Analyse der SAMHD1-Restriktion durch Durchflusszytometrie in humanen myeloischen U937-Zellen

Dieses Protokoll enthält keine Studien mit Tieren oder menschlichen Teilnehmern, die von einem der Autoren durchgeführt wurden. Alle Schritte dieses Protokolls wurden nach den Richtlinien und Verhaltenskodizes der Organe durchgeführt, in denen sie durchgeführt wurden. 1. Transfektion von 293T-Zellen für die VLP-Produktion (sowohl SAMHD1-Expressionsvektoren als auch Tester-HIV-Partikel) HINWEIS: Die wichtigsten Beiträge zur erfolgreichen Produktion von Viruspartikeln sind die Gesundheit der produzierenden 293T-Zellen, der Zusammenfluss bei der Transfektion und der Zeitpunkt der Ernte. Laboratorien haben in der Regel ihre bevorzugten Transfektionsreagenzien und Protokolle für die retrovirale Partikelproduktion. Das folgende Protokoll liefert infektiöse Partikel von guter Qualität, aber gleichwertige Protokolle wären auch für diese Anwendung geeignet. Um eine gute Qualität der 293T-Zellen zu erhalten, mindestens dreimal pro Woche durchgehen, um eine konstante Wachstumsrate aufrechtzuerhalten. Die Zellen sollten in der logarithmischen Wachstumsphase für eine effiziente Transfektion ausgesät werden. Tag 1: Säen Sie die erforderliche Anzahl von 10 cm Schalen mit einem 1/4 Split von einer nahezu konfluenten Schale von 293T-Zellen, um am nächsten Tag etwa 60% Konfluenz zu erhalten (ca. 5 x 105 Zellen / ml). Möglicherweise müssen mehrere Dichten ausgesät werden, um eine geeignete Dichte für die Transfektion am nächsten Tag zu erreichen, wenn mit einem neuen Zellbestand gearbeitet wird. Tag 2 (morgens): Überprüfen Sie die Konfluenz von etwa 60% durch Mikroskopie und ersetzen Sie die Medien auf den Zellen vorsichtig durch 10 ml frisches Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM). Tag 2 (nachmittags, mindestens 4 h nach Medienwechsel): Transfect für die VLP-Produktion.Die DNA-Verdünnungsmischung enthält jeweils 3 μg Gag-Pol-Expressorplasmid, Long-terminal repeat (LTR)-getriebenes Reporterplasmid und Vesicular Stomatitis Virus G protein ( VSV-G ) Expressorplasmid (insgesamt 9 μg, siehe HINWEIS) in 600 μL serumfreiem DMEM. Wirbel und kurz zentrifugieren (15 s, >500 x g). 20 μL Transfektionsreagenz (siehe Materialtabelle), Wirbel (nicht zentrifugieren) zugeben und bei 20 °C für 15-20 min inkubieren. Fügen Sie die Transfektionsmischung tropfenweise auf die Platte hinzu, schwenken Sie sie vorsichtig, um zu mischen, und kehren Sie zum Inkubator zurück.HINWEIS: Für MLV-VLP, das SAMHD1 exprimiert, verwenden Sie KB4 5,6 (Gag-Pol-Expressor-Plasmid), pLGatewaySAMHD1IeYFP1 (LTR-gesteuertes Reporterplasmid) und pczVSV-G7. Verwenden Sie für HIV-RFP VLP p8.91 8,9 (Gag-Pol-Expressorplasmid), SCRPSY10 (LTR-gesteuertes Reporterplasmid) und pczVSV-G. Alternativen werden im Materialverzeichnis erläutert. Plasmidverhältnisse müssen möglicherweise für verschiedene Plasmid-/Transfektionssysteme optimiert werden. Tag 3 (später Vormittag): Entfernen Sie die Medien vorsichtig durch Pipettieren aus den Zellen, waschen Sie sie mit 5 ml frischem DMEM und ersetzen Sie sie durch 5 ml frisches DMEM. Tag 4 (morgens): Ernten Sie das Virus, indem Sie den Überstand aus den Zellen sammeln und durch 5 ml frisches DMEM ersetzen. Den VLP-haltigen Überstand durch einen 0,45-nm-Filter leiten, aliquot machen und zur Lagerung auf -70 °C überführen. Stellen Sie sicher, dass die Aliquots eine Größe haben, die für geplante Experimente geeignet ist (250 μL als Vorschlag), da wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen zu einem Verlust des Virustiters führen. Tag 5 (morgens): Ernten Sie das Virus wie in 1.5, aber werfen Sie die Platten nach dem Sammeln des Überstands weg. 2. Titern des neuen VLP vor der Verwendung Tag 1: Saat 293T bei 2 x 105 Zellen pro Vertiefung einer 24-Well-Platte – 4 Vertiefungen pro zu titrierendem Virus, einschließlich eines Virus bekannter Infektiosität für jedes Rückgrat. Optimieren Sie die Aussaatdichte für einen bestimmten Zellbestand. Tag 2: Beobachten Sie die Platte, um den Zusammenfluss zu überprüfen (idealerweise ~70%). Tauen Sie den virushaltigen Überstand aus den Schritten 1.5 und 1.6 auf. Geben Sie 0, 10, 25 oder 100 μL in jede Vertiefung. Tag 4 (Morgen): Entnahme der Zellen zur Analyse durch Durchflusszytometrie.Entfernen Sie das Medium durch vorsichtiges Pipettieren oder Absaugen. Waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 250 μL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Entfernen Sie die Zellen von der Platte, indem Sie mit 250 μL PBS auf und ab pipettieren, und übertragen Sie sie in ein Mikrozentrifugenröhrchen. 250 μL 4% Paraformaldehyd zugeben (Endkonzentration auf 2%).ACHTUNG: Paraformaldehyd ist giftig. Es sollte nicht mit Desinfektionsmitteln auf Chlorbasis gemischt werden. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 500 x g für 5 min, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 μL PBS oder einem alternativen Durchflusszytometriepuffer. Analysieren Sie nach Bedarf auf RFP oder YFP durch Durchflusszytometrie. Normalisieren Sie die Infektiosität eines bestimmten Virusbestands anhand der Werte für einen Bestand bekannter Infektiosität.HINWEIS: VLP kann auch durch p24-Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) normalisiert werden; Dies ist jedoch nicht unbedingt ein guter Indikator für die VLP-Infektiosität, insbesondere wenn VLP-Bestände in verschiedenen Transfektionen hergestellt werden. Veröffentlichte mediane Gewebekultur-Infektionsdosis oder Multiplizität der Infektion (TCID50/MOI)Methoden 11 können ebenfalls eine relative Quantifizierung liefern, obwohl diese für MLV nicht gut etabliert sind. Die relative Fluoreszenz bietet eine kostengünstige Alternative zu kommerziellen reversen Transkriptase-ELISA-Methoden. 3. Transduktion von U937 mit VLP exprimierend SAMHD1 und YFP HINWEIS: Die Schritte 3-6 stellen das Restriktionsexperiment dar. Die Tage sind gezählt, um die Planung zu erleichtern. Tag 1 (nachmittags): Auftauen von VLP für die Transduktion einschließlich MLV-Wild-Typ SAMHD1-YFP (Positivkontrolle), MLV-SAMHD1(HD206-7AA)-YFP (Negativkontrolle) und Variante MLV-SAMHD1-YFP (experimentelle Proben). Verdünnen Sie das normalisierte VLP auf ein Endvolumen von 500 μL mit Roswell Park Memorial Institute 1640 Medien (RPMI) in einem Mikrofugenröhrchen, fügen Sie 0,5 μL Polybren (10 mg / ml) hinzu und mischen Sie durch Streichen.Wenn VLP vorher nicht titriert werden kann, verwenden Sie zunächst 100 μL. Verwenden Sie ein maximales Verhältnis von 1:1 von VLP zu RPMI, um die VLP-induzierte Toxizität zu begrenzen. Streben Sie eine Transduktion von ca. 30% an. Aliquot 5 x 105 U937 Zellen in ein steriles Mikrofugenröhrchen für jede Transduktionsbedingung. Pellet durch Zentrifugieren bei 500 x g für 5 min und Entfernen des Überstands (fügen Sie zwei zusätzliche Röhrchen als nicht transduzierte Kontrollen für die Durchflusszytometrie hinzu). Resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 μL verdünntem VLP (oder RPMI für nicht transduzierte Kontrollen) und geben Sie es in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte. Spinokule in einer Tischzentrifuge bei 800 x g für 90 min bei 20 °C. 1 ml 37 °C RPMI in die Vertiefung geben und 3 Tage in einem 37 °C Inkubator erholen lassen. 4. Differenzierung von transduziertem U937 Tag 4 (morgens): Resuspendieren Sie die Zellen durch vorsichtiges Pipettieren und übertragen Sie 350 μL in jede der 4 Vertiefungen einer 12-Well-Platte. 700 μL 37 °C RPMI mit 150 nM PMA in jede Vertiefung geben, was eine Endkonzentration von 100 nM ergibt und 3 Tage lang differenzieren lässt.HINWEIS: PMA wird als Pulver gekauft und sollte in DMSO auf 1 mM resuspendiert und im Dunkeln gelagert werden. Ein Arbeitsmaterial von 100 μM sollte durch Verdünnen von 1/10 aus dem 1 mM Bestand mit DMSO hergestellt werden. 5. Infektion von differenziertem, SAMHD1-exprimierendem U937 mit HIV-RFP Tag 7: Beobachten Sie die Zellen durch Mikroskopie. Stellen Sie sicher, dass die Zellen anhaften. Saugen Sie die Medien aus allen Vertiefungen ab, fügen Sie 1 ml RPMI zu 1 von jedem Satz von 4 hinzu, um eine nicht transduzierte, nicht infizierte Steuerung sowie einfarbige Kontrollen zu ermöglichen. Fügen Sie 0,5 ml RPMI mit etwa 10 μL HIV-1-RFP (ca. 10 ng p24 als Richtwert) zu allen anderen Vertiefungen hinzu. Streben Sie eine Infektion von etwa 50% an. Tag 8 (morgens): Fügen Sie 0,5 ml RPMI zu jedem der infizierten Vertiefungen hinzu. 6. Durchflusszytometrische Analyse HINWEIS: Es empfiehlt sich, einen lebenden toten Fleck in Durchflusszytometrie-Pipelines aufzunehmen. Wenn die U937-Zellen jedoch von guter Qualität sind, kann dieser Schritt ohne negative Folgen für die nachgeschaltete Analyse entfallen. Das sanfte Pipettieren von trypsinisierten Zellen sollte leicht zu einer Einzelzellsuspension führen. Tag 10 (morgens): Absaugen Sie die Medien aus den Brunnen und waschen Sie einmal mit PBS. Fügen Sie 300 μL Zelldissoziationsenzym (oder Trypsin) für 5-10 min hinzu. Fügen Sie weitere 300 μL PBS hinzu, resuspendieren Sie gründlich, stellen Sie sicher, dass sich alle Zellen von der Platte gelöst haben, und übertragen Sie sie in Durchflusszytometrieröhrchen. Fügen Sie 300 μL 4% Paraformaldehyd hinzu (wobei die Endkonzentration auf 2% erhöht wird). Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 500 x g für 5 min, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 μL PBS oder einem alternativen Durchflusszytometriepuffer. Analyse mittels Durchflusszytometrie.HINWEIS: Die folgenden Schritte gelten für einen Fortessa-Analysator, aber eine gleichwertige Analyse kann mit jedem Analysator erreicht werden, der RFP- und YFP-Fluoreszenz lesen kann. Konsultieren Sie den lokalen Durchflusszytometrie-Support oder einen anderen erfahrenen Forscher, bevor Sie eine Durchflusszytometrie-Analyse einrichten. Wenn viele Proben gleichzeitig gesiebt werden müssen, kann ein Hochdurchsatz-Probenehmer geeignet sein. In diesem Fall wird eine größere Zellzahl und ein größeres Volumen empfohlen. 7. Durchflusszytometrie-Analyse Schalten Sie das Zytometer 10 Minuten vor Bedarf ein und schalten Sie den Computer ein. Überprüfen Sie, ob der Abfall leer und der Manteltank voll ist. Melden Sie sich am Computer an und öffnen Sie die Analysesoftware. Bewegen Sie den Arm zur Seite, nehmen Sie den Wasserschlauch ab, stellen Sie die Durchflussrate auf Hoch und drücken Sie Prime. Warten Sie, bis das Licht erlischt, und wiederholen Sie den Vorgang noch drei weitere Male. Stellen Sie das Wasser wieder auf und laufen Sie 3 Minuten lang hoch und wechseln Sie dann zu Niedrig und drücken Sie Standby , bis Sie mit der Erfassung fortfahren. In der Zwischenzeit richten Sie das Experiment innerhalb der Software ein:Wählen Sie Experiment / Neues Experiment (Name gemäß lokaler Anleitung). Löschen Sie im Inspektor die nicht benötigten Fluorochrome, und lassen Sie Blue Laser 530/30 und Yellow Laser 610/20 oder die empfohlenen Laser- und Filterkombinationen für YFP und RFP für die Maschine übrig. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Experiment und wählen Sie Zytometereinstellungen/Anwendungseinstellungen/Arbeitsblatt erstellen. Erstellen Sie auf dem Arbeitsblatt einen Vorwärtsstreubereich (FSC-A)/Seitenstreubereich (FSC-A) Punktblot und YFP-Histogramm, RFP-Histogramm und GFP/YFP-Punktblot, indem Sie auf das entsprechende Symbol klicken und die Achsen durch Klicken auf die Achsenbeschriftung ändern. Klicken Sie erneut mit der rechten Maustaste auf Experiment und fügen Sie Neues Exemplar hinzu. Benennen Sie sie ggf. um. Öffnen Sie die Probe, indem Sie auf das Pluszeichen klicken, um ein neues Röhrchen anzuzeigen. Öffnen Sie das Erfassungs-Dashboard in der Ansicht, laden Sie das nicht infizierte, nicht übertragene Steuerelement und drücken Sie Erfassen. Passen Sie die FSC- und SSC-Spannungen im Dashboard an, um Zellen im unteren linken Quadranten zu positionieren (keine Zellen auf den Achsen). Tor um diese Bevölkerung P1. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf andere Diagramme und wählen Sie P1 anzeigen, um Ablagerungen aus der nachfolgenden Analyse zu entfernen. Laden Sie das einfarbige Steuerelement für YFP (nur Wildtyp-SAMHD1) und erwerben Sie. Stellen Sie die YFP-Spannung im Armaturenbrett so ein, dass sich die meisten fluoreszierenden Zellen im Bereich des Detektors befinden (nicht am Rand der Achse). Wiederholen Sie diesen Vorgang für die einfarbige RFP-Steuerung. Führen Sie eine automatische Kompensation mit den nicht transduzierten, nicht infizierten und einfarbigen Steuerelementen durch.Wählen Sie im Menü Experiment > Kompensationseinrichtung > Kompensationssteuerelemente erstellen aus, um zu einem normalen Arbeitsblatt zu wechseln. Wählen Sie das ungefärbte normale Arbeitsblatt aus, drücken Sie auf Ausführen und erfassen für das nicht gefärbte Steuerelement. Zeichnen Sie ein Tor um die intakten Zellen (P1) und zeichnen Sie sie auf. Entfernen Sie den Schlauch und versetzen Sie das Gerät in den Standby-Modus. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf P1, klicken Sie auf Auf alle Kompensationskontrollen anwenden. Wechseln Sie zum normalen RFP-Arbeitsblatt, und drücken Sie Ausführen. Notieren Sie die einfarbige RFP-Steuerung und versetzen Sie das Gerät in den Standby-Modus. Die Software sollte automatisch die positive Population auswählen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die YFP-Einzelfarbsteuerung. Wählen Sie Experiment > Kompensationseinrichtung > Kompensation berechnen > verknüpfen und speichern. Wechseln Sie zum globalen Arbeitsblatt. Erwerben Sie die mit dem Wildtyp SAMHD1 transduzierten Zellen, die mit HIV-RFP infiziert sind, und überprüfen Sie, ob vier verschiedene Populationen in den Ecken der Quadranten zu sehen sind, die vertikal bzw. horizontal für YFP bzw. RFP ausgerichtet sind. Entfernen Sie den Schlauch, und drücken Sie Standby. Laden Sie die nicht transduzierte, nicht infizierte Probe neu, drücken Sie Run and Record 30.000 events ( Ausführen und 30.000 Ereignisse aufzeichnen ) mit P1 als Stopp-Gate. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die verbleibenden Proben (einschließlich anderer Steuerelemente). Benennen Sie die Beispiele während der Ausführung oder Post-hoc um. Nach dem Export können Dateien nicht mehr umbenannt werden. Exportieren Sie die Daten als .fcs-Dateien und reinigen Sie die Fluidik gemäß den lokalen Anweisungen. 8. Datenanalyse HINWEIS: Die folgenden Schritte entsprechen der Analyse in FlowJo v10; Gleichwertige Schritte können jedoch problemlos in anderer Analysesoftware durchgeführt werden. Öffnen Sie die Software und ziehen Sie alle .fcs-Dateien in das Dashboard. Wählen Sie die Kompensationssteuerelemente aus und ziehen Sie sie in den Unterordner Kompensation. Öffnen Sie die Datei für die nicht transduzierte, nicht infizierte Röhre durch Doppelklick, wodurch der FSC-A/SSC-A-Plot angezeigt wird. Wählen Sie das Polygonwerkzeug und das Tor für die intakte Zellpopulation aus, ohne Schmutz in der unteren linken Ecke. Nennen Sie diese Zellen. Ziehen Sie dieses Tor auf die gesamte Population von Röhrchen in der Leiste Alle Proben . Scrollen Sie mit den horizontalen Pfeiltasten durch jede einzelne Probe, um sicherzustellen, dass die Ansteuerung für jedes Röhrchen geeignet ist. Doppelklicken Sie auf die Zellpopulation für die nicht transduzierte, nicht infizierte Probe und passen Sie die Achsen auf FSC-Höhe (H) vs FSC-Fläche (A) an. Wählen Sie die einzelne große Population mit einem rechteckigen Tor aus, um Dubletten auszuschließen. Die Software schlägt automatisch vor, diese einzelnen Zellen zu benennen. Ziehen Sie dieses Tor auf alle Zellpopulationen , und überprüfen Sie erneut, ob das Gating für alle Proben geeignet ist. Wählen Sie die Einzelzellenpopulation für die nicht infizierte, nicht transduzierte Probe aus, ändern Sie die Achsen in kompensierter blauer Laser (y , YFP) im Vergleich zu kompensiertem gelbem Laser (x, RFP). Drücken Sie T auf der Achse und wählen Sie Biexponentielle Skala für x und y. Wählen Sie das Quadrant Gating Tool aus und klicken Sie auf das obere rechte Ende der negativen Zellpopulation. Wenden Sie dieses vorläufige Gating auf alle Einzelzellpopulationen an, indem Sie es in die Leiste Alle Proben ziehen. Wenn die Quadrantengatter die Grundgesamtheiten nicht zufriedenstellend trennen, kann es erforderlich sein, einzelne Quadranten mit dem Polygonwerkzeug zu gattern, wie in Abbildung 2 dargestellt. Scrollen Sie zum Wildtyp-Beispiel SAMHD1 (nur YFP) und überprüfen Sie, ob das Gating zwischen dem nicht transduzierten (YFP negativ) und dem YFP-Positiv korrekt ist. Es kann hilfreich sein, zur Konturansicht zu wechseln, um negative von schwachen YFP-Zellen zu unterscheiden. Wenn die obersten YFP +ve-Zellen weit verteilt sind, passen Sie das obere vertikale Gate nach rechts an. Scrollen Sie durch alle Proben und überprüfen Sie das Gating in Bezug auf YFP-Positivität. Verwenden Sie die beste Unterteilung zwischen YFP-Negativ und -Positiv, die für alle Proben gültig ist.HINWEIS: Die Kompensation wurde basierend auf dem Wildtyp-YFP-Expressionslevel SAMHD1 berechnet. Wenn die Infektionsraten zwischen verschiedenen SAMHD1-YFP-transduzierten Zellen sehr unterschiedlich sind, muss die Kompensation möglicherweise angepasst werden. Es ist daher bevorzugt, dass YFP VLP vor der Verwendung normalisiert werden. Scrollen Sie zum nicht transduzierten, HIV-RFP-infizierten Röhrchen und überprüfen Sie, ob das Gating zwischen nicht infiziertem RFP-negativ und infiziertem RFP-positiv korrekt ist. Passen Sie die entsprechenden Anpassungen an, indem Sie bei Bedarf die Konturansicht verwenden, und scrollen Sie durch die verbleibenden Proben, um zu überprüfen, ob die Ansteuerung für alle Proben gültig ist. Jede Probe erfordert doppelt negativ (Q4: unten links, nicht transduziert, nicht infiziert), YFP-positiv (Q1: oben links, SAMHD1-exprimierend, nicht infiziert), RFP-positiv (Q3: unten rechts, nicht transduziert, HIV-infiziert) und doppelt positiv (Q2: oben rechts, SAMHD1 exprimiert HIV-infiziert). Öffnen Sie den Tabelleneditor, indem Sie auf das Symbol klicken und ziehen Sie die vier Quadrantentore in das Dashboard. Wählen Sie Excel-Export und klicken Sie auf Tabelle erstellen. Speichern Sie die generierte Tabelle gemäß den Namenskonventionen für lokale Dateien. Um Darstellungen von Plots und Gating-Strategien zu exportieren, klicken Sie auf das Symbol Layout-Editor . Wählen Sie jede Population aus und ziehen Sie sie mit den erforderlichen Achsen, Beschriftungen und Abständen in den Editor. Um ein Layout mit den gleichen Diagrammen zu erstellen, die für alle Proben angezeigt werden, wählen Sie eine Spalte aus und drücken Sie auf Batch. Drücken Sie auf Auf Breite skalieren und dann auf Seitenumbrüche vermeiden. Speichern Sie im gewünschten Dateiformat. Berechnen Sie in der exportierten Tabelle das Restriktionsverhältnis, indem Sie Spalten mit prozentualen RFP von YFP-ves (RFP+ve / (double negatives + RFP+ve)) und prozentualen RFP von YFP+ves (double positives / (double positives + YFP+ve)) und dann eine letzte Spalte von (%RFP of YFP+ve / %RFP of YFP-ve) generieren, siehe Abbildung 1. Mittelwert der Replikationsdaten für jedes SAMHD1-Konstrukt und berechnen Sie, ob sich die Restriktionswerte für getestete SAMHD1-Varianten signifikant von Wildtyp- und/oder 206-7AA-Varianten unterscheiden, wobei eine geeignete Datenanalysesoftware verwendet wird.