JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物化学

Высокопроизводительный анализ активности на основе ферментов для исследования взаимодействия малых молекул с дНТФазой SAMHD1

Published: April 16, 2021
doi:
10.3791/62503
,
1Science for Life Laboratory, Department of Oncology-Pathology,Karolinska Institutet

Summary

SAMHD1 представляет собой дезоксинуклеозидтрифосфаттрифосфогидролазу, играющую важнейшую роль в здоровье и болезнях человека. Здесь мы представляем универсальный анализ активности SAMHD1 на основе ферментов, развернутый в формате 384-луночного микропланшета, который позволяет оценивать малые молекулы и аналоги нуклеотидов в качестве субстратов, активаторов и ингибиторов SAMHD1.

Abstract

Стерильный альфа-мотив и HD-домен-содержащий белок 1 (SAMHD1) является ключевым регулятором внутриклеточных пулов дезоксинуклеозидтрифосфата (dNTP), поскольку этот фермент может гидролизовать dNTP в соответствующие им нуклеозиды и неорганические трифосфаты. Из-за его критической роли в метаболизме нуклеотидов, его связи с некоторыми патологиями и его роли в резистентности к терапии, в настоящее время проводятся интенсивные исследования для лучшего понимания как регуляции, так и клеточной функции этого фермента. По этой причине жизненно важна разработка простых и недорогих высокопроизводительных методов зондирования взаимодействия малых молекул с SAMHD1, таких как аллостерические регуляторы, субстраты или ингибиторы. С этой целью ферментно-связанный анализ малахитового зеленого представляет собой простой и надежный колориметрический анализ, который может быть развернут в формате планшета с 384 микролунками, что позволяет косвенно измерять активность SAMHD1. Поскольку SAMHD1 высвобождает трифосфатную группу из нуклеотидных субстратов, мы можем связать активность пирофосфатазы с этой реакцией, тем самым производя неорганический фосфат, который может быть количественно определен с помощью реагента малахитового зеленого путем образования зеленого комплекса фосфомолибдата малахита. В данной работе мы показываем применение этой методологии для характеристики известных ингибиторов SAMHD1 и расшифровки механизмов, участвующих в катализе SAMHD1 неканонических субстратов и регуляции аллостерическими активаторами, на примере противоопухолевых препаратов на основе нуклеозидов. Таким образом, ферментативно-связанный анализ малахитового зеленого является мощным инструментом для изучения SAMHD1 и, кроме того, может быть использован при изучении нескольких ферментов, которые высвобождают фосфатные формы.

Introduction

Стерильный альфа-мотив и гистидин-аспартат-содержащий домен-содержащий белок 1 (SAMHD1) является центральным регулятором нуклеотидного гомеостаза в клетках млекопитающих1 и играет множество ролей в здоровье и болезнях человека2. Этот фермент способен гидролизовать дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP) в родственные им молекулы дезоксинуклеозида и неорганического трифосфата 3,4, причем эта активность аллостерически регулируется (d)NTP распространенностью (рассмотрено в ссылке5). Каждый мономер SAMHD1 содержит два аллостерических сайта (AS1 и AS2) и один каталитический сайт, и образование активного фермента требует упорядоченной сборки гомотетрамера при связывании (d)NTP. Димеризация мономеров SAMHD1 сначала запускается путем связывания гуанинтрифосфата (ГТФ или дГТФ) с AS1, а последующая тетрамеризация достигается, когда дополнительная молекула dNTP связывается с AS2, обеспечивая доступ субстрата к каталитическому центру и последующий гидролиз.

Субстраты SAMHD1 включают четыре канонических dNTP 3,4 вместе с некоторыми нуклеотидами, модифицированными основаниями и сахаром, включая метаболиты трифосфатов нескольких препаратов на основе нуклеозидов, используемых при лечении вирусных инфекций и рака, некоторые из которых также могут служить аллостерическими активаторами 6,7,8,9,10,11. Следовательно, SAMHD1 модулирует эффективность многих из этих соединений в моделях заболеваний 7,8,9,10,11,12,13,14,15 и, кроме того, в случае аналога дезоксицитидина цитарабина (ara-C), который оставался стандартной терапией для лечения острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) в течение десятилетий, фактически диктует Эффективность лечения при этом заболевании 7,8,16. Таким образом, SAMHD1 является потенциальным биомаркером и терапевтической мишенью для повышения эффективности терапии на основе нуклеозидов17, и, соответственно, мы и наши коллеги стремились определить стратегии инактивации SAMHD1 в клетках. Мы предложили использовать вирусный белок X (Vpx) в качестве биологического ингибитора для нацеливания SAMHD1 на деградацию внутри раковых клеток7, однако этот подход имеет ряд ограничений (обсуждается в ссылке12), и мы также недавно сообщили о косвенном подходе к подавлению активности SAMHD1 путем ингибирования рибонуклеотидредуктазы, который мы продемонстрировали в различных моделях AML18. В ряде исследований были предприняты попытки идентифицировать малые молекулы, способные непосредственно ингибировать SAMHD1, и на сегодняшний день сообщалось о нескольких таких молекулах, однако ингибирование было зарегистрировано только in vitro 6,9,19,20,21,22. Как следствие, недостаток малых молекул, которые мощно ингибируют активность SAMHD1 в клетках, в сочетании со сложными механизмами катализа SAMHD1 терапевтических препаратов на основе нуклеозидов, подчеркивает необходимость дальнейших исследований. Таким образом, надежные и идеально высокопроизводительные методы зондирования взаимодействия малых молекул с SAMHD1 идеально подходят для идентификации субстратов, аллостерических регуляторов и ингибиторов этого клинически значимого фермента.

Существует несколько методологий, которые непосредственно измеряют активность дНТФазы SAMHD1, такие как тонкослойная хроматография (ТСХ)9,20,23 и высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)9,21, но они не всегда поддаются высокопроизводительным установкам. Одним из исключений является анализ, о котором сообщили Mauney et al., в котором используется способность SAMHD1 гидролизовать бис-бис (4-нитрофенил) фосфат (b4NPP) до-нитрофенола и-нитрофенилфосфата, когда Mn2+ используется в качестве активирующего катиона, что приводит к колориметрическому изменению, которое можно легко измерить в микролуночном планшете21. Этот анализ был успешно использован для идентификации и характеризации ингибиторов SAMHD1, но следует отметить, что гидролиз действительно происходит в отсутствие активаторов (d)NTP и в присутствии вероятного нефизиологического активирующего катиона, что является важными предостережениями, которые следует учитывать. Это также делает этот анализ менее применимым для изучения и идентификации аллостерических регуляторов SAMHD1.

В этом контексте подход, связанный с ферментами, в сочетании с малахитовым зеленым реагентом, как подробно описано в этом отчете, может быть универсальным методом для косвенного измерения активности дНТФазы SAMHD1 и, кроме того, изучения влияния на нее различных малых молекул. Анализ малахитового зеленого представляет собой надежный колориметрический метод обнаружения свободного неорганического фосфата (Pi), основанный на образовании комплекса молибдофосфорной кислоты, который приводит к колориметрическому изменению, измеренному при длине волны620 нм24. Поскольку гидролиз SAMHD1 высвобождает трифосфатную группу из нуклеотидных субстратов, необходимо связать эту реакцию с активностью (пиро)фосфатазы, которая приведет к образованию свободного неорганического фосфата, до добавления реагента малахитового зеленого. Анализ малахитового зеленого является чувствительным и экономически эффективным и широко используется для идентификации и характеризации ингибиторов и субстратов для ферментов, которые высвобождают неорганические фосфатные группы либо в своих реакциях, либо в присутствии связывающего фермента. Он был широко применен при характеристике АТФазной активности геликаз25,26,27 или при изучении ферментативной активности CD73, которая опосредует деградацию АМФ до аденозина и неорганического фосфата28. Кроме того, в сочетании он был использован при открытии антибиотиков, нацеленных на UDP-2,3-диацилглюкозаминпирофосфатазу LpxH, важный фермент большинства грамотрицательных патогенов29. Что касается исследований рака, то подход, связанный с ферментами, широко применяется против гидролаз NUDIX, семейства ферментов, метаболизирующих нуклеотиды, как при характеристике субстратов30, 31, 32, так и при идентификации и разработке лекарств и химических зондов33, 34, 35, 36.

Что касается dNTPase SAMHD1, то этот подход использовался в нескольких отчетах. Используя экзополифосфатазу Ppx1 из Saccharomyces cerevisiae в качестве связывающего фермента, этот анализ был использован для тестирования нескольких аналогов нуклеотидов в качестве субстратов, активаторов или ингибиторов SAMHD1 и привел к идентификации метаболита трифосфата противолейкозного препарата клофарабина в качестве активатора и субстрата6. Кроме того, с неорганической пирофосфатазой из Escherichia coli в качестве связывающего фермента, он был использован в скрининге библиотеки клинически одобренных соединений против SAMHD1 для идентификации ингибиторов20. В нашем исследовании мы использовали этот подход, чтобы показать, что ara-CTP, активный метаболит ara-C, является субстратом SAMHD1, но не аллостерическим активатором7 , и впоследствии использовали этот анализ, чтобы показать, что несколько небольших молекул, которые могут сенсибилизировать модели AML к ara-C SAMHD1-зависимым образом, на самом деле не ингибируют SAMHD118 напрямую. В этом отчете мы подробно расскажем об этом универсальном методе и продемонстрируем его применимость в высокопроизводительной податливой установке для идентификации ингибиторов, активаторов и субстратов SAMHD1.

Protocol

Схематический обзор приведенных ниже методов показан на рисунке 1 , а подробный список материалов и реагентов доступен в таблице материалов. 1. Приготовление пробирных буферов. Подготовка запасных буферов.ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку анализ чувствителен к обнаружению фосфатов, что может быть обычным явлением, промойте стеклянную посуду три раза сверхчистой или дважды дистиллированной водой, чтобы избежать загрязнения. Все буферы можно хранить при комнатной температуре (RT).Приготовьте 1 л исходного раствора реакционного буфера SAMHD1 (25 мМ трис-ацетата pH 8, 40 мМ NaCl, 1 мМ MgCl2), растворив 4,5 г трисацетата, 2,3 г NaCl и 0,2 г MgCl2 примерно в 800 мл воды, прежде чем довести pH 8 и окончательный объем. Приготовьте 5 мл 0,1 М исходного раствора TCEP, разбавив 1 мл 0,5 M TCEP в 4 мл воды. Приготовьте 50 мл 11% исходного раствора Tween-20, разбавив 5 мл 100% Tween-20 в 44,5 мл воды.ПРИМЕЧАНИЕ: Tween-20 чувствителен к свету. Приготовьте 50 мл 0,5 М стоп-раствора ЭДТА, растворив 9,3 г ЭДТА примерно в 40 мл воды, прежде чем довести до pH 8 и окончательного объема. Приготовьте исходный раствор малахитового зеленого (MG) (3,2 мМ малахитового зеленого вH2SO4), медленно добавляя 60 мл концентрированной серной кислоты к 300 мл воды в коричневой стеклянной бутылке. Остудите раствор до РТ и растворите 0,44 г малахитового зеленца.ОСТОРОЖНОСТЬ: Реакция серной кислоты с водой является экзотермической, поэтому бутылка может нагреваться, вызывая повышение давления; Следите за тем, чтобы это давление сбрасывалось часто.ПРИМЕЧАНИЕ: Полученный оранжевый раствор чувствителен к свету (отсюда и коричневая бутылка) и стабилен в течение не менее 1 года при RT. Осадок может образовываться со временем, убедитесь, что используется только надосадочная жидкость. Приготовьте 50 мл 7%-ного раствора молибдата аммония, растворив 3,75 г молибдата аммония в 50 мл воды.ПРИМЕЧАНИЕ: Со временем может образоваться осадок, убедитесь, что используется только надосадочная жидкость. Приготовление полных пробирных буферовПРИМЕЧАНИЕ: Это должно быть сделано в день экспериментаГотовят полный SAMHD1 RB (25 мМ трис-ацетата pH 8, 40 мМ NaCl, 1 мМ MgCl2, 0,3 мМ TCEP, 0,005% Tween-20). Используйте предварительно подготовленные 11% Tween-20 и 0,1 M подвоя TCEP для добавления этих компонентов в конечной концентрации 0,005% для Tween-20 и 0,3 мМ для TCEP в запас SAMHD1 RB. Приготовьте стоп-раствор ЭДТА (25 мМ трис-ацетата pH 8, 40 мМ NaCl, 1 мМ MgCl2, 0,3 мМ TCEP, 0,005% Tween-20, 7,9 мМ ЭДТА). Для завершения SAMHD1 RB используйте 0,5 М исходного раствора ЭДТА, чтобы добавить ЭДТА до конечной концентрации 7,9 мМ. Готовят рабочий раствор МГ (2,5 мМ малахитового зеленого, 1,4% молибдата аммония, 0,18% Твин-20), смешивая 10 частей исходного раствора МГ с 2,5 частями 7%-ного молибдата аммония и 0,2 частями 11%-ного твин-20. 2. Анализ ингибирования SAMHD1 и определение соединения IC50 ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательные условия анализа приведены в таблице 1. Приготовление соединений в пробирной пробиркеПРИМЕЧАНИЕ: Низкомолекулярные соединения обычно растворяются в 100% аналогах ДМСО и нуклеотидов в воде. Концентрация сырья колеблется от 10 до 100 мМ и зависит от эффективности и растворимости соединений, а также от переносимости анализа на ДМСО. Убедитесь, что конечная концентрация ДМСО в реакции не превышает 1%, чтобы убедиться, что этот растворитель не влияет на активность ферментов. Хорошей практикой является проверка устойчивости пробы к растворителю перед экспериментом.Готовят последовательно разбавленные испытуемые соединения в 100-кратной конечной концентрации в соответствующем растворителе (например, 100% ДМСО для малых молекул или воды для аналогов нуклеотидов) в прозрачной полипропиленовой 96-луночной планшете с круглым дном с помощью многоканальной пипетки или автоматизированного оборудования для работы с жидкостями.ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от стабильности соединения планшеты для разбавления могут быть подготовлены заранее, запечатаны и храниться при температуре -20 °C. Дайте пластинам уравновеситься до RT, прежде чем продолжать протокол. Используя полный SAMHD1 RB, разбавьте соединения до 25-кратной конечной концентрации (для поддержания конечной концентрации растворителя ниже 1%) и перенесите 5 мкл в соответствующие лунки прозрачной 384-луночной плоскодонной пробирной пластины. Повторите процедуру с контрольными образцами, содержащими только растворители. Приготовление компонентов реакцииПРИМЕЧАНИЕ: Это должно быть сделано в день проведения анализа. Аликвоты рекомбинантной человеческой SAMHD1 и E. coli пирофосфатазы (PPase) хранятся длительное время при -80 °C в разведении 9,1 мг/мл и 23,0 мг/мл соответственно в буфере для хранения (20 мМ HEPES pH 7,5, 300 мМ NaCl, 10% глицерина, 2 мМ TCEP). После размораживания аликвоты кратковременно хранятся при температуре -20 °C.Приготовьте основную смесь ферментов (SAMHD1/PPase) путем разбавления рекомбинантного белка SAMHD1 человека и рекомбинантной PPазы в полном SAMHD1 RB до желаемой конечной концентрации в 4 раза, т. е. 1,4 мкМ SAMHD1 и 50 U/мл PPase. Приготовьте dGTP активатора/субстрата путем разбавления dGTP (обычно 10 или 100 мМ в воде) в полной SAMHD1 RB до 2-кратной конечной концентрации, т.е. 50 мкМ dGTP. Проведение анализаПРИМЕЧАНИЕ: Все компоненты анализа должны быть уравновешены RT. Добавление жидкостей может выполняться как с помощью многоканальной пипетки, так и с помощью дозатора жидкости для сыпучих реагентов.На 384-луночный планшет, содержащий разведения соединений и только растворители, дозируют 5 мкл мастер-смеси SAMHD1/PPase. В отсутствие лунок для контроля ферментов дозируйте 5 мкл полного SAMHD1 RB. Фермент и соединения предварительно инкубируют в течение 10 мин при РТ. Во все лунки дозируют 10 мкл 2-кратного раствора dGTP, чтобы начать реакцию. Инкубируют реакцию в течение 20 мин при РТ. Остановите реакцию, дозируя 20 мкл стоп-раствора ЭДТА во все лунки.ПРИМЕЧАНИЕ: При желании эксперимент можно приостановить. Добавьте 10 мкл рабочего раствора MG во все лунки.ОСТОРОЖНОСТЬ: Рабочий раствор МГ содержит серную кислоту. Обеспечьте перемешивание содержимого лунки с помощью орбитального встряхивателя микролунок и центрифугирования при 1 000 x g в течение 1 мин. Инкубируйте планшет в течение 20 мин при RT. Считывание поглощения на длине волны 630 нм в микролуночном планшетном считывателе. Визуализация и анализ данных Рассчитать среднее значение и стандартное отклонение положительных и отрицательных контрольных скважин (положительная, полная реакция с растворителем; отрицательная, dGTP только с растворителем). Рассчитайте Z-фактор37 как показатель качества анализа. Нормализуйте каждое значение поглощения до средних значений положительного и отрицательного элементов управления, установив для положительного элемента управления значение 100 % активности SAMHD1, а для отрицательного элемента управления — 0 % активности SAMHD1. Постройте график активности SAMHD1 (%) в зависимости от концентрации соединения и подгоните четырехпараметрическую кривую зависимости дозы от наклона, позволяющую определить соединение IC50. 3. Активатор SAMHD1 и экран подложки ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательные условия анализа приведены в таблице 2. Рекомбинантные аликвоты SAMHD1 и PPase хранятся в течение длительного времени при -80 °C, разбавленные 9,1 мг/мл и 23,0 мг/мл соответственно, в буфере для хранения (20 мМ HEPES pH 7,5, 300 мМ NaCl, 10% глицерина, 2 мМ TCEP) при -80 °C. После размораживания аликвоты кратковременно хранятся при температуре -20 °C. Приготовление аналогов нуклеотидов в пробирном планшете Разбавляют запасы аналогов нуклеотидов (обычно 10 или 100 мМ в воде) до 4-кратной конечной концентрации в полном SAMHD1 RB, в нашем случае аналога нуклеотидов 800 мкМ, и переносят 5 мкл в соответствующие лунки 384-луночного анализатора. Приготовление компонентов реакцииПРИМЕЧАНИЕ: Это должно быть сделано в день анализаПриготовьте основную смесь ферментов (SAMHD1/PPase) путем разбавления рекомбинантного белка SAMHD1 человека и рекомбинантной РПазы E. coli в полном SAMHD1 RB до 2-кратной желаемой конечной концентрации, т. е. 0,7 мкМ SAMHD1 и 25 ЕД/мл PPase. Готовят только раствор PPase, разбавляя рекомбинантную PPase E. coli в полной SAMHD1 RB до 2-кратной желаемой конечной концентрации, т.е. 25 U/мл PPase. Приготовьте активаторы GTP (AS1) и dGTPαS (AS1 и AS2), разбавляющие исходное сырье (обычно 10 или 100 мМ в воде) в полной SAMHD1 RB до 4-кратной конечной концентрации, т.е. 50 мкМ ГТФ или dGTPαS. Проведение анализаПРИМЕЧАНИЕ: Все компоненты анализа должны быть уравновешены RT. Добавление жидкостей может выполняться как с помощью многоканальной пипетки, так и с помощью дозатора жидкости для сыпучих реагентов.На 384-луночный планшет, содержащий аналоги нуклеотидов, дозируют 5 мкл активатора (ГТФ или дГТПαS) или полный SAMHD1 RB в соответствующие лунки. Начните реакцию, дозировав 10 мкл мастер-смеси SAMHD1/PPase, только PPase или полного SAMHD1 RB в соответствующие лунки. Инкубируют реакцию в течение 20 мин при РТ. Остановите реакцию, дозировав 20 мкл стоп-раствора ЭДТА во все лунки.ПРИМЕЧАНИЕ: При желании эксперимент можно приостановить. Добавьте 10 мкл рабочего раствора MG во все лунки.ОСТОРОЖНОСТЬ: Рабочий раствор МГ содержит серную кислоту. Обеспечьте перемешивание содержимого лунки с помощью орбитального встряхивателя микролунок и центрифугирования при 1 000 x g в течение 1 мин. Инкубируйте планшет в течение 20 мин при RT. Считывание поглощения на длине волны 630 нм в микролуночном планшетном считывателе. Визуализация и анализ данных Рассчитайте средние значения абсорбции для реакционных скважин PPase (отрицательный контрольный или фоновый сигнал).ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве положительного контроля аллостерического активатора и субстрата SAMHD1 в планшет может быть включен dGTP. В этом случае вы можете использовать это условие для расчета Z-фактора как показателя качества пробы. Вычтите фоновое значение из соответствующих лунок в реакциях SAMHD1/PPase. Построен график скорректированных значений поглощения для каждого аналога нуклеотида в условиях буфера, ГТФ и dGTPαS.

Representative Results

Протокол, представленный на рисунке 1 , описывает основной рабочий процесс использования ферментно-связанного анализа малахитового зеленого для исследования взаимодействия малых молекул с дНТФазой SAMHD1 и может быть адаптирован различными способами для исследования различных биохимических вопросов. В репрезентативных результатах, обсуждаемых в следующих параграфах, мы иллюстрируем примеры использования этого анализа для определения ингибиторных свойств малых молекул по отношению к SAMHD1 и проверки того, являются ли различные аналоги нуклеотидов субстратами и/или активаторами этого фермента. Результаты, показанные на рисунке 2, иллюстрируют несколько основных принципов этого анализа. Реактив малахитовый зеленый позволяет проводить колориметрическое детектирование неорганического фосфата путем образования фосфомолибдатного малахитового зеленого комплекса, и, соответственно, данный подход может быть применен для исследования ферментативных реакций, продуктом которых является фосфат. Чтобы продемонстрировать чувствительность этого метода к обнаружению свободных неорганических фосфатов, на рисунке 2А показаны значения абсорбции, полученные при увеличении концентрацииNa3PO4 после 20-минутной инкубации с реагентом малахитовым зеленым. В то время как сигнал достигает насыщения при 0,25 мМ Na3PO4, линейный диапазон обнаружения фосфатов виден от 0,004 до 0,03 мМ (рис. 2A, правая панель), что согласуется с другими исследованиями, в которых сообщалось о линейном диапазоне фосфатов до 10-20 мкМ с использованием анализа малахитового зеленого38. SAMHD1 представляет собой дНТФазу, которая высвобождает неорганический трифосфат при гидролизе молекулы dNTP, и, таким образом, для генерации свободного неорганического фосфата для обнаружения малахитовым зеленым требуется фермент-связь. Было показано, что неорганическая пирофосфатаза (РПаза) из E. coli полезна для этой цели, как в отношении SAMHD1 7,20, так и в отношении других ферментов, метаболизирующих нуклеотиды 30,33,35. Кроме того, SAMHD1 является активной дНТФазой в качестве гомотетрамера, и это требует аллостерической активации (d)NTP, в частности, гуанинтрифосфатом (GTP или dGTP) в AS1 и любым dNTP в AS2. Впоследствии каталитический сайт становится доступным для связывания субстрата и происходит ферментативная реакция. Поскольку dGTP удовлетворяет требованиям для связывания с AS1 и AS2 и является субстратом, использование этого нуклеотида в ингибирующем анализе значительно упрощает рабочий процесс. На рисунке 2B показаны требования к различным компонентам анализа для достижения измеримой активности SAMHD1, о чем свидетельствует увеличение поглощения при длине волны 630 нм. Ни SAMHD1, ни PPase сами по себе не способны генерировать неорганический фосфат в присутствии dGTP, что согласуется с документально подтвержденной активностью этих ферментов. Однако в условиях, когда присутствуют все компоненты анализа (SAMHD1, PPase и активатор/субстрат dGTP), мы наблюдаем увеличение сигнала. Z-фактор37 в приведенном здесь примере (без ферментов + dGTP в качестве отрицательного контроля и SAMHD1/PPase + dGTP в качестве положительного контроля) составил 0,74, что указывает на надежный анализ. Одним из потенциальных применений анализа активности SAMHD1 с ферментом является идентификация ингибиторов с помощью высокопроизводительного скрининга (HTS). Таким образом, в этом отчете мы подтверждаем обнаружение ингибирования SAMHD1 в этом анализе с использованием разнообразного набора соединений, уже описанных в литературе. Seamon et al. оценили дозозависимое ингибирование канонических нуклеозидов по отношению к SAMHD1 с помощью анализа, аналогичного показанному здесь, и обнаружили, что дезоксигуанозин (dGuo) является единственным каноническим нуклеозидом, способным значительно ингибировать SAMHD1, со значением IC50 488 мкМ20. Исследование HTS одобренных FDA препаратов, проведенное с помощью прямого анализа b4NPP, выявило несколько попаданий, которые ингибировали активность SAMHD1 в микромолярных концентрациях, из которых ломофунгин был молекулой, которая наиболее мощно ингибировала активность дНТФазы SAMHD1 in vitro, демонстрируя IC50 20,1 мкМ при определении в присутствии dGTP в качестве субстрата21. Кроме того, четыре α,β-имидо-dNTP-аналоги также были идентифицированы как конкурентные ингибиторы SAMHD1 с помощью сенсора MDCC-PBP и SAMHD1 в сочетании с активностью Ppx, что показало, что ингибиторные константы аналогов dNMPNPP находились в диапазоненизких микромолярных / высоких наномолярных 6,22. Таким образом, чтобы продемонстрировать, что анализ активности SAMHD1 может быть использован для идентификации ингибиторов SAMHD1, dGuo, ломофунгин и 2′-дезокситимидин-5′-[(α,β)-имидо]трифосфат (dTMPNPP) были использованы для валидации метода. На рисунке 3A показаны кривые зависимости «доза-реакция», полученные для этих соединений, показывающие, что увеличение концентрации эффективно ингибирует активность SAMHD1. Средние значения IC50, полученные для этих молекул в трех независимых экспериментах (± стандартное отклонение), были следующими: dGuo = 361,9 ± 72,8 мкМ, ломофунгин 6,78 ± 3,9 мкМ и dTMPNPP = 2,10 ± 0,9 мкМ. В качестве примера отрицательного результата также было определено влияние гидроксимочевины (HU) на активность SAMHD1. HU является ингибитором рибонуклеотидредуктазы, и, хотя он ограничивает активность SAMHD1 ara-CTPase в различных моделях ОМЛ, было показано, что влияние HU на SAMHD1 является косвенным и зависит от нарушения аллостерической регуляции SAMHD118. Кривая зависимости HU от дозы показана на рисунке 3B, и при увеличении дозы HU не наблюдалось никаких изменений активности SAMHD1, что свидетельствует о том, что HU не ингибирует активность SAMHD1 in vitro. Еще одно применение анализа активности SAMHD1, связанного с ферментом, заключается в том, чтобы выяснить, являются ли нуклеотиды и их аналоги субстратами и/или аллостерическими активаторами этого фермента, что проиллюстрировано на рисунке 4. В этом эксперименте канонические нуклеотиды, а также активные метаболиты нескольких противораковых аналогов нуклеозидов, таких как цитарабин (ara-CTP), клофарабин (Cl-F-ara-ATP) и гемцитабин (dF-dCTP), были исследованы в качестве субстратов и активаторов SAMHD1. Благодаря сложной аллостерической регуляции SAMHD1 реакция протекает в присутствии ГТФ в качестве активатора AS1 или негидролизуемого аналога dGTP 2′-дезоксигуанозин-5′-(α-тио)-трифосфата (dGTPαS), который может занимать AS1 и AS2. Активность SAMHD1 в присутствии испытуемого аналога нуклеотида и ГТФ указывает на то, что нуклеотид способен связываться со вторичным аллостерическим сайтом и каталитическим сайтом (т.е. активатором AS2 и субстратом), в то время как активность SAMHD1 с нуклеотидным аналогом и dGTPαS указывает на то, что нуклеотид может занимать только каталитический центр (т.е. только субстрат). Если нуклеотид способен связываться как с аллостерическими сайтами AS1, так и с AS2, а также с каталитическим центром, SAMHD1 будет активен в присутствии только нуклеотида, как показано в случае dGTP. Результаты показывают, что все канонические dNTP способны связываться с сайтом AS2 и с каталитическим центром. В случае нуклеотидных аналогов клофарабинтрифосфат является активатором AS2 и субстратом, тогда как цитарабин трифосфат способен занимать только каталитический сайт. С другой стороны, не наблюдалось никакой активности с гемцитабина трифосфатом, что позволяет предположить, что в проверенных условиях гемцитабинтрифосфат не способен действовать ни как аллостерический эффектор, ни как субстрат. Хотя этот результат согласуется с предыдущимипредсказаниями 9, более поздние исследования кристаллизации и кинетики10 показали, что гемцитабинтрифосфат способен связывать каталитический карман SAMHD1 и что он действительно является субстратом фермента. Тем не менее, в последнем исследовании10 авторы показывают, что скорость гидролиза значительно ниже по сравнению с другими зарегистрированными субстратами, такими как цитарабин трифосфат, что объясняет, почему мы не смогли наблюдать это с помощью этой скрининговой установки. В целом, эти репрезентативные результаты подтверждают использование анализа активности SAMHD1 с ферментами в качестве надежного метода идентификации и характеризации ингибиторов SAMHD1, аллостерических регуляторов и субстратов. Однако, как и все экспериментальные подходы, этот метод имеет свои предостережения, поэтому для дальнейшей проверки результатов следует использовать ортогональные анализы (например, с использованием другой технологии анализа). Рисунок 1: Схематический обзор протокола, описанного в этой статье. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 2: Анализ активности SAMHD1 с ферментной связью. (A) Стандартная кривая Na3PO4 в анализе малахитового зеленого. Серийное разведение Na3PO4 (2-кратное) готовили от 1 мМ до 0,004 мМ в трех экземплярах и инкубировали с малахитовым зеленым реагентом в течение 20 мин. Значения необработанной абсорбции во всем диапазоне тестируемых концентраций отображаются на левой панели, а линейный диапазон — на правой панели. Показан репрезентативный результат двух независимых экспериментов. (B) Валидация анализа активности фермента. SAMHD1 (0,35 мкМ) и/или PPase (12,5 Ед/мл) в присутствии или отсутствии дГТФ активатор/субстрат (25 мкМ) инкубировали в течение 20 мин в анализе активности фермента. Четверняшки из представителя двух независимых экспериментов, показанные с необработанными значениями поглощения, столбцами и столбцами погрешности, показывают среднее значение и SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 3: Оценка соединений на ингибирование SAMHD1 в анализе активности с ферментами. Дозовая реакция ломофунгина (0,78-100 мкМ), 2′-дезокситимидина-5′-[(α,β)-имидо]трифосфата (dTMPNPP, 0,01-100 мкМ) и дезоксигуанозина (dGuo, 10-1,500 мкМ) (A) или гидроксимочевины (HU) (0,78-100 мкМ) (B) в фермент-связанном анализе активности SAMHD1 с dGTP (25 мкМ) в качестве активатора/субстрата. Процентная активность по отношению к контрольным реакциям отдельных репликатов (DMSO + SAMHD1/PPase + dGTP = 100% активность, DMSO + dGTP = 0% активность) с репрезентативным изображением трех экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 4: Оценка нуклеотидных аналогов в качестве аллостерических активаторов и субстратов SAMHD1 в анализе активности с ферментами. Канонические нуклеотиды и отдельные метаболиты трифосфатов противоопухолевых препаратов цитарабина (ara-CTP), клофарабина (Cl-F-ara-АТФ) и гемцитабина (dF-dCTP) были протестированы при 200 мкМ в фермент-связанном анализе активности SAMHD1 в присутствии или отсутствии ГТФ или негидролизуемого аналога dGTP dGTPαS (12,5 мкМ). Приведены нормализованные значения поглощения из отдельных экспериментальных реплик, среднее значение и стандартное отклонение. Показан репрезентативный результат двух независимых экспериментов, адаптированных из нашего предыдущего исследования7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Шаг Реагент Дозируемый объем (мкл) Конечный объем реакции (мкл) Дозируемая концентрация Разбавление складок в реакции Конечная концентрация в реакции 1 Ингибитор 5 20 0,4 мМ 4 0,1 мМ 2 Смесь SAMHD1+PPase 5 1,4 мкМ SAMHD1, 50 Ед/мл ППаза 4 0,35 мкМ SAMHD1, 12,5 Ед/мл Ppase 3 dGTP 10 50 мкМ 2 25 мкМ 4 Инкубация в течение 20 минут 5 Решение ЭДТА 20 40 7,9 мМ 2 3,95 мМ 6 Реагент MG 10 50 2,5 мМ малахитовый зеленый, 64,4 мМ молибдат аммония, 0,18% твин-20 5 0,5 мМ малахитовый зеленый, 12,9 мМ молибдат аммония, 0,036% твин-20 7 Инкубация в течение 20 минут 8 Чтение @ 630 нм Таблица 1: Краткая информация об окончательных условиях в ферментно-связанном анализе для скрининга ингибиторов. Шаг Реагент Дозируемый объем (мкл) Конечный объем реакции (мкл) Дозируемая концентрация Разбавление складок в реакции Конечная концентрация в реакции 1 Аллостерический регулятор 5 20 800 мкМ 4 200 мкМ 2 GTP или dGTPαS 5 50 мкМ 4 12,5 мкМ 3 SAMHD1 и/или PPase 10 0,7 мкМ SAMHD1, 25 ЕД/мл PPase 2 0,35 мкМ SAMHD1, 12,5 ЕД/мл PPase 4 Инкубация в течение 20 минут 5 Решение ЭДТА 20 40 7,9 мМ 2 3,95 мМ 6 Реагент MG 10 50 2,5 мМ малахитовый зеленый, 64,4 мМ молибдат аммония, 0,18% твин-20 5 0,5 мМ малахитовый зеленый, 12,9 мМ молибдат аммония, 0,036% твин-20 7 Инкубация в течение 20 минут 8 Чтение @ 630 нм Таблица 2: Краткая информация о конечных условиях ферментно-связанного анализа для скрининга аллостерических регуляторов

Discussion

Анализ активности на основе ферментов, описанный здесь, представляет собой высокопроизводительный колориметрический анализ, позволяющий косвенно измерять гидролиз dNTP с помощью SAMHD1. Этот метод использует способность неорганической РПазы E. coli, которая при избыточном включении в реакционную смесь превращает каждый неорганический трифосфат, генерируемый SAMHD1, в три отдельных свободных фосфата, которые могут быть количественно определены с помощью простого и экономичного реагента малахитового зеленого. Мы предоставляем этот анализ в формате 384 микролуночных планшетов, который идеально подходит для скрининга библиотек соединений, и демонстрируем применимость и универсальность этого метода для идентификации и характеризации ингибиторов, активаторов и субстратов SAMHD1.

Как и в случае со всеми биохимическими скрининговыми анализами in vitro , существует ряд критических этапов и важных соображений, и многие из них подробно обсуждаются в свободно доступном Руководстве по анализу39. Целостность очищенных рекомбинантных ферментов, как SAMHD1, так и связанного фермента неорганической РПазы, чрезвычайно важна и должна быть подтверждена до проведения анализа. И, соответственно, каждая новая очистка этих ферментов должна подвергаться определенному уровню тестирования партии, поскольку вариабельность от партии к партии может привести к несоответствиям в результатах. В идеале для проверки активности dNTP-трифосфогидролазы используемого очищенного рекомбинантного SAMHD1 следует использовать ортогональный прямой анализ, такой как ВЭЖХ, который позволяет обнаруживать как субстрат, так и продукт реакции.

Что касается ограничений этого анализа, то основным является то, что он измеряет активность дНТФазы SAMHD1 косвенным образом, используя активность неорганической РПазы, что имеет ряд последствий. Важно подтвердить, что PPase практически не проявляет активности по отношению к нуклеотидам, используемым в анализе, и что идентифицированные ингибирующие малые молекулы не обладают активностью по отношению к PPase. Таким образом, что касается скрининга, то важным фактором может быть контрскрининг против ППазы. Присутствие PPазы в реакции также делает критически важным использование ортогонального анализа для подтверждения результатов. Что касается анализов прямой активности, то на сегодняшний день сообщалось о некоторых из них, в том числе TLC 9,20,23 и HPLC 9,21, которые точно определяют истощение субстрата и образование продукта. Кроме того, анализb4NPP 21, который также является высокопроизводительным, может быть использован для тестирования потенциальных ингибиторов; Тем не менее, он не идеален для тестирования субстратов или аллостерических активаторов. Биофизические анализы, такие как дифференциальная сканирующая флуориметрия (DSF), о которой мы ранее сообщали с SAMHD118, также могут быть особенно эффективными в идентификации и характеристике лигандов. Еще одним ограничением анализа, в частности, как показано здесь для идентификации субстратов и активаторов, является использование негидролизуемого аналога dGTP dGTPαS в качестве активатора AS1 и AS2. В то время как это позволяет активировать SAMHD1 без наблюдаемой активности в анализе, dGTPαS является конкурентным ингибитором SAMHD1, и, таким образом, использование высоких концентраций инактивирует фермент. По мере того, как наше понимание SAMHD1 прогрессирует, в будущих исследованиях могут использоваться молекулы, которые занимают исключительно каждый участок SAMHD1, тем самым сводя на нет эту потенциальную проблему.

Как мы показали здесь, этот метод универсален и может быть использован для решения ряда биохимических вопросов. Мы описали два варианта этого анализа, один для идентификации аллостерических регуляторов и субстратов SAMHD1, а другой для характеризации ингибиторов, но могут быть сделаны дальнейшие адаптации. Что касается потенциальных ингибиторов, то этот анализ, основанный на микролуночных планшетах, делает его хорошо подходящим для последующих исследований механизма действия39,40. Аналогично, для дальнейшей характеристики субстратов и аллостерических регуляторов этот метод может быть использован для определения кинетических параметров катализа, как это было сделано для активного метаболита цитарабина и клофарабина7. Тем не менее, одним из недостатков является то, что ферментно-связанный анализ, представленный здесь, является анализом конечной точки, и поэтому, хотя он хорошо подходит для скрининга, непрерывный анализ лучше подходит для некоторых механистических исследований. Arnold et al. сообщили о непрерывном анализе с использованием биосенсора MDCC-PBP6, который основан на использовании периплазматического фосфатсвязывающего белка (PBP), меченного флуорофором кумарина малеимида (MDCC), который может связываться со свободной фосфатной группой. MDCC-PBP очень чувствителен и позволяет количественно определять очень низкие концентрации фосфатов, при этом время отклика датчика составляет от миллисекунды до секунды.

SAMHD1 выполняет ряд важных функций в отношении здоровьяи заболеваний человека2, многие из которых могут быть связаны с его центральной ролью в поддержании внутриклеточного уровня dNTP1. Таким образом, идентификация высококачественного химического зонда в отношении активности дНТФазы SAMHD1 была бы мощным инструментом в определении этих связей, а ферментативный анализ, представленный здесь, мог бы быть легко использован для идентификации таких зондов. Кроме того, препараты на основе нуклеозидов, многие из которых модулируются SAMHD1, представляют собой разнообразную и важную группу терапевтических41; химические зонды могут быть в дальнейшем усовершенствованы в лекарственные препараты, нацеленные на SAMHD1 в клинических условиях, с целью повышения эффективности этих методов лечения. Также очень важно понимать полную степень взаимодействия этих соединений на основе нуклеозидов с SAMHD1, вопрос, который также может быть решен с помощью этого ферментно-связанного анализа. В целом, анализ активности SAMHD1 с ферментной связью, как описано здесь, является недорогим, универсальным и высокопроизводительным анализом, который может быть использован для углубления нашего понимания этого важного фермента.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Томаса Лундбека и сотрудников лаборатории Томаса Хелледея за советы и поддержку. Часть этой работы была проведена при содействии Центра науки о белках в Каролинском институте/SciLifeLab (http://ki.se/psf), и мы выражаем признательность Национальному институту рака (NCI), Отделу лечения и диагностики рака (DCTD) и Программе терапии развития (DTP) (http://dtp.cancer.gov) за предоставление соединения. Финансирование было предоставлено за счет грантов, предоставленных S.G.R. Шведским исследовательским советом (2018-02114), Шведским онкологическим обществом (19-0056-JIA, 20-0879-PJ), Шведским фондом детского рака (PR2019-0014) и Каролинским институтом.

Materials

2'-deoxyadenosine-5'-triphosphate (dATP) Jena bioscience NU-1001 Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay
2'-deoxycytidine-5'-triphosphate (dCTP) Jena bioscience NU-1002 Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay
2'-Deoxyguanosine-5'-(α-thio)-triphosphate (dGTPαS) Jena bioscience NU-424 Non-hydrolyzable dGTP analogue for SAMHD1 activator/substrate assay
2'-deoxyguanosine-5'-triphosphate (dGTP) GE Healthcare 27-1870-04 SAMHD1 allosteric activator and substrate used in inhibition assay and activator/substrate assay
2'-Deoxythymidine-5'-[(α,β)-imido]triphosphate (dTMPNPP) Jena bioscience NU-907-1 Compound tested in SAMHD1 inhibition assay
2'-deoxythymidine-5'-triphosphate (dTTP) Jena bioscience NU-1004 Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay
2'Deoxyguanosine mohohydrate (dGuo) Sigma-Aldrich D0901 Compound tested in SAMHD1 inhibition assay
384 well clear flat-bottom  microplate Thermo Fisher Scientific 262160 Assay plate
96 well clear U-bottom polypropylene  microplate Thermo Fisher Scientific 267245 Compound dilution plate
Ammonium heptamolybdate tetrahydrate Sigma-Aldrich A1343 Reagent required for malachite green working reagent
ara-Cytidine-5'-triphosphate (ara-CTP) Jena bioscience NU-1170 Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay
Clofarabine-5'-triphosphate (Cl-F-ara-ATP) Jena bioscience NU-874 Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay
Dimethyl sulphoxide (DMSO) VWR 23486.297 Solvent
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma-Aldrich E5134 EDTA stop solution component
Gemcitabine-5'-triphosphate (dF-dCTP) Jena bioscience NU-1607 Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay
GraphPad Prism GraphPad Software Prism 8 Data analysis and visualisation
Guanosine 5′-triphosphate (GTP) sodium salt hydrate Sigma-Aldrich G8877 Allosteric activator for SAMHD1 activator/substrate assay
His-tagged E. coli inorganic pyrophosphatase  (PPase) Generated in house using Protein Science Facility, Karolinska Institutet – Recombinant PPase protein, hydrolises inorganic triphosphate and pyrophosphate to orthophosphate so it can form complex with malachite green
His-tagged human SAMHD1 Generated in house using Protein Science Facility, Karolinska Institutet – Recombinant SAMHD1 protein, hydrolizes dNTPs into its corresponding nucleoside and inorganic triphosphate
Hydroxyurea Sigma-Aldrich H8627 Compound tested in SAMHD1 inhibition assay
Lomofungin National Cancer Institute (NCI)/Division of Cancer Treatment and Diagnosis (DCTD)/Developmental Therapeutics Program (DTP) NSC106995 Compound tested in SAMHD1 inhibition assay
Magnesium Chloride hexahydrate (MgCl2) Sigma-Aldrich M2670 SAMHD1 reaction buffer component
Malachite green Carbinol hydrochloride Sigma-Aldrich 213020 Malachite green stock component
Microplate Reader Hidex Hidex Sense Microplate reader Data acquisition, absorption read at 630 nm wavelength
Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich 31434 SAMHD1 reaction buffer component
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 567530 SAMHD1 reaction buffer component
Sodium phosphate (Na3PO4) Sigma-Aldrich 342483 Required for phosphate standard curve
Sulphuric acid 95-97% Sigma-Aldrich 84720 Malachite green stock component
Tris-Acetate salt Sigma-Aldrich T1258 SAMHD1 reaction buffer component
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) Sigma-Aldrich C4706 SAMHD1 reaction buffer component
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379 SAMHD1 reaction buffer and malachite green working reagent component
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Franzolin, E., et al. The deoxynucleotide triphosphohydrolase SAMHD1 is a major regulator of DNA precursor pools in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14272-14277 (2013).
  2. Coggins, S. A., Mahboubi, B., Schinazi, R. F., Kim, B. SAMHD1 functions and human diseases. Viruses. 12 (4), 382 (2020).
  3. Goldstone, D. C., et al. HIV-1 restriction factor SAMHD1 is a deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase. Nature. 480 (7377), 379-382 (2011).
  4. Powell, R. D., Holland, P. J., Hollis, T., Perrino, F. W. Aicardi-Goutieres syndrome gene and HIV-1 restriction factor SAMHD1 is a dGTP-regulated deoxynucleotide triphosphohydrolase. The Journal of Biological Chemistry. 286 (51), 43596-43600 (2011).
  5. Morris, E. R., Taylor, I. A. The missing link: Allostery and catalysis in the anti-viral protein SAMHD1. Biochemical Society Transactions. 47 (4), 1013-1027 (2019).
  6. Arnold, L. H., Kunzelmann, S., Webb, M. R., Taylor, I. A. A continuous enzyme-coupled assay for triphosphohydrolase activity of HIV-1 restriction factor SAMHD1. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 186-192 (2015).
  7. Herold, N., et al. Targeting SAMHD1 with the Vpx protein to improve cytarabine therapy for hematological malignancies. Nature Medicine. 23 (2), 256-263 (2017).
  8. Schneider, C., et al. SAMHD1 is a biomarker for cytarabine response and a therapeutic target in acute myeloid leukemia. Nature Medicine. 23 (2), 250-255 (2017).
  9. Hollenbaugh, J. A., et al. Substrates and inhibitors of SAMHD1. PloS One. 12 (1), 0169052 (2017).
  10. Knecht, K. M., et al. The structural basis for cancer drug interactions with the catalytic and allosteric sites of SAMHD1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (43), 10022-10031 (2018).
  11. Oellerich, T., et al. Selective inactivation of hypomethylating agents by SAMHD1 provides a rationale for therapeutic stratification in AML. Nature Communications. 10 (1), 3475 (2019).
  12. Herold, N., et al. SAMHD1 protects cancer cells from various nucleoside-based antimetabolites. Cell Cycle. 16 (11), 1029-1038 (2017).
  13. Rothenburger, T., et al. SAMHD1 is a key regulator of the lineage-specific response of acute lymphoblastic leukaemias to nelarabine. Communications Biology. 3 (1), 324 (2020).
  14. Ordonez, P., et al. SAMHD1 enhances nucleoside- analogue efficacy against HIV-1 in myeloid cells. Scientific Reports. 7, 42824 (2017).
  15. Castellví, M., et al. Pharmacological modulation of SAMHD1 activity by CDK4/6 inhibitors improves anticancer therapy. Cancers. 12 (3), 713-719 (2020).
  16. Rassidakis, G. Z., et al. Low-level expression of SAMHD1 in acute myeloid leukemia (AML) blasts correlates with improved outcome upon consolidation chemotherapy with high-dose cytarabine-based regimens. Blood Cancer Journal. 8 (11), 98 (2018).
  17. Rudd, S. G., Schaller, T., Herold, N. SAMHD1 is a barrier to antimetabolite-based cancer therapies. Molecular & Cellular Oncology. 4 (2), 1287554 (2017).
  18. Rudd, S. G., et al. Ribonucleotide reductase inhibitors suppress SAMHD1 ara-CTPase activity enhancing cytarabine efficacy. EMBO Molecular Medicine. 41, 10419 (2020).
  19. Seamon, K. J., et al. Small molecule inhibition of SAMHD1 dNTPase by tetramer destabilization. Journal of the American Chemical Society. 136 (28), 9822-9825 (2014).
  20. Seamon, K. J., Stivers, J. T. A high-throughput enzyme-coupled assay for SAMHD1 dNTPase. Journal of Biomolecular Screening. 20 (6), 801-809 (2015).
  21. Mauney, C. H., Perrino, F. W., Hollis, T. Identification of inhibitors of the dNTP triphosphohydrolase SAMHD1 using a novel and direct high-throughput assay. 生物化学. 57 (47), 6624-6636 (2018).
  22. Morris, E. R., et al. Crystal structures of SAMHD1 inhibitor complexes reveal the mechanism of water-mediated dNTP hydrolysis. Nature Communications. 11 (1), 3165 (2020).
  23. Hansen, E. C., Seamon, K. J., Cravens, S. L., Stivers, J. T. GTP activator and dNTP substrates of HIV-1 restriction factor SAMHD1 generate a long-lived activated state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (18), 1843-1851 (2014).
  24. Baykov, A. A., Evtushenko, O. A., Avaeva, S. M. A malachite green procedure for orthophosphate determination and its use in alkaline phosphatase-based enzyme immunoassay. Analytical Biochemistry. 171 (2), 266-270 (1988).
  25. Hyun, M., Bohr, V. A., Ahn, B. Biochemical characterization of the WRN-1 RecQ helicase of Caenorhabditis elegans. 生物化学. 47 (28), 7583-7593 (2008).
  26. Lin, H. -. H., Huang, C. -. Y. Characterization of flavonol inhibition of DnaB helicase: real-time monitoring, structural modeling, and proposed mechanism. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2012 (4), 735368 (2012).
  27. Yang, M., Wang, G. ATPase activity measurement of DNA replicative helicase from Bacillus stearothermophilus by malachite green method. Analytical Biochemistry. 509, 46-49 (2016).
  28. Allard, B., Cousineau, I., Spring, K., Stagg, J. Measurement of CD73 enzymatic activity using luminescence-based and colorimetric assays. Methods in Enzymology. 629, 269-289 (2019).
  29. Lee, M., et al. Structure-activity relationship of sulfonyl piperazine LpxH inhibitors analyzed by an LpxE-coupled malachite green assay. ACS Infectious Diseases. 5 (4), 641-651 (2019).
  30. Carreras-Puigvert, J., et al. A comprehensive structural, biochemical and biological profiling of the human NUDIX hydrolase family. Nature Communications. 8 (1), 1541 (2017).
  31. Valerie, N. C. K., et al. NUDT15 hydrolyzes 6-thio-deoxyGTP to mediate the anticancer efficacy of 6-thioguanine. 癌症研究. 76 (18), 5501-5511 (2016).
  32. Carter, M., et al. Human NUDT22 Is a UDP-glucose/galactose hydrolase exhibiting a unique structural fold. Structure. 26 (2), 295-303 (2018).
  33. Gad, H., et al. MTH1 inhibition eradicates cancer by preventing sanitation of the dNTP pool. Nature. 508 (7495), 215-221 (2014).
  34. Page, B. D. G., et al. Targeted NUDT5 inhibitors block hormone signaling in breast cancer cells. Nature Communications. 9 (1), 250 (2018).
  35. Zhang, S. M., et al. Development of a chemical probe against NUDT15. Nature Chemical Biology. 16 (10), 1120-1128 (2020).
  36. Michel, M., et al. In silico druggability assessment of the NUDIX hydrolase protein family as a workflow for target prioritization. Frontiers in Chemistry. 8, 443 (2020).
  37. Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67 (1999).
  38. Baykov, A. A., Evtushenko, O. A., Avaeva, S. M. A malachite green procedure for orthophosphate determination and its use in alkaline phosphatase-based enzyme immunoassay. Analytical Biochemistry. 171 (2), 266-270 (1988).
  39. Markossian, S., et al. Assay guidance manual. Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. , (2004).
  40. Holdgate, G. A., Meek, T. D., Grimley, R. L. Mechanistic enzymology in drug discovery: a fresh perspective. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (2), 115-132 (2018).
  41. Tsesmetzis, N., Paulin, C. B. J., Rudd, S. G., Herold, N. Nucleobase and nucleoside analogues: resistance and re-sensitisation at the level of pharmacokinetics, pharmacodynamics and metabolism. Cancers. 10 (7), 240 (2018).

Tags

Enzyme-coupled Activity AssaySAMHD1Small Molecule InteractionDNTPaseChemotherapy DrugsHydrolysisScreening AssaySmall Molecule InhibitorsMalachite GreenPyrophosphataseDGTPDGDPEDTATCEPTween-20

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Yagüe-Capilla, M., Rudd, S. G. A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1. J. Vis. Exp. (170), e62503, doi:10.3791/62503 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image