الاقتراحات والمناقشات. تم تمويل هذا العمل من قبل دويتشه Forschungsgemeinschaft (DFG، مؤسسة البحوث الألمانية) في إطار استراتيجية التميز الألمانية في إطار مجموعة ميونيخ لطب الأعصاب النظم (EXC 2145 SyNergy – الهوية 390857198) وبموجب المنح LI-2534/6-1، LI-2534/7-1 و LL-112/1-1.
Materials
| 45° ramp | H&S Kunststofftechnik | height: 18 cm | |
| 5/0 threat | Pearsalls | 10C103000 | |
| 5 mL Syringe | Braun | ||
| Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
| Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
| Bepanthen pomade | Bayer | ||
| C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
| Clamp | FST | 12500-12 | |
| Clip | FST | 18055-04 | |
| Clip holder | FST | 18057-14 | |
| Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
| Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
| Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
| Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
| Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
| Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
| Filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Fine 45 angled forceps | FST | 11251-35 | |
| Fine forceps | FST | 11252-23 | |
| Fine Scissors | FST | 14094-11 | |
| Glue | Orechseln | BSI-112 | |
| Hardener Glue | Drechseln & Mehr | BSI-151 | |
| Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | ||
| Isoflurane | Abbot | B506 | |
| Isopentane | Fluka | 59070 | |
| Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
| Laser Doppler | Perimed | PF 5010 LDPM, Periflux System 5000 | |
| Laser Doppler probe | Perimed | 91-00123 | |
| Phosphate Buffered Saline pH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
| Recovery chamber | Mediheat | ||
| Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
| Saline solution | Braun | 131321 | |
| Scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
| Silicon-coated filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Stereomicropscope | Leica | M80 | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Vannas Spring Scissors | FST | 15000-00 | |
| Xylacine | Albrecht |
References
- Donnan, G. A., Fisher, M., Macleod, M., Davis, S. M. Stroke. Lancet. 371 (9624), 1612-1623 (2008).
- O’Collins, V. E., et al. 1,026 experimental treatments in acute stroke. Annals of Neurology. 59 (3), 467-477 (2006).
- Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques. Journal of Neuroscience Methods. 139 (2), 203-207 (2004).
- Zhang, Z., et al. A new rat model of thrombotic focal cerebral ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 17 (2), 123-135 (1997).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice – middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2423 (2011).
- Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
- McNutt, M. Journals unite for reproducibility. Science. 346 (6210), 679 (2014).
- Llovera, G., et al. Results of a preclinical randomized controlled multicenter trial (pRCT): Anti-CD49d treatment for acute brain ischemia. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Llovera, G., Liesz, A. The next step in translational research: lessons learned from the first preclinical randomized controlled trial. Journal of Neurochemistry. 139, 271-279 (2016).
- Swanson, G. M., Satariano, E. R., Satariano, W. A., Threatt, B. A. Racial differences in the early detection of breast cancer in metropolitan Detroit, 1978 to 1987. Cancer. 66 (6), 1297-1301 (1990).
- Lourbopoulos, A., et al. Inadequate food and water intake determine mortality following stroke in mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2084-2097 (2017).
- Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse. Neurological Research. 19 (6), 641-648 (1997).
- Jackman, K., Kunz, A., Iadecola, C. Modeling focal cerebral ischemia in vivo. Methods in Molecular Biology. 793, 195-209 (2011).
- Kitano, H., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Murphy, S. J. Inhalational anesthetics as neuroprotectants or chemical preconditioning agents in ischemic brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (6), 1108-1128 (2007).
- Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4038 (2012).
- Rha, J. H., Saver, J. L. The impact of recanalization on ischemic stroke outcome: a meta-analysis. Stroke. 38 (3), 967-973 (2007).
- Liu, J., et al. Transient filament occlusion of the middle cerebral artery in rats: does the reperfusion method matter 24 hours after perfusion. BMC Neuroscience. 13, 154 (2012).
- Sommer, C. J. Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 245-261 (2017).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. A rotarod suitable for quantitative measurements of motor incoordination in naive mice. Naunyn-Schmiedebergs Archiv für Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 259 (2), 211 (1968).
- Bouet, V., et al. The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice. Nature Protocols. 4 (10), 1560-1564 (2009).
- Zhang, L., et al. A test for detecting long-term sensorimotor dysfunction in the mouse after focal cerebral ischemia. Journal of Neuroscience Methods. 117 (2), 207-214 (2002).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39 (5), 777-787 (2000).
- Roth, S., Yang, J., Cramer, J., Malik, R., Liesz, A. Detection of cytokine-induced sickness behavior after ischemic stroke by an optimized behavioral assessment battery. Brain, Behavior, and Immunity. 91, 668-672 (2021).
