ヒト骨髄性U937細胞におけるフローサイトメトリーによるSAMHD1制限の解析

このプロトコルには、著者のいずれかが実施した動物または人間の参加者を対象とした研究は含まれていません。このプロトコルのすべてのステップは、それらが実行された機関のガイドラインと実践規範に従って実行されました。 1. VLP産生のための293T細胞のトランスフェクション(SAMHD1発現ベクターとテスターHIV粒子の両方) 注:ウイルス粒子の生産を成功させるための最も重要な要因は、生産者293T細胞の健康状態、トランスフェクション時のコンフルエンシー、および収穫時期です。ラボには通常、レトロウイルス粒子産生のための好ましいトランスフェクション試薬とプロトコルがあります。以下のプロトコルは良質の感染性粒子を生成しますが、同等のプロトコルもこのアプリケーションに適しています。良好な品質の293T細胞を維持するために、一定の増殖速度を維持するために少なくとも週に3回継代する。細胞は、効率的なトランスフェクションのために増殖の対数期に播種する必要があります。 1日目:293T細胞のほぼコンフルエントなディッシュから1/4分割して、必要な数の10 cmディッシュに播種し、翌日に約60%のコンフルエンシーを生成します(約5 x 105 セル/ mL)。新しい細胞ストックを扱う場合、翌日のトランスフェクションに適した密度を達成するために、いくつかの密度を播種する必要がある場合があります。 2日目(午前):顕微鏡検査で約60%のコンフルエントを確認し、細胞上の培地を10 mLの新鮮なダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で穏やかに交換します。 2日目(午後、培地交換後少なくとも4時間):VLP制作のためのトランスフェクト。600 μLの無血清DMEMに、 ギャグポル エクスプレッサープラスミド、長末端リピート(LTR)駆動レポータープラスミド、水疱性口内炎ウイルスGタンパク質(VSV-G)発現プラスミド(合計9 μg、注を参照)をそれぞれ3 μg含むDNA希釈ミックスを構成します。渦と遠心分離機を短時間(15秒、>500 x g)。 20 μLのトランスフェクション試薬( 材料の表を参照)、ボルテックス(遠心分離しない)を加え、20°Cで15〜20分間インキュベートします。トランスフェクションミックスをプレートに滴下し、穏やかに旋回させて混合し、インキュベーターに戻します。注:SAMHD1を発現するMLV VLPには、KB4 5,6(gag-polエクスプレッサープラスミド)、pLGatewaySAMHD1IeYFP1(LTR駆動レポータープラスミド)、およびpczVSV-G7を使用してください。HIV-RFP VLP には、p8.91 8,9 (gag-pol expressor プラスミド)、SCRPSY10 (LTR 駆動レポータープラスミド)、および pczVSV-G を使用してください。代替案については、材料の表で説明します。プラスミド比は、異なるプラスミド/トランスフェクションシステムに合わせて最適化する必要がある場合があります。 3日目(深夜):ピペッティングで細胞から培地を注意深く取り出し、5 mLの新鮮なDMEMで洗浄し、5 mLの新鮮なDMEMと交換します。 4日目(朝):細胞から上清を集めてウイルスを回収し、5mLの新鮮なDMEMと交換します。VLP含有上清を0.45 nmフィルターに通し、分注して-70°Cに移して保存します。アリコートが計画された実験に適したサイズ(提案として250 μL)であることを確認してください 凍結融解サイクルを繰り返すとウイルス力価が失われるため。 5日目(午前):1.5のようにウイルスを採取しますが、上清を採取した後はプレートを廃棄します。 2.使用前に新しいVLPを滴定する 1日目:24ウェルプレートの2 x 105 細胞/ウェルで293Tを播種-滴定するウイルス当たり4ウェル、各骨格に対する既知の感染力のウイルスを含む。特定の細胞ストックの播種密度を最適化します。 2日目:プレートを観察してコンフルエンシーを確認します(理想的には~70%)。手順1.5および1.6のウイルス含有上清を解凍します。各ウェルに0、10、25、または100 μLを加えます。 4日目(午前):フローサイトメトリーによる分析のために細胞を回収します。注意深いピペッティングまたは吸引によってメディアを取り外します。250 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を穏やかに洗浄します。250 μL PBSで上下にピペッティングしてプレートから細胞を取り除き、マイクロ遠心チューブに移します。250 μLの4%パラホルムアルデヒドを加えます(最終濃度を2%にします)。注意:パラホルムアルデヒドは有毒です。塩素系消毒剤と混合しないでください。 500 x g で5分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を廃棄して、細胞ペレットを200 μLのPBSまたは代替フローサイトメトリーバッファーに再懸濁します。必要に応じて、フローサイトメトリーでRFPまたはYFPを分析します。特定のウイルス株の感染力を、既知の感染力の株の値に対して正規化します。注:VLPは、p24酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によっても正規化できます。ただし、これは必ずしもVLP感染力の良い指標ではなく、特にVLPストックが異なるトランスフェクションで調製されている場合です。公表されている中央組織培養感染量または感染多重度(TCID50/MOI)法11 も相対定量を提供することができるが、これらはMLVについては十分に確立されていない。相対蛍光は、市販の逆転写酵素ELISA法に代わる費用対効果の高い代替手段を提供します。 3. SAMHD1およびYFPを発現するVLPによるU937の形質導入 注:ステップ3〜6は、制限実験を構成します。計画を容易にするために日数が付けられています。 1日目(午後):MLV-野生型SAMHD1-YFP(陽性対照)、MLV-SAMHD1(HD206-7AA)-YFP(陰性対照)、変異型MLV-SAMHD1-YFP(実験サンプル)を含む形質導入のためにVLPを解凍します。マイクロフュージチューブ内のロズウェルパーク記念研究所1640培地(RPMI)で正規化VLPを最終容量500 μLに希釈し、0.5 μLのポリブレン(10 mg / mL)を加え、フリックして混合します。VLPを事前に滴定できない場合は、最初に100 μLを使用してください。VLPとRPMIの比率を最大1:1にして、VLP誘発毒性を制限します。約30%の形質導入を目指します。 5 x 105 U937細胞を、形質導入条件ごとに滅菌マイクロフュージチューブに分注します。ペレットを500 x g で5分間遠心分離することにより、上清を除去した(フローサイトメトリー用の形質導入されていない対照として2つの追加のチューブを含む)。細胞ペレットを500 μLの希釈VLP(または形質導入されていないコントロールの場合はRPMI)に再懸濁し、24ウェルプレートの1ウェルに移します。 卓上遠心分離機で800 x g 、20°Cで90分間スピンします。 1 mLの37°C RPMIをウェルに加え、37°Cのインキュベーターで3日間回収します。 4. 形質導入型U937の分化 4日目(午前):穏やかにピペッティングして細胞を再懸濁し、350 μLを12ウェルプレートの4つのウェルのそれぞれに移します。150 nM PMAを含む37°C RPMIを700 μLずつ各ウェルに加え、最終濃度100 nMとし、3日間分化させます。注:PMAは粉末として購入され、DMSOで1 mMに再懸濁し、暗所で保管する必要があります。100 μMの作業ストックは、1 mMストックから1/10をDMSOで希釈することによって調製する必要があります。 5.分化したSAMHD1発現U937のHIV-RFP感染 7日目:顕微鏡で細胞を観察します。細胞が接着していることを確認します。すべてのウェルから培地を吸引し、4つの各セットのウェル1に1 mLのRPMIを追加して、形質導入されていない、感染していないコントロールとシングルカラーコントロールを可能にします。約10 μLのHIV-1-RFP(ガイドとして約10 ng p24)を含む0.5 mLのRPMIを他のすべてのウェルに戻します。約50%の感染を目指します。 8日目(朝):感染した各ウェルに0.5 mLのRPMIを追加します。 6. フローサイトメトリー解析 注:フローサイトメトリーパイプラインに生死染色剤を含めることをお勧めします。ただし、U937細胞の品質が良好な場合は、ダウンストリーム分析に悪影響を与えることなく、このステップを省略できます。トリプシン処理された細胞の穏やかなピペッティングは、単一の細胞懸濁液を容易にするはずです。 10日目(午前):ウェルから培地を吸引し、PBSで1回洗浄します。300 μLの細胞解離酵素(またはトリプシン)を5〜10分間加えます。さらに300 μLのPBSを追加し、すべての細胞がプレートから外れたことを確認して完全に再懸濁し、フローサイトメトリーチューブに移します。 300 μLの4%パラホルムアルデヒドを加えます(最終濃度を2%にします)。500 x g で5分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を廃棄して、細胞ペレットを200 μLのPBSまたは代替フローサイトメトリーバッファーに再懸濁します。フローサイトメトリーで分析します。注:以下の手順はFortessa分析装置用ですが、RFPおよびYFP蛍光を読み取ることができる任意の分析装置を使用して同等の分析を実現できます。フローサイトメトリー分析を設定する前に、地域のフローサイトメトリーサポートまたは他の経験豊富な研究者に相談してください。同時に多くのサンプルをスクリーニングする必要がある場合は、ハイスループットサンプラーが適切な場合があります。この場合、より大きなセル数と体積が推奨されます。 7. フローサイトメトリー解析 必要になる10分前にサイトメーターの電源を入れ、コンピューターの電源を入れます。廃棄物が空であり、シースタンクがいっぱいであることを確認してください。 マシンにログインし、解析ソフトウェアを開きます。 アームを横に動かし、ウォーターチューブを外し、流量を 高 に設定して プライムを押します。ライトが消えるのを待って、さらに3回繰り返します。 水を戻し、3分間ハイで走らせてから、 ロー に切り替えて、取得に進むまで スタンバイ を押します。 その間、ソフトウェア内で実験を設定します。[実験] / [新しい実験] を選択します (地域のガイダンスに従って名前が付けられます)。インスペクターで、不要な蛍光色素を削除し、青色レーザー530/30と黄色レーザー610/20、またはマシンのYFPとRFPに推奨されるレーザーとフィルターの組み合わせを残します。 実験を右クリックし、[サイトメーター設定]/[ アプリケーション設定]/[ワークシートの作成]を選択します。ワークシートで、対応するアイコンをクリックし、軸ラベルをクリックして軸を変更して、前方散乱面積(FSC-A)/側方散乱領域(FSC-A)ドットブロットとYFPヒストグラム、RFPヒストグラム、およびGFP / YFPドットブロットを作成します。 実験をもう一度右クリックして、新しい標本を追加します。必要に応じて名前を変更します。プラス記号をクリックして試験片を開き、新しいチューブを表示します。 Viewから取得ダッシュボードを開き、感染していないトランスデュースされていないコントロールをロードして、[取得]を押します。ダッシュボードでFSC電圧とSSC電圧を調整して、セルを左下の象限に配置します(軸にセルはありません)。この人口P1の周りのゲート。他のプロットを右クリックし、P1を表示を選択して、後続の解析から破片を除去します。 YFP用の単色コントロール(野生型SAMHD1のみ)をロードして取得します。ダッシュボードのYFP電圧を調整して、ほとんどの蛍光セルが検出器の範囲内(軸の端ではない)になるようにします。単色 RFP コントロールについても繰り返します。 変換されていない、感染していない、単色のコントロールを使用して自動補正を実行します。メニューから [補正設定>実験] > [補正コントロールの作成 ] を選択して、通常のワークシートに切り替えます。染色されていない通常のワークシートを選択し、 染色 されていないコントロールの実行と取得を押します。 無傷のセル(P1)の周りにゲートを描き、記録します。チューブを取り外し、マシンを スタンバイ状態にします。 P1を右クリックし、[ すべての報酬コントロールに適用]をクリックします。 RFP 標準ワークシートに切り替えて、[ 実行] を押します。単色 RFP コントロールを記録し、マシンをスタンバイ状態にします 。 ソフトウェアは、陽性の母集団を自動的に選択する必要があります。 YFPシングルカラーコントロールについても繰り返します。[ 補正設定>実験] > [補正の計算] > リンクして保存 を選択します。 グローバル ワークシートに切り替えます。HIV-RFPに感染した野生型SAMHD1で形質導入された細胞を取得し、YFPとRFPでそれぞれ垂直方向と水平方向に整列した象限の隅に4つの異なる集団が見られることを確認します。チューブを取り外し、 スタンバイを押します。 トランスデュースされていない、感染していないサンプルをリロードし、 実行 を押して、P1を停止ゲートとして30,000イベントを 記録 します。残りのサンプル(他のコントロールを含む)についても繰り返します。実行中または 事後サンプルの名前を変更します。一度エクスポートすると、ファイルの名前を変更することはできません。 データを .fcs ファイルとしてエクスポートし、ローカルの指示に従って流路系をクリーニングします。 8.データ分析 注: 以下の手順は、FlowJo v10 での分析に対応しています。ただし、同等の手順は、他の分析ソフトウェアでも簡単に実行できます。 ソフトウェアを開き、すべての.fcsファイルをダッシュボードにドラッグします。報酬コントロールを選択し、補正サブフォルダーにドラッグします。トランスデュースされていない、感染していないチューブのファイルをダブルクリックすると、FSC-A / SSC-Aプロットが表示されます。 ポリゴン ツールを選択し、左下隅の破片を除く無傷のセル集団にゲートします。このセルに名前を付けます。このゲートを「 すべてのサンプル 」バーのチューブの母集団全体にドラッグします。水平矢印ボタンを使用して個々のサンプルをスクロールし、ゲーティングが各チューブに適していることを確認します。 形質導入されていない、感染していないサンプルの 細胞 集団をダブルクリックし、軸をFSC高さ(H)とFSC面積(A)に調整します。ダブレットを除外するには、長方形のゲートを使用して単一の大きな母集団を選択します。ソフトウェアは自動的にこの単一セルに名前を付けることを提案します。 このゲートをすべての 細胞 集団にドラッグし、ゲーティングがすべてのサンプルに適していることを確認します。感染していない、形質導入されていないサンプルの 単一細胞 集団を選択し、軸を補正された青色レーザー(y 、YFP)と補償された黄色レーザー(x、 RFP)に変更します。軸上で T キーを押し、x と y の [双指数スケール ] を選択します。 象限ゲーティングツールを選択し、負の細胞集団の右上端をクリックします。この予備ゲーティングをすべての単一細胞集団に適用するには、すべてのサンプルバーにドラッグします。象限ゲートが母集団を十分に分離しない場合は、図 2 のように、ポリゴン ツールを使用して個々の象限をゲートする必要がある場合があります。 野生型SAMHD1のみのサンプル(YFPのみ)までスクロールし、非転写(YFP陰性)とYFP陽性の間のゲーティングが正しいことを確認します。輪郭図に切り替えて、陰性と薄暗いYFPセルを区別するのに役立つ場合があります。最上部のYFP + veセルが大きく広がっている場合は、垂直上部のゲートを右に調整します。 すべてのサンプルをスクロールして、YFP陽性率に関するゲーティングを確認します。すべてのサンプルに有効なYFP陰性と正の間の最良の分割を使用します。注:補償は、野生型SAMHD1 YFP発現レベルに基づいて計算されます。異なるSAMHD1-YFP形質導入細胞間で感染レベルが大きく異なる場合は、補償を調整する必要があるかもしれません。したがって、YFP VLPは使用前に正規化することが好ましい。 形質導入されていないHIV-RFP感染チューブまでスクロールし、感染していないRFP陰性と感染したRFP陽性の間のゲーティングが正しいかどうかを確認します。必要に応じて等高線ビューを使用して調整し、残りのサンプルをスクロールして、ゲーティングがすべてのサンプルに対して有効であることを確認します。 各サンプルには、ダブルネガティブ(Q4:左下、形質導入されていない、感染していない)、YFP陽性(Q1:左上、SAMHD1発現、感染していない)、RFP陽性(Q3:右下、形質導入されていない、HIV感染)、およびダブルポジティブ(Q2:右上、SAMHD1発現HIV感染)が必要です。アイコンをクリックしてテーブルエディタを開き、4つの象限ゲートをダッシュボードにドラッグします。 [Excelエクスポート ]を選択し、[ テーブルの作成]をクリックします。生成されたスプレッドシートをローカルファイルの命名規則に従って保存します。 プロットとゲーティング戦略の表現をエクスポートするには、 レイアウトエディタ アイコンをクリックします。各母集団を選択し、必要な軸、ラベリング、間隔を指定してエディターにドラッグします。 すべてのサンプルに対して同じプロットが表示されているレイアウトを作成するには、1つの列を選択して バッチを押します。[ 幅に合わせて拡大縮小 ]を押してから、 改ページを避けます。必要なファイル形式で保存します。 エクスポートしたスプレッドシートで、YFP-ves のパーセンテージ RFP の列 (RFP+ve / (二重否定 + RFP+ve)) と YFP+ves のパーセント RFP (二重陽性 / (二重陽性 + YFP+ve)) の列を生成し、次に (YFP+ve の %RFP / YFP-ve の %RFP) の列を生成して、制限率を計算します ( 図 1 を参照)。各SAMHD1コンストラクトの複製データを平均し、適切なデータ分析ソフトウェアを使用して、テストされたSAMHD1バリアントの制限値が野生型および/または206-7AAと有意に異なるかどうかを計算します。