Gewinnung aktiv produzierter mikrobieller flüchtiger organischer Verbindungen aus humanassoziierten Proben mit vakuumgestützter Sorptionsmittelextraktion

Flüchtige organische Verbindungen (VOCs) sind vielversprechend für den bakteriellen Nachweis und die Identifizierung, da sie von allen Organismen emittiert werden und verschiedene Mikroben einzigartige VOC-Signaturen haben. Flüchtige Moleküle wurden als nicht-invasive Messung zum Nachweis verschiedener Atemwegsinfektionen verwendet, einschließlich chronisch obstruktiver Lungenerkrankung¹, Tuberkulose² im Urin³ und beatmungsassoziierter Pneumonie⁴, zusätzlich zur Unterscheidung von Probanden mit Mukoviszidose (CF) von gesunden Kontrollpersonen ^5,6. Flüchtige Signaturen wurden sogar verwendet, um spezifische Erregerinfektionen bei CF zu unterscheiden (Staphylococcus aureus ⁷, Pseudomonas aeruginosa ^8,9 und S. aureus vs. P. aeruginosa¹⁰). Angesichts der Komplexität solcher biologischer Proben ist es jedoch oft schwierig, die Quelle spezifischer VOCs zu lokalisieren.

Eine Strategie zur Entflechtung der flüchtigen Profile von mehreren infizierenden Mikroben besteht darin, eine Headspace-Analyse von Mikroorganismen sowohl in Mono- als auch in Co-Kultur^{durchzuführen 11}. Die Headspace-Analyse untersucht die Analyten, die in den “Headspace” über einer Probe emittiert werden, und nicht diejenigen, die in die Probe selbst eingebettet sind. Mikrobielle Metaboliten wurden oft in Monokulturen charakterisiert, da es schwierig ist, den Ursprung mikrobieller Metaboliten in komplexen klinischen Proben zu bestimmen. Durch die Profilierung flüchtiger Stoffe aus bakteriellen Monokulturen können die Arten von flüchtigen Stoffen, die eine Mikrobe in vitro produziert, eine Grundlage ihres flüchtigen Repertoires darstellen. Die Kombination von Bakterienkulturen, z. B. die Bildung von Co-Kulturen, und die Profilierung der produzierten flüchtigen Moleküle kann die Wechselwirkungen oder die gegenseitige Fütterung zwischen den Bakterien^{aufdecken 12}.

Eine weitere Strategie zur Identifizierung des mikrobiellen Ursprungs flüchtiger Moleküle besteht darin, eine Nährstoffquelle bereitzustellen, die mit einem stabilen Isotop markiert ist. Stabile Isotope sind natürlich vorkommende, nicht radioaktive Formen von Atomen mit einer unterschiedlichen Anzahl von Neutronen. In einer Strategie, die seit den frühen 1930er Jahren verwendet wird, um den aktiven Stoffwechsel bei Tieren¹³ zu verfolgen, ernährt sich der Mikroorganismus von der markierten Nährstoffquelle und integriert das stabile Isotop in seine Stoffwechselwege. In jüngerer Zeit wurde ein stabiles Isotop in Form von schwerem Wasser (_D2O) verwendet, um metabolisch aktiven S. aureus in einer klinischen CF-Sputumprobe¹⁴ zu identifizieren. In einem anderen Beispiel wurde ¹³C-markierte Glukose verwendet, um das Cross-Feed von Metaboliten zwischen CF-klinischen Isolaten von P. aeruginosa und Rothia mucilaginosa^{12 zu demonstrieren.}

Mit der Weiterentwicklung der Massenspektrometrietechniken haben sich die Methoden zum Nachweis flüchtiger Hinweise von qualitativen Beobachtungen zu quantitativeren Messungen entwickelt. Durch den Einsatz der Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) ist die Verarbeitung biologischer Proben für die meisten Labor- oder klinischen Umgebungen in Reichweite gekommen. Viele Methoden zur Untersuchung flüchtiger Moleküle wurden verwendet, um Proben wie Lebensmittel, Bakterienkulturen und andere biologische Proben sowie Luft und Wasser zum Nachweis von Kontaminationen zu profilieren. Einige gängige Methoden der flüchtigen Probenahme mit hohem Durchsatz erfordern jedoch Lösungsmittel und werden nicht mit den Vorteilen der Vakuumextraktion durchgeführt. Darüber hinaus sind für die Analyse 15,16,17,18,19 häufig größere Volumina oder Mengen (größer als 0,5 ml) an beprobten Materialien erforderlich^, obwohl dies substratspezifisch ist und eine Optimierung für jeden Probentyp und jede Methode erfordert.

Hier wurde die vakuumunterstützte Sorptionsmittelextraktion (VASE) mit anschließender thermischer Desorption auf einer GC-MS eingesetzt, um die flüchtigen Profile bakterieller Mono- und Co-Kulturen zu untersuchen und aktiv produzierte flüchtige Stoffe mit stabiler Isotopensondierung aus menschlichen Kot-, Speichel-, Abwasser- und Sputumproben zu identifizieren (Abbildung 1). Mit begrenzten Probenmengen wurden VOCs aus nur 15 μL Sputum extrahiert. Isotopenuntersuchungsexperimente mit menschlichen Proben erforderten die Zugabe einer stabilen Isotopenquelle wie ^13-C-Glukoseund Medien, um das Wachstum der mikrobiellen Gemeinschaft zu kultivieren. Die aktive Produktion von flüchtigen Stoffen wurde von GC-MS als schwereres Molekül identifiziert. Die Extraktion flüchtiger Moleküle unter statischem Vakuum ermöglichte den Nachweis flüchtiger Moleküle mit erhöhter Empfindlichkeit^20,21,22.