Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Hannes Feyrer; Judith Schlagnitweit; Katja Petzold

doi:10.3791/62470

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生物化学

Praktische Aspekte der Probenvorbereitung und des Aufbaus von ¹H R_1ρ Relaxationsdispersionsexperimenten von RNA

Published: July 09, 2021

doi:

10.3791/62470

Hannes Feyrer¹, Judith Schlagnitweit¹, Katja Petzold¹

¹Department of Medical Biochemistry and Biophysics,Karolinska Institutet

Summary

Wir präsentieren ein Protokoll zur Messung der Mikro- bis Millisekundendynamik auf ¹³C/¹⁵N-markierter und unmarkierter RNA mit ¹H R_1ρ Relaxationsdispersion Kernspinresonanzspektroskopie (NMR). Der Fokus dieses Protokolls liegt in der hochreinen Probenvorbereitung und dem Aufbau von NMR-Experimenten.

Abstract

RNA ist ein hochflexibles Biomolekül, bei dem Veränderungen in Strukturen eine entscheidende Rolle bei den Funktionen spielen, die RNA-Moleküle als zelluläre Botenstoffe und Modulatoren ausführen. Während diese dynamischen Zustände den meisten strukturellen Methoden verborgen bleiben, ermöglicht die _R1ρ Relaxation Dispersion (RD) Spektroskopie die Untersuchung der Konformationsdynamik im Mikro- bis Millisekundenbereich bei atomarer Auflösung. Die Verwendung von ¹H als beobachteter Kern erweitert das abgedeckte Zeitregime weiter und ermöglicht den direkten Zugang zu Wasserstoffbrückenbindungen und Basenpaarungen.

Die herausfordernden Schritte in einer solchen Studie sind die hochreine und ertragreiche Probenvorbereitung, potenziell ¹³C- und ¹⁵N-markiert, sowie der Aufbau von Experimenten und die Anpassung von Daten zur Extraktion von Population, Wechselkurs und Sekundärstruktur des zuvor unsichtbaren Zustands. Dieses Protokoll bietet entscheidende praktische Schritte bei der Probenvorbereitung, um die Vorbereitung einer geeigneten RNA-Probe und den Aufbau von 1 H R_{1ρ-Experimenten} mit isotopisch markierten und unmarkierten RNA-Proben sicherzustellen.

Introduction

RNAs erfüllen eine Vielzahl von regulatorischen^1,katalytischen²und strukturellen³ Funktionen in der Zelle, von denen viele mit einer flexiblen molekularen Struktur und komplizierten Veränderungen dieser Strukturen korrelieren⁴^,⁵^,⁶^,⁷. Dünn besiedelte Zustände bleiben für die meisten Methoden der Strukturbestimmung unsichtbar oder erlauben nicht die Untersuchung dieser verborgenen Zustände bei hoher atomarer Auflösung. Die NmR-Spektroskopie (Solution-State Nuclear Magnetic Resonance) kombiniert beide Aspekte, indem sie Zugang zu einzelnen Atomkernen bietet und eine große Toolbox von Experimenten bietet, die auf die Dynamik durch alle Zeitregime abzielen⁸. RD-NMR-Experimente ermöglichen den Zugang zum Konformationsaustausch in der Mittleren Zeitskala, wobei Änderungen der Basenpaarungsmuster und lokale strukturelle Umlagerungen zu erwarten sind⁵^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴. RD-Experimente werden als lange _R2-Messungen in Form eines Carr-Purcell-Meiboom-Gill-Pulsstrangs¹⁵ oder als Relaxationsmessungen im rotierenden Rahmen,_R1ρ RD-Experimente¹⁶genannt, durchgeführt.

Obwohl beide verwendet werden können, um population und Wechselkurs- und chemische Verschiebungsdifferenz zum Nebenzustand zu extrahieren, geben R_1ρ RD-Experimente auch das Zeichen der chemischen Verschiebungsdifferenz des angeregten Zustands. Dies ermöglicht einen Rückschluss auf die Sekundärstruktur, die stark mit der chemischen Verschiebung in RNA-Strukturen korreliert¹⁷. Die chemische Verschiebung ist ein guter Indikator für die Hälikizität bei aromatischen Protonen und Kohlenstoffen auf den Nukleobasen, von Basenpaarpartnern für Imino-Protonen und von Zuckerpuckern an den C4′- und C1′-Atomen¹⁸^,¹⁹. Es sei darauf hingewiesen, dass kürzlich ein CEST-Experiment (Chemical Exchange Saturation Transfer) mit höherer Spin-Lock-Leistung (SL) veröffentlicht wurde, wodurch die Anwendbarkeit des CEST-Experiments auf schnellere Austauschzeitskalen verschoben wurde, als Alternative zum _R1ρ RD-Experiment für Systeme mit einem angeregten Zustand.

Obwohl ¹³C- und ^15-N-Isotopeoft für den Zugang zum strukturellen Austausch verwendet wurden, verwendeten neuere Arbeiten aus diesem Labor aromatische und Imino-Protonen als Sonden für den Konformationsaustausch⁹^,¹⁰. Die Verwendung von ¹H als beobachteter Kern bringt mehrere Vorteile mit sich, zum Beispiel den Zugang zum Austausch auf immer langsameren Zeitskalen, eine höhere Empfindlichkeit und kürzere Messzeiten. Dies wird durch den SELOPE-Ansatz (SELective Optimized Proton Experiment) erleichtert, der den Zugang zu aromatischen Protonen durch Entkrümung des eindimensionalen (1D) Spektrums mit homonukleären Skalarkopplungen anstelle eines heteronuklearen Magnetisierungstransfers ermöglicht und die Notwendigkeit von Isotopenmarkierungen^{eliminiert 20}. Dieses Protokoll adressiert die Messung in ¹H R_1ρ RD Experimenten von einheitlich ¹³C/15 N-markierten und unmarkierten Proben. Daher stellt dieser Artikel eine Probenvorbereitungsmethode vor, die sich als die vielseitigste für verschiedene Probenvorbereitungsanforderungen²¹ erwiesen hat, und diskutiert Alternativen im letzten Abschnitt dieses Artikels (Abbildung 1).

An dieser Stelle sollte der Leser beachten, dass andere Probenvorbereitungstechniken für 1 H R ^1ρRD-Experimente akzeptabel sind und dass andere Methoden der Struktur- und Funktionsanalyse mit den mit der vorgestellten Technik_{synthetisierten} Proben durchgeführt werden können. ¹ H R_1ρ RD-Experimente erfordern hohe RNA-Konzentrationen (idealerweise >1 mM) sowie eine hohe Homogenität, sowohl in der RNA-Länge als auch in der strukturellen Konformation, um eine zuverlässige Charakterisierung der Molekulardynamik zu gewährleisten. Die In-vitro-Transkription (IVT) ist für viele Forscher die Methode der Wahl, um ¹³C /¹⁵N-markierte RNA-Proben herzustellen, da markierte Nukleosidtriphosphate (NTPs) verfügbar sind und die enzymatische Reaktion leicht eingebaut wird²². Die weit verbreitete T7-RNA-Polymerase (T7RNAP)²³^,²⁴^,²⁵ leidet jedoch bei bestimmten Initiationssequenzen 26^,²⁷ unter einer geringen 5′-Homogenität und oft auch unter 3′-Homogenität während des Transkriptionsabflusses^28. Die Reinigung der Ziel-RNA-Spezies wird aufgrund des Bedarfs an großen Mengen von ~200 nmol teurer und mühsamer. Die hier verwendete Methode wurde bereits vorgestellt, wo die Vorteile im Großen und Ganzen diskutiert wurden²¹. Kurz gesagt, es löst beschriebene Probleme, indem es ein größeres Tandem-Transkript transkribiert, das dann von Escherichia coli RNase H ortsspezifisch gespalten wird, geleitet von einem chimären Oligonukleotid²⁹^,³⁰ (siehe Abbildung 2 für Details).

Die Einarbeitung einer Abstandssequenz an den Enden 5′ und 3′ des Tandem-Transkripts ermöglicht die Verwendung einer hochertragreichen Initiationssequenz und die Entfernung von Terminalüberhängen in der Nähe der Linearisierungsstelle der Plasmidschablone (Abbildung 2B). Es wurde gezeigt, dass die Methode die Ausbeute signifikant verbessert und gleichzeitig Kosten und Arbeit reduziert, mit dem Vorbehalt einer komplexeren Vorlagensynthese und der Notwendigkeit eines zusätzlichen Enzyms und Oligonukleotids. Die hohe Spezifität der RNase H-Spaltung erleichtert die Reinigung aufgrund des Mangels an RNA-Spezies in einem ähnlichen Größenbereich. Das vorliegende Protokoll verwendet einen Ionenaustausch-Hochleistungsflüssigkeitschromatographieschritt (HPLC), der kürzlich von diesem Labor³¹veröffentlicht wurde, obwohl andere Methoden mögliche Alternativen sind. ¹ H_R1ρ RD kann im Allgemeinen an markierten oder unmarkierten Proben mit zwei jeweiligen Pulssequenzen erfasst werden, dem “markierten” 1 H R_1ρ heteronukleären Einzelquantenkorrelationsexperiment (HSQC) mit einer ¹³C indirekten Dimension¹⁰ und dem “unmarkierten” ¹H R_1ρ SELOPE-basierten Experiment mit einer ¹H indirekten Dimension^20.

Diese zweidimensionalen (2D) Experimente können als erste Kontrolle dienen, unabhängig davon, ob Dynamik auf der _{R1ρ-Zeitskala} in der Probe vorhanden ist. Es kann ein Überblick über RD für alle aufgelösten Peaks in den Spektren erhalten und Peaks identifiziert werden, die für eine gründlichere RD-Analyse von Interesse sind. Das bedeutet, dass auch unbeschriftete Proben überprüft werden können, bevor die Entscheidung getroffen wird, eine teurere, etikettierte Probe herzustellen. Sobald ein Peak mit Konformationsaustauschbeitrag ausgewählt wurde, um gründlicher untersucht zu werden, ist es am besten, zu den 1D-Versionen der oben genannten Experimente zu wechseln (wenn der Peak noch aufgelöst werden kann), um sogenannte Off-Resonanz-Experimente durchzuführen. Für die markierte Version wird der HSQC-Transfer auf ¹³C durch einen selektiven heteronuklearen Kreuzpolarisationsschritt (HCP) ersetzt, wie er in ^{den 13}C R_1ρ Experimenten³²^,³³^,³⁴^,³⁵verwendet wird, während im Falle des SELOPE-Experiments das Experiment einfach als 1D ausgeführt wird, was besonders nützlich für H8- und H2-Signale ist, die ohnehin auf der Diagonale im 2D liegen. Ein Kriterium, welche Sequenz zu verwenden ist, vorausgesetzt, dass sowohl eine markierte als auch eine unmarkierte Probe zur Verfügung stehen, ist, wie gut isoliert der Peak of Interest in den beiden Experimenten ist.

Generell wird das SELOPE-Experiment für RNA-Proben mit bis zu 50 Nukleotiden empfohlen. Bei größeren RNAs wird die Überlappung größer sein; Strukturell interessante Nukleotide treten jedoch häufig in chemischen Verschiebungsbereichen auf, die sich weniger überlappen und in noch größeren RNAs noch zugänglich sein könnten. Ein weiteres Argument wäre, dass in unmarkierten Proben keine ^J-Kopplungzwischen 1 H und ¹²C auftritt. Da die minimale Spin-Lock-Leistung jedoch durch die minimale Leistung definiert wird, die verwendet wird, um diese beiden Spins (~ 1 kHz) im markierten Experiment zu entkoppeln, ermöglicht das unbeschriftete Experiment die Verwendung eines breiteren Spektrums von Spin-Lock-Stärken (SL) und damit den Zugang zu einer breiteren Zeitskala des Austauschs. Diese Off-Resonanz-Experimente liefern zusätzliche Informationen zu k_ex, wie z.B. Population des angeregten Zustands (alternativer Konformer), p_ES, sowie sehr wertvolle chemische Verschiebungsinformationen in Form von Δω (die chemische Verschiebungsdifferenz des Grundzustands und des angeregten Zustands).

Abbildung 1: Workflow des dargestellten Protokolls. Vorbereitung vor der eigentlichen Großprobenproduktion, bestehend aus Vorlagenvorbereitung und Bestätigung der erfolgreichen In-vitro-Transkription und RNase H-Spaltung. Großserienproduktion einschließlich HPLC-Reinigung, Befüllung des NMR-Röhrchens und Bestätigung der RNA-Faltung. Im Falle einer isotopenmarkierten Synthese sollte noch am selben Tag eine nicht markierte Aufreinigung zur Gradientenoptimierung durchgeführt werden. NMR-Charakterisierung der Konformationsdynamik mit _{R1ρ-Experimenten.} Jeder Schritt kann unabhängig voneinander durchgeführt werden, z.B.kann die ¹H_R1ρ RD-Analyse auf jede geeignete RNA-Probe angewendet werden, die mit einer anderen Methode hergestellt wurde. Abkürzungen: IVT = in vitro transkription; HPLC = Hochleistungsflüssigkeitschromatographie; NMR = Kernspinresonanz; RD = Relaxationsdispersion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ziel dieses Protokolls ist es, praktische Details und kritische Parameter für die Untersuchung der Konformationsdynamik mit 1 H _R1ρ Relaxationsdispersion in RNA-Haarnadelmolekülen bereitzustellen. Nach der Bereitstellung eines detaillierten Protokolls des Designs, der Synthese und der HPLC-Aufreinigung einer Ziel-RNA, die mit allen, einigen oder keinem NTPs als ¹³C /¹⁵N-markierte Versionen durchgeführt werden kann, wurde der Workflow der Fertigstellung der NMR-Probe und der Bestätigung des Konformationsaustauschs mit NMR-Spektroskopie beschrieben. Abschließend werden die Details für den Aufbau von ¹H R_1ρ RD Experimenten auf einem Bruker NMR Spektrometer beschrieben (Abbildung 1). Das Protokoll enthält jeden Schritt zur Einrichtung der 1D-Version für beschriftete Muster und zusätzliche Kommentare sowie eine Tabelle zum Anpassen für die Einrichtung der SELOPE-Version (Tabelle 2). Nach dem Protokoll werden kritische Schritte und alternative Wege zur Probenvorbereitung und ¹H R_1ρ RD-Einrichtung besprochen.

Protocol

Abbildung 2: Schematische Darstellung des berichteten Tandem-IVT-Protokolls. (A) Tandem-Transkription aus einer linearisierten Plasmid-Vorlage mit T7RNAP (links) und sukzessive Spaltung des Transkripts durch RNAse H zur Erreichung der Ziellängen-RNA, gesteuert durch einen chimären DNA-Guide (rechts). (B) Detailliertes Schema der Tandemvorlage beginnend mit dem viralen T7RNAP-Promotor, einer Initiationssequenz. Die Zielsequenz (dunkelblau, Beispiel hier ist 20 nt lang) wird “n” mal wiederholt. Die Wiederholungen werden von einer 5′- und 3′-Abstandssequenz flankiert, die aus den letzten acht bzw. den ersten vier Nukleotiden besteht, um die Entfernung der Initiations- und Restriktionssequenzen aus der ersten und letzten Wiederholungseinheit zu ermöglichen. (C) Hybridisierung des Tandem-Transkripts (rot) und der chimären Spaltführungen (grün). RNase H spaltet die RNA entgegengesetzt zum DNA 5′-Ende. Die 2′-OMe-RNA-Flanken erhöhen die Spezifität, indem sie die Bindungsaffinität des Spaltungsleitfädens zur Ziel-RNA erhöhen. Diese Zahl wurde von 21geändert. Abkürzungen: T7RNAP = T7 RNA Polymerase. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 1. Vorbereitung der Arbeit für ein neues RNA-Konstrukt Plasmiddesign und -aufbereitung Schreiben Sie die Vorlagensequenz in ein Klonwerkzeug, z. B.Serial Cloner. Nehmen Sie die T7-Promotor-Sequenz und fügen Sie eine High-Yield-Initiationssequenz hinzu (T7: 5′-TAATACGACTCACTATA ^GGGAGA-3′).HINWEIS: Die Transkription beginnt an dem Nukleotid, das mit einem Caret (^) angegeben ist. Die Initiationssequenz GGGAGA ist variabel, aber stark sequenzabhängig; Daher wird die Verwendung dieser Sequenz empfohlen. Fügen Sie die letzten 8 Nukleotide (nt) der Zielsequenz als 5′-Abstandhalter (5’S) hinzu. Fügen Sie Wiederholungen der Zielsequenz (TS) hinzu. Fügen Sie die ersten vier Nukleotide als 3′-Abstandhalter nach den Wiederholungen (5’S) hinzu. Fügen Sie eine BamHI-Einschränkungswebsite (RS) oder eine ähnliche eindeutige Einschränkungswebsite hinzu.HINWEIS: Die gezeigte Gesamtsequenz wird ineinem bakteriellenHigh-Copy-Plasmid(z. B.pUC19) geklont oder leicht geordnet: 5′-T7-5’S-(TS) n -3’S-RS-3′ (Abbildung 2B). Die Anzahl der Wiederholungen sollte so hoch sein, wie es die Gensynthese erlaubt (maximal 600 nt in diesem Protokoll). Verstärken Sie das Plasmid in E. coli mit einem kommerziellen Kit. Linearisieren Sie das gereinigte Plasmid bei 20 ng/μL unter Verwendung der entsprechenden Restriktionsstelle. Skalieren Sie die Restriktion mit BamHI um bis zu 1 ml. Reinigen Sie das verdaute Plasmid und bestätigen Sie die erfolgreiche Linearisierung auf einem 1% igen Agarosegel. Lagern Sie das linearisierte Plasmid bei -20 °C für mehrere Monate. Design der Spaltführung (Abbildung 2C) Schreiben Sie die letzten acht Nukleotide der Ziel-RNA-Sequenz in die 5′-3′-Richtung und fügen Sie die ersten vier Nukleotide der Ziel-RNA-Sequenz am 3′-Ende ebenfalls in 5′-3′-Richtung hinzu. Generieren Sie das umgekehrte DNA-Komplement dieser Sequenz Ändern Sie die ersten und letzten vier Nukleotide in ihre 2′-OMe-Modifikationen, indem Sie vor dem Nukleotidbuchstaben ein “m” hinzufügen.HINWEIS: Für die Synthese wird mU anstelle von mT verwendet. Bestellen Sie das Oligo mit Standard-Entsalzungsreinigung.HINWEIS: Überprüfen Sie, ob das erzeugte Oligo an einer anderen Stelle als der Verbindung von zwei RNA-Sequenzen binden könnte. Volle Komplementarität in den zentralen vier DNA-Nukleotiden ist erforderlich, während die flankierenden Regionen eine Diskrepanz zulassen könnten. Erweitern Sie bei Bedarf die Flanken auf bis zu 18 nt, um eine eindeutige Bindungssequenz36zu erzeugen. IVT in kleinem MaßstabHINWEIS: Für RNase-freies Arbeiten bereiten Sie alle Reagenzien unter sterilen und RNase-freien Bedingungen vor. Verwenden Sie RNase-Dekontaminationsreagenz (siehe Materialtabelle)und 95% v/v Ethanol, um Arbeitsflächen und Pipetten vor dem Gebrauch zu reinigen. Waschen Sie Handschuhe mit 95% Ethanol und tragen Sie fusselfreie langärmelige Kleidung. Um die RNase-Kontamination zu minimieren, atmen Sie nicht über offene Schläuche. Bereiten Sie Stammlösungen von Tris-Cl (pH 8,0), Dithiothreitol, MgCl2,Spermidin und NTPs / GMP (ungepuffert) vor. Mischen Sie Reagenzien wie in Tabelle 1 dargestellt. Bereiten Sie eine Mastermischung dieser Reagenzien im Voraus vor, bevor Sie Enzyme oder Nukleinsäuren hinzufügen.HINWEIS: Wenn Sie gefrorene Reagenzien verwenden, mischen Sie sie nach dem Auftauen gründlich. Reagenzien können ausfällt, wenn sie in zu hohen Konzentrationen gemischt werden, daher wird dringend empfohlen, die Reihenfolge in Tabelle 1zu befolgen. Fügen Sie in der folgenden Reihenfolge hinzu: Plasmid, Spaltleiter, anorganische Phosphatase (IPPase), RNase H, T7RNAP. Da die Enzymaktivität für intern hergestellte Enzyme variieren kann, testen Sie mehrere Konzentrationen, bevor Sie die beste auswählen.HINWEIS: Fügen Sie eine Negativkontrolle für die Spaltungsreaktion ein, z. B. ohne RNase H, um ein fehlendes Zielband der fehlerhaften RNase H-Spaltung und nicht der erfolglosen Transkription zuzuordnen. Inkubieren Sie die Reaktion bei 37 °C für 1 h und bestätigen Sie die Reaktion auf eine denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) (Abbildung 3A). Verdünnen Sie die Probe 10-fach in Ladelösung und laden Sie 1 μL auf das Gel.HINWEIS: Gelmischung: 8 M Harnstoff, 20% Acrylamid (19:1 Acrylamid:Bisacrylamid) in 1x FSME. Ladelösung: 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 300 μM Bromphenolblau in Formamid. Es ist nicht zu erwarten, dass die Spaltungsreaktionen von RNase H nach 1 h abgeschlossen sind, da ständig neue RNA produziert wird. Achten Sie an dieser Stelle auf ein klares Zielband und das Fehlen einer Spezies mit ähnlichem Molekulargewicht(z. B.±3 Nukleotid (nt) -Produkte). Reagenz Bestandskonzentration Menge im kleinen Maßstab (μL) H2O – 24 Tris 1 M 5 MgCl2 1 M 0.5 DTT 1 M 0.5 Spermidin 250 mM 5 GMP 100 mM 2.5 ATP 100 mM 1.5 AGB 100 mM 1.5 UTP 100 mM 1.5 CTP 100 mM 1.5 Plasmid 20 ng/μL 5 Dekolleté-Anleitung 100 μM 10 iPPase 10 mg/ml 0.5 RNase H 10 μg/ml 2 T7-RNA-Polymerase 5 mg/ml 2 Tabelle 1: Reagenztabelle für Tandem-IVT und gleichzeitige RNase-H-Spaltung. Die Lagerkonzentrationen können an die BequemlichkeitdesBenutzers angepasst werden. Wenn die RNase H-Spaltung nach T7 IVT durchgeführt werden muss, fügen Sie nach der Hitzeinaktivierung von T7RNAP einen Spaltführer und RNase H hinzu. Die verwendeten Mengen skalieren linear mit der Reaktionsskala. Abkürzungen: T7RNAP = T7 RNA Polymerase; IVT = in vitro Transkription. 2. NMR-Probenvorbereitung Skalieren Sie die Reaktion auf das gewünschte Volumen (typischerweise 10 ml) und führen Sie die Reaktion über Nacht aus. Test zum Abschluss der Reaktion am nächsten Tag mit einem denaturierenden PAGE-Gel (Abbildung 3A).HINWEIS: Eine unvollständige Spaltungsreaktion wird durch Spezies mit höherem Molekulargewicht oberhalb des Zielbandes gezeigt. Wenn die Spaltung nicht erfolgreich oder vollständig war, führen die reanneale RNA und die Spaltung im Reaktionsgefäß durch Erhitzen der Lösung in einer herkömmlichen Mikrowelle bei 450 W für 15 s. Kühlen Sie die Lösung langsam auf 37 °C für 40 min. Verwenden Sie einen Heizblock für Volumina unter 1 ml. Beachten Sie die Bildung neuer Ausfällungen. Fügen Sie weitere IPPase und RNase H hinzu und inkubieren Sie weitere 1-3 h bei 37 °C. Bestätigen Sie den Abschluss der Spaltungsreaktion mit der DenaturierungSSEITE. Wenn die RNase H-Spaltungsreaktion abgeschlossen ist, löschen Sie die Reaktion ab, indem Sie EDTA zu 50 mM Endkonzentration und Wirbel gründlich hinzufügen.HINWEIS: Die potenzielle Pyrophosphatfällung löst sich auf und neue Proteine fallen aus. Filtern Sie die Lösung durch einen 0,2 μm Spritzenfilter und konzentrieren Sie sich auf ein Volumen, das in ein HPLC-System injiziert werden kann, abhängig von der Größe der Injektionsschleife.HINWEIS: Das Protokoll kann hier durch Einfrieren der Probe bei -20 °C angehalten werden. HPLC-Reinigung im großen Maßstab Bereiten Sie die Ionenaustauschpuffer A und B innerhalb einer Woche nach der Verwendung vor. Filtern und entgasen Sie die Puffer.HINWEIS: Puffer A: 20 mM Natriumacetat; 20 mM Natriumperchlorat, pH 6,5. Puffer B: 20 mM Natriumacetat; 600 mM Natriumperchlorat, pH 6,5. Gleichgewichten Sie die Spalte mit 100% Puffer B gefolgt von 100% Puffer A für mindestens 2 Spaltenvolumina bei 75 °C. Bereiten Sie die HPLC-Sequenz (Abbildung 3B) bei einer Durchflussrate von 5,5 ml/min vor. Verwenden Sie die folgende Sequenz zur Reinigung einer RNA mit einer Größe zwischen 20 und 30 nt: 0-7 min: 0% B; 7-16 min: Steigung 0-20% B; 16-46 min: Elution, typischerweise mit einem Gradienten von 20-30% B (je nach Bedarf optimieren); 46-62 min: 100% B; 62-73 min: 0% B.HINWEIS: Eine Änderung der Durchflussrate von 5,5 auf 8 ml/min hatte keinen Einfluss auf die Trennung in diesem Protokoll. Optimieren Sie den Elutionsgradienten durch die Injektion einer Transkriptionsreaktion von 1 ml (unmarkiert) gleichzeitig.HINWEIS: Für weitere Details und Diskussionen siehe Karlsson et al.31 und Feyrer et al.21. Testen Sie die gesammelten Fraktionen auf einer denaturierenden SEITE. Wenn der Hauptelutionspeak gut isoliert ist und die reine Ziel-RNA enthält, skalieren Sie die Aufreinigung auf ein Äquivalent von 10 ml Transkriptionsreaktion. Sammeln Sie die interessierenden Bruchteile, konzentrieren Sie sich und tauschen Sie den Puffer mit dem NMR-Puffer aus. Verwenden Sie eine ultrazentrifugale Filtereinheit (siehe Materialtabelle)für Volumina über 50 ml.HINWEIS: NMR-Puffer: 15 mM Natriumphosphat; 25 mM Natriumchlorid; 0,1 mM EDTA, pH 6,5. Um den Verlust von RNA, die an Kunststoffröhrenwänden haftet, zu minimieren, waschen Sie alle Sammelröhrchen mit 1 ml Wasser, Wirbel und Zentrifuge, um die gesamte Flüssigkeit zu sammeln. Bestimmen Sie die Konzentration mittels Ultraviolettspektroskopie. Berechnen Sie die Reaktionsausbeute nach Feyrer et al21.HINWEIS: Die Konzentration einer NMR-Probe für RD-Experimente sollte nicht unter 130 nmol liegen, was 500 μM bei einem Probenvolumen von 250 μL unter Verwendung von NMR-Röhrchen entspricht (Materialtabelle). Faltung einer RNA-Probe Verdünnen und aliquotieren Sie die Probe eines Volumens von ~10 ml in 1 ml pro Röhrchen. Die RNA-Aliquoten 5 min lang auf 95 °C erhitzen. Kühlen Sie die Proben, indem Sie sie auf Eis oder in eine Wasser-Eis-Salz-Mischung legen und 30 Minuten lang inkubieren. Proben bündeln und auf ~250 μL in einer 2 mL Zentrifugalfiltereinheit konzentrieren. Befüllung eines NMR-Röhrchens Reinigen Sie das NMR-Rohr im NMR-Rohrreiniger, indem Sie es mit reichlich Wasser, RNase-Dekontaminationsreagenz, Wasser, 95% Ethanol (EtOH) und Wasser erneut spülen. Trocknen lassen. Reinigen Sie den Kolben, indem Sie mit Wasser spülen und mit RNase-Dekontaminationsreagenz und 95% EtOH mit einem fusselfreien Tuch abwischen. Trocknen lassen. Fügen Sie der NMR-Probe 10 % (v/v)D2O hinzu. Füllen Sie die RNA-Probe mit einer großen Pipettenspitze in das NMR-Röhrchen. Lassen Sie die Flüssigkeit entlang der Seite der Rohrwand fließen. Setzen Sie den Kolben ein und entfernen Sie Luftblasen, indem Sie den Kolben zusammen mit einer schnellen Drehbewegung nach unten drücken. Ziehen Sie den Kolben langsam nach oben, ohne neue Luftblasen zu erzeugen, und fixieren Sie ihn mit Paraffinwachsfilm. Bestätigen Sie das Falten per NMR.HINWEIS: An dieser Stelle ist es notwendig, eine zumindest teilweise Resonanzzuordnung durchzuführen, um die Sekundärstruktur der RNA-Probe zu bestätigen und Regionen zu identifizieren, die für die Untersuchung der Konformationsdynamik von Interesse sind. Eine erschöpfende Beschreibung der RNA-Resonanzzuordnung würde dieses Protokoll übersteigen, daher verweisen wir an dieser Stelle auf gut etablierte Literatur19,37,38. Ein elektrophoretischer Mobility Shift Assay (EMSA) kann ein hilfreicher Indikator für die RNA-Faltung sein und als ergänzende Daten für NMR-Experimente dienen. Vergleichen Sie die folgenden Spektren der Probe, für die 1H R1ρ RD-Experimente durchgeführt werden, mit der ordnungsgemäß gefalteten Referenzprobe (Abbildung 4): 1H 1D, insbesondere die Imino-Region 10–15 ppm; Aromatisch 1H,13C-HSQC; 1 H,1H-SELOPE (optional).HINWEIS: Ein aromatischer Fingerabdruck ist auch bei Übereinstimmung zwischen Imino-Signalen notwendig, da die Dimerbildung oft die gleichen oder ähnliche Imino-Signale wie eine RNA-Haarnadel zeigt. Das SELOPE-Experiment kann einen 1H,13C-HSQC für aromatische Fingerabdrücke ersetzen, da heteronukleäre Experimente an nicht markierten Proben sehr zeitaufwendig sind. Verwenden Sie die UUCG-Schleife als Fingerabdruckreferenz (falls vorhanden). Führen Sie diesen Vergleich jedes Mal durch, bevor 1H R1ρ RD-Experimente aufgezeichnet werden. 3. 1H R1ρ Relaxationsdispersion—On-Resonanz (markierte 1D-Version) HINWEIS: Die folgenden Schritte beschreiben die Einrichtung von RD-Experimenten für eine beschriftete Probe mit der 1D-Version der HSQC-basierten RD-Pulssequenz. Führen Sie die gleichen Schritte für die SELOPE-basierte 1D-Sequenz für nicht markierte Proben aus. Eine Übersicht über Parameternamen und Einstellungen für beide Fälle finden Sie in Tabelle 2. Der Fokus auf 1D-Versionen liegt darin, dass sie für Off-Resonanz-Messungen praktischer sind und der Aufbau der 2D-Versionen der SELOPE- und HSQC-basierten Experimente von Schlagnitweit et al.20 bzw. Steiner et al.10ausführlich diskutiert wurde. Bestimmen Sie 1H Leistung für einen harten 90°-Impuls (P1). Option A: Verwenden Sie den Bruker-Befehl pulsecal. Option B: Bestimmen Sie in einem zg-Experiment den 360° -Puls, indem Sie eine Nutationskurve am Protonen-Hartpulsleistungsniveau auf der Wasserspitze messen.HINWEIS: Die 90°-Pulslänge ist ein Viertel der Dauer, in der das Nullsignal beobachtet wird (wenn eine vollständige Nutationskurve gemessen wird, dann ist es die zweite Null; in der Praxis wird jedoch nur der Bereich um den Erwartungswert für den 360° abgetastet). Führen Sie ein 1H 1D-Spektrum zgesgp.f2f3dec mit der in Schritt 3.1 ermittelten Pulslänge aus, um die RNA-Faltung vor jederR1ρ-Messung zu bestätigen.HINWEIS: Wenn 1H SL-Experimente zum ersten Mal ausgeführt werden, überprüfen Sie, ob die berechnete SL-Leistung der an die Probe gelieferten Leistung entspricht, indem Sie die SL-Leistung für jede gewünschte Bandbreite kalibrieren. Detaillierte Kalibrierschritte sind in Steiner et al.10beschrieben. Erstellen Sie einen 1H R1ρ für den beschrifteten Datensatz und legen Sie Schlüsselparameter fest. Erstellen Sie ein neues Datenset. idealerweise basierend auf einem aromatischenHSQC-Datensatzvon 1 H-13C, wie er an vollständig markierten RNA-Proben für die RNA-Zuordnung verwendet wird.HINWEIS: Dadurch wird sichergestellt, dass 13C sowie 15N Strom und Entkopplungsleistung bereits eingerichtet sind. Legen Sie die allgemeinen Parameter gemäß dem ersten Teil von Tabelle 2 fest. Legen Sie RD-spezifische Parameter gemäß dem zweiten Teil von Tabelle 2 fest. Stellen Sie 1H SL-Leistung zum Testen auf den niedrigsten Wert (1,2 kHz) ein. Generieren Sie eine Test-VD-Liste mit nur einem Eintrag, 0 ms, (um die vd-Liste zu optimieren, wie in Schritt 3.4 beschrieben), legen Sie TDF1 auf 1 fest, und aktualisieren Sie D30. Führen Sie ein Testspektrum mit diesen Einstellungen aus. Optimieren Sie die vd-Liste (Liste der zu verwendenden SL-Längen). Führen Sie das Experiment mit einer Test-vd-Liste durch(z. B.sechs Einträge: 0 m, 5 m, 10 m, 20 m, 30 m, 40 m; diese Werte zu verschlüsseln, um systematische Fehler durch Erwärmung zu vermeiden). Aktualisieren Sie D30 und TDF1 entsprechend (in diesem Beispiel D30 = 42m und TDF1 = 6). Plotintensität des Peaks vs. SL-Länge. Identifizieren Sie die SL-Länge, bei der die Intensität des ursprünglichen Peaks auf 1/3 abnimmt. Erstellen Sie die endgültige vd-Liste, die im Experiment verwendet werden soll, und berücksichtigen Sie Dabei Folgendes: Bestimmen Sie die längste SL-Länge, wie im vorherigen Schritt beschrieben; Vermeiden Sie die Verwendung einer Liste mit abnehmender oder aufsteigender Reihenfolge; und fügen Sie einige Duplikate für statistische Studien hinzu. Denken Sie daran, D30 und TDF1 jedes Mal zu aktualisieren, wenn es Änderungen in der vd-Liste gibt.HINWEIS: Das Experiment wird mit unterschiedlichen SL-Längen wie in der vd-Liste angegeben in pseudo-2D-Weise ausgeführt. Wählen Sie die Anzahl der Scans aus, sodass der schwächste Peak der Liste ein Signal-Rausch-Verhältnis (SINO) von mindestens 10 aufweist.HINWEIS: Obwohl die vd-Liste für eine geringe SL-Leistung (1,2 kHz) optimiert wurde, sollte diese vd-Liste auch bei der höchsten zu verwendenden SL-Leistung(z. B.15 kHz) getestet werden. Dies liegt daran, dass der Zerfall bei hoher SL-Leistung für Spitzen mit signifikantem kEX-Beitrag viel langsamer ist. Daher sollte auch bei hoher SL-Leistung ein ausreichender Zerfall nachgewiesen werden. Parameterbeschreibung Parametername in Impulsfolge 1D beschriftet 1D SELOPE Pulsprogramm für On-Resonanz-1Ds 1HR1rho_HCP_onres1D.es 1HR1r_HH_onres1D.js 1 H-Trägerfrequenzen (ppm) O1P = Wasserresonanz in ppm O1P = chemische Verschiebung des Peak of Interest (ppm) CNST28 = chemische Verschiebung des Peak of Interest (ppm) CNST29 = Wasserresonanz in ppm 1 H harter 90º Puls P1 @ PL1 (kalibriert in 3.1.1) P1 @ PL1 (kalibriert in 3.1.1) Geformte Impulse und Kräfte zur Wasserunterdrückung P25 = 1000 us @ sp3 P12 = 2000 us @ sp1 (Watergate) (Anregungsformung) 13 C-Trägerfrequenz, On-Resonanz mit 13C chemischer Verschiebung der Peak of Interest O2P – 15 N Trägerfrequenz, durchschnittliche 15N chemische Verschiebung zur Entkopplung (wie bei aromatischem HSQC verwendet) O3P – 13 C/15N Entkopplung (Aufbau wie HSQC) pcpd2, cpd2 – pcpd3, cpd3 HCP-Übertragung (z. B. p=1/J @ 100 Hz) – die Befehle pulse und pulsef2 können verwendet werden, um die Leistungen aus harten Impulsen zu bestimmen Dauer (eingestellt auf 1/J(1 H-13C) des Peak of Interest) P11 Power 1H und Power on 13C SP1, SP12 SELOPE-Transfer (d = 1/4J(H5-H6)) – D5 Selektiver Puls (z.B. aromatischer Bereich) für SELOPE (4000 us, Eburp) – P13 & SP4 SL / RD-spezifische Parameter: 1 H SL-Leistung, die aus kalibrierten harten Impulsen gewonnen wird (z. B. mit dem Impulsbefehl). Pl25 & CNST12 (1,2 – 15 kHz) Pl24 (50 Hz – 15 kHz) Variable Verzögerungsliste für SL-Dauer (zunächst 1 Eintrag, 0, Optimierung beschrieben unter 3.1.3) vdlist (~ 0 – 40 ms) vdlist (~ 0 – 150 ms aufgrund des niedrigen R2 in unmarkierten Proben) TDF1 Anzahl der Einträge in der vd-Liste (anfänglich 1) TDF1 TDF1 Wärmekompensation: D30 = größter Wert in der vd-Liste + 2ms D30 D30 Zusätzliche Wärmekompensation für sehr breites Spektrum an SLs PL25 Off-Resonanz-spezifische Parameter: Pulsprogramm für Off-Resonanz 1Ds 1HR1rho_HCP_offres1D.de 1HR1r_HH_offres1D.js Offset für Off-Resonanz-Experimente CNST30 CNST30 Tabelle 2: Übersicht der Parameter zur Einrichtung von 1D HCP-basierten und 1D-SELOPE-basierten 1H R1ρ Experimenten. Abkürzungen: 1D = eindimensional; HCP = heteronukleäre Kreuzpolarisation; SELOPE = SELective Optimized Proton Experiment; ppm = Teile pro Million; HSQC= heteronukleäre Spinquantenkorrelation; SL = Spin-Sperre; RD = Relaxationsdispersion Aufbau und Erfassung von On-Resonance 1H R1ρ Experimenten Kopieren Sie das Experiment aus Abschnitt 3.4 in einen neuen Ordner in Topspin. Richten Sie in diesem Ordner Experimente mit unterschiedlichen SL-Stärken ein, wobei Sie jedes Mal PL25 und CNST12ändern. Bestimmen Sie den richtigen Leistungspegel für jede SL-Stärke mithilfe des Befehls pulse. Verwenden Sie SL-Stärken von 1,2 bis 15 kHz mit einer dichteren Abtastung für niedrigere SL-Stärken (siehe Abbildung 5G für ausgewählte SL-Stärken). Fügen Sie Kopien einiger Experimente hinzu, um Duplikate für einige der SL-Stärken zu haben. Führen Sie diese Experimente aus. Analyse von On-Resonance 1H R1ρ Experimenten Verarbeiten Sie in TopSpin jedes Slice jedes Pseudo-2D-Datensatzes mit den gleichen Verarbeitungsparametern(z. B. Zeilenverbreiterung, Phase) mit dem Befehl xf2und teilen Sie den Datensatz mit dem Bruker AU-Programm split2Din 1Ds auf. Erhalten Sie Signaldicken und -volumen für jedes 1D-Slice.HINWEIS: In der Praxis ist es besser, die Spektren zu dekonvoltieren, um Beiträge von potenziell überlappenden Peaks loszuwerden und ermöglicht die Verwendung des Bruker AU-Programms multidcon, das die Dichten oder Bereiche der Peaks aller Slices in einem Experiment in der Textdatei decall.txt bequem zusammenfasst, die dann leicht mit anderen Programmen ausgelesen werden können (intern geschriebene Python-Skripte wurden hier verwendet, wie von Steiner et al.10beschrieben ) in den Schritten 3.6.3 und 3.6.4. Passen Sie einen mono exponentiellen Zerfall für jede SL-Stärke an, um denR1ρ-Wert (oder On-Resonanz, R2+REX)zu erhalten. Zeichnen Sie diese R2+REX-Werte (y) vs. SL-Stärke (x) (Abbildung 5F,G).HINWEIS: Wenn die Werte für niedrige SL-Festigkeiten signifikant höher sind und mit höherer SL-Leistung abnehmen (wie in Abbildung 5Ggezeigt), zeigt der untersuchte Peak eine Dispersion, und es könnte interessant sein, zusätzliche (Off-Resonanz-) Experimente durchzuführen, um Informationen über die Population und die chemische Verschiebungsdifferenz des angeregten Zustands im Vergleichzu erhalten. den Grundzustand. 4. 1H R1ρ Relaxationsdispersion – Off-Resonanz (markierte 1D-Version) Aufbau und Erfassung von Off-Resonance 1H R1ρ Experimenten Richten Sie in einem neuen Topspin-Ordner Experimente mit einer bestimmten SL-Stärke ein (normalerweise zuerst bei der niedrigsten SL-Stärke, da der REX-Beitrag dort am höchsten ist, siehe Abbildung 5G für eine repräsentative Auswahl von Off-Resonance-SLs), jedoch mit unterschiedlichen Offsets, jedes Mal CNST30ändernd . Verwenden Sie Offsets bis zu ± (3 oder 4) * SL-Stärke, mit einer dichteren Probenahme um 0 Offset, wie in Abbildung 5H, Izu sehen ist. Führen Sie diese Experimente aus. Analyse von Off-Resonance 1H R1ρ Experimenten Verwenden Sie die gleiche Verarbeitungsstrategie wie in 3.6.1–3.6.3, um für jeden Offset einen R1ρ-Wert zu bestimmen. Zeichnen Sie diese Werte im Vergleich zum Offset auf ( Abbildung5G).HINWEIS: Eine Asymmetrie in dieser Kurve kann bereits darauf hindeuten, dass chemische Verschiebungsinformationen für den angeregten Zustand erhalten werden können. Eine gründliche Anpassung und Analyse mit Bloch-McConnell- oder Laguerre-Gleichungen muss durchgeführt werden, um Informationen über kEX, pES sowie Δω10,20 zu erhalten (Abbildung 5G). Beispieldatensätze, Pulsprogramme und Makros für beide 1D-Experimente finden Sie im Petzold Lab Github-Repository (https://github.com/PetzoldLab). Eine Übersicht über die Parameter ist in Tabelle 2 enthalten.

Representative Results

Das Protokoll zur RNA-Produktion erleichtert die Aufreinigung durch die Generierung hochreiner Transkripte. Abbildung 3A zeigt die Ergebnisse mehrerer Spaltreaktionen von Tandemtranskripten, die sowohl erfolgreiche als auch erfolglose Reaktionen liefern. Spur 1 zeigt den optimalen Fall eines vollständig gespaltenen Transkripts mit nur schwachen Spuren von Nebenprodukten. Spur 2a zeigt eine unvollständige Spaltung, die durch erneutes Glühen und Die Zugabe von mehr RNase H aufgelöst werden kann (Spur 2b, Schritt 2.1.2). Die RNA-Konstrukte der Bahnen 1, 2a und 2b sind gleich. Die Probe in Bahn 3 zeigt ein erfolgloses Dekolleté. Die Fehlerbehebung bei dieser Reaktion würde eine Überprüfung der Spaltungsführungssequenz, der Reinheit der DNA-Schablone und der Glühtemperaturen beinhalten. Möglicherweise muss die RNase H-Spaltung nach T7 IVT durchgeführt werden, wie für Probe 2 gezeigt. Die Probe in Bahn 4 zeigt eine signifikante Menge an Spaltseitenprodukten, die mittels Ionenaustausch-HPLC nur schwer zu entfernen sind. Die Fehlerbehebung bei einer solchen Probe kann (a) die Senkung der Temperatur, der RNase-H-Menge oder der Reaktionszeit, (b) die Verringerung des Elutionsgradienten und des Injektionsvolumens und den Versuch, die Zielfraktionen von den Nebenprodukten zu trennen, umfassen. Weitere Informationen darüber, wie die Auflösung bei der HPLC-Reinigung des Ionenaustauschs erhöht werden kann, wurden von Karlsson et al.31diskutiert. Die HPLC trennt die Ziel-RNA von längeren oder kürzeren Nukleinsäuren und Protein- oder niedermolekularen Verunreinigungen. Abbildung 3B zeigt das optimale Ergebnis für die Ionenaustausch-HPLC-Reinigung. Der Elutionsgradient sollte so gewählt werden, dass die Ziel-RNA-Spezies mindestens ein Säulenvolumen (in diesem Beispiel: 35 ml) nach der nächstkleineren Spezies und ein Säulenvolumen vor der nächst größeren Spezies eluiert. Kleinere Spezies in dieser Methode umfassen einzelne Nukleotide, abtreibende Produkte (8-12 nt), 3′ und 5′ Abstandhaltersequenzen (5-14 nt) und Spaltleiter (12 nt chimäre Nukleinsäure), während längere Sequenzen potenziell ungereinigte Tandemwiederholungen und das Plasmid sind. Wenn ein gut getrennter Elutionspeak erreicht wird, kann die Reinigung auf das Äquivalent von ~ 20 ml IVT-Reaktion pro Injektion skaliert werden. Die korrekte Faltung einer RNA-Probe ist entscheidend für RD-Experimente und muss vor jeder Messung bestätigt werden. Abbildung 4 zeigt eine A-markierte 22-mer-RNA vor dem Faltungsprotokoll in Schritt 2.4 (blau) und die gleiche Probe nach Erreichen der korrekten Faltung (rot). Eine Mc-Fold-Sekundärstrukturvorhersage (Abbildung 4C) schlägt die vorgestellte Haarnadelstruktur mit 4 Basenpaaren vor, die zu 5 Iminosignalen führen. Beide Spektren in Abbildung 4A bestätigen diese vorhergesagten Signale, wenn auch mit leicht unterschiedlichen relativen Intensitäten, was darauf hindeutet, dass eine fehlgefaltete Struktur (hier ein Dimer) mit nur 1 H 1D-Spektrenproblematisch zu beurteilen sein kann. Ein aromatisches 1H,13C-HSQC Spektrum (Abbildung 4B), zeigt jedoch nur 3 der aromatischen Signale für die Probe vor dem Faltungsprotokoll (blau), aber alle 4 Signale für die Probe, die gemäß Schritt 2.4 (rot) gefaltet wurde. Die in Blau gezeigte Probe bildete wahrscheinlich ein Homodimer (in Abbildung 4Dvorgeschlagene Struktur), das zu den gleichen Iminosignalen wie die Haarnadel führen würde. Das Signal von A13H2 scheint börsenverbreitet zu sein. Diese Ergebnisse helfen, die Bedeutung der Faltbestätigung mit Imino- und aromatischen Fingerabdruckexperimenten vor jedem RD-Experiment hervorzuheben. Die in diesem Protokoll beschriebenen 1HR1ρ Pulssequenzen ermöglichen die Detektion von Dynamiken im Zwischenaustauschregime. Zunächst wird eine On-Resonanz-Kurve aufgezeichnet, und wenn Dynamik für einen bestimmten Rückstand vorhanden ist, ist eine Dispersion innerhalb der erhaltenen R2+REX-Werte sichtbar, während diese Kurve für Rückstände ohne Austausch flach ist. Abbildung 5 zeigt repräsentative On-Resonanz-Kurven, die für zwei verschiedene H8-Atome in einer synthetischen RNA-Haarnadel erhalten wurden (Abbildung 5A), wobei G6H8 einen Austausch erfährt (Abbildung 5C), während A4H8 dies nicht tut (Abbildung 5B). Da der Austausch in dieser Probe relativ langsam ist (kEX = 292 ± 40 Hz), wurde der Vorteil des SELOPE-Experiments genutzt, niedrige SL-Festigkeiten zu erreichen, und die beiden On-Resonanzkurven wurden mit der 1D-Version der Pulssequenz aufgezeichnet. Die gleiche Pulssequenz wurde dann verwendet, um Off-Resonanz-Daten für den Rückstand zu erhalten, der eine Dispersion im On-Resonanz-Profil zeigt. Abbildung 5D zeigt die erhaltenenR1ρ-Werte vs. Offset, wobei eine leichte Asymmetrie der Kurve bereits das Vorzeichen von Δωanzeigt. Dies wird noch deutlicher imR2 +REX-Diagramm, wo derR1-Beitrag entfernt wird (Abbildung 5E). Die rechte Spalte der gleichen Abbildung zeigt repräsentative On-Resonanz-Kurven, die für zwei verschiedene H8-Atome in einer leicht unterschiedlichen synthetischen RNA-Haarnadel mit schnellerem Austausch erhalten wurden, wobei G6H8 einen Austausch erfährt (Abbildung 5G), während A4H8 dies nicht tut (Abbildung 5F). Der schnellere Wechselkurs (kEX = 43.502 ± 38.478 Hz) ermöglichte die RD-Aufzeichnung aller aromatischen Protonen auf einmal mit der SELOPE 2D-Version, um sowohl On- als auch Off-Resonanz-Daten zu erhalten (G6H8-Daten in Abbildung 5H,I). Allgemeine Identifikatoren für positive und negative ErgebnissePositive Ergebnisse im Tandem IVT und RNase H Spaltung können wie folgt identifiziert werden: 1) Das Zielband ist das stärkste Band im denaturierenden PAGE Gel. 2) Es gibt keine oder nur schwache Bänder um das Hauptband. 3) Es gibt keine oder nur schwache Spezies mit höherem Molekulargewicht. 4) Das HPLC-Chromatogramm zeigt einen gut getrennten Peak der Ziel-RNA. 5) Wenn der Hauptpeak abgetastet wird, erscheint nur ein Band auf einem denaturierenden PAGE-Gel. Negative Ergebnisse in der Tandem-IVT- und RNase-H-Spaltung liegen wie folgt vor: 1) Auf einem denaturierenden PAGE-Gel ist kein oder nur ein schwaches Hauptband sichtbar. 2) Ein Muster hochmolekularer Spezies aus RNA-Tandem-Wiederholungen ist sichtbar. 3) Obwohl das Hauptband vorhanden ist, liegen Bänder ähnlicher Intensität über oder unter dem Hauptband innerhalb ± 3 nt. Eine gut gefaltete Probe kann wie folgt identifiziert werden: 1) Die Anzahl der beobachteten Imino-Protonen entspricht der Anzahl der Imino-Protonen, die von einer Sekundärstruktursimulation erwartet werden(z. B.Mc-Fold39, Abbildung 4A). 2) Das syn G-U Wackelbasenpaar in einer UUCG-Schleife (falls vorhanden) ist bei ~9,5 ppm sichtbar, manchmal nur bei niedrigerer Temperatur. Weitere Fingerabdrücke der UUCG-Schleife wurden von Fürtig und Kollegenbeschrieben 40. 3) Der aromatische Fingerabdruck stimmt mit einer zuvor zugewiesenen Probe überein, deren korrekte Faltung bestätigt wurde (Abbildung 4C). Eine falsch gefaltete oder degradierte Probe kann wie folgt identifiziert werden: 1) Es gibt mehr Imino-Signale, als eine Sekundärstruktursimulation vorhersagt (HINWEIS: Weniger Imino-Signale implizieren nicht unbedingt eine Fehlfaltung, da schließende Basenpaare oft nicht sichtbar sind und der Konformationsaustausch die Linien verbreitert). 2) Fehlen von Imino-Signalen. 3) Enge Signale von hoher Intensität im aromatischen Bereich, die auf einzelne Nukleotidabbauprodukte hinweisen. 4) Divergenz zwischen imino- oder aromatischen Signalen zu einer Referenzprobe bestätigter Faltung (Abbildung 4C). Ein Atom, das keinen Austausch in der nachweisbaren Zeitskala zeigt, kann wie folgt identifiziert werden: 1) aus einem flachen RD-Profil (aufgrund des fehlenden R EX-Beitrags, der mit der angelegten SL-Leistung variiert) (Abbildung 5B und Abbildung 5F). 2) Auf den Fall eines langsamen Zwischenaustauschs ist zu achten, wenn kEX und Δω die gleiche Größenordnung haben. In diesem Fall kann der On-Resonanz-Beitrag sehr gering sein, wie in Abbildung 5C zu sehen ist (in diesem Fall sind die angepassten Parameter kEX = 292 ± 40 Hz und Δω = 112 ± 4 Hz). Im Zweifelsfall kann eine niedrige SL-Off-Resonanzkurve zur Verifizierung aufgezeichnet werden. Ein Atom, das einen Austausch in der Mittleren Zeitskala zeigt, kann 1) aus einem nicht-flachen Relaxationsdispersionsprofil in einem On-Resonanz-RD-Experiment identifiziert werden (Abbildung 5B und Abbildung 5F); 2) Eine breitere Linienbreite im HSQC- oder SELOPE-Experiment kann auch ein Indikator für den Austausch sein. Gut ausgewählte SL-Leistungswerte für Off-Resonanzkurven (Abbildung 5E, F): 1) haben einen erheblichen k EX-Beitrag in der On-Resonanz-Kurve (ausgewählte SL-Leistungswerte sind in Abbildung 5C und Abbildung 5Gangegeben). 2) Da Off-Resonanzkurven für mindestens 3 SL-Leistungswerte gemessen werden, sollten die gewählten SL-Leistungswerte über den Bereich der On-Resonanz-Kurve mit kEX-Beitrag verteilt werden. 3) Führen Sie zu nicht flachen R2+REX-Kurven nach der Laguerre-Passform(z. B. Abbildung 5D:SL-Stärken 25, 50 und 75 Hz; Abbildung 5E). Schlecht gewählte SL-Leistungswerte für Off-Resonanzkurven (Abbildung 5E, F) führen nach der Laguerre-Passform zu flachen R2+REX-Kurven. Ein Beispiel ist in Abbildung 5Edargestellt, wobei die 100 Hz Off-Resonanzkurve sehr flach ist und daher keine signifikanten Informationen über Δωliefert. Indikationen für rotierende Kern-Overhauser-Effekt-Artefakte (ROE): 1) Δω, die aus Off-Resonanzkurven erhalten werden, stimmen mit chemischen Verschiebungen von Protonen in räumlicher Nähe / Protonen überein, die einen Kreuzpeak mit dem Peak von Interesse im Kern-Overhauser-Effekt-Spektroskopie -Spektrum (NOESY) zeigen. (z.B.zeigt Abbildung 5I breite Off-Resonanzkurven, wie sie für den schnellen Zwischenaustausch erwartet werden, aber die Kurven haben auch schärfere Merkmale, z.B.bei -3000 Hz und +1500 Hz. Diese sind sehr wahrscheinlich eher auf ein ROE-Artefakt als auf eine chemische Verschiebung für dieses H8 in einem anderen Konformer zurückzuführen). 2) Laguerre-Fit funktioniert, funktioniert aber nicht gut (gibt hohe Fehler oder physikalisch unmögliche Werte) für eine On-Resonanz- und mindestens 3 Off-Resonanz-Kurven, obwohl Exponentiale aus Experimenten mit hohem SINO (>20) erhalten wurden(z.B. kEX = 43.502 ± 38.478 Hz). Oft passt jeder SL einzeln gut, aber wenn man sie zusammenfügt, ergibt sich ein viel höherer Fehler; das gegenteilige Verhalten wird für einen echten angeregten Zustand erwartet. Indikationen für den “wahren” Austausch Δω: 1) Δω, die aus Off-Resonanzkurven erhalten werden, stimmen nicht mit chemischen Verschiebungen von Protonen in räumlicher Nähe/Protonen überein, die einen Kreuzpeak mit dem Peak von Interesse im NOESY-Spektrum zeigen (z. B. Abbildung 5E). 2) Laguerre-Passform ergibt geringe Fehler für eine On-Resonanz- und mindestens 3 Off-Resonanz-Kurven(z. B. Abbildung 5E vs. Abbildung 5I, siehe Beschriftung für Anpassungsergebnisse). Abbildung 3: Probenproduktion durch T7-Tandem-IVT und RNase-H-Spaltungsreaktion. (A) Denaturierungsseite positiver und negativer Ergebnisse von Tandem-IVT und RNase H-Spaltung. Leiterhöhe bezieht sich auf RNA-Referenzen, 12* bezieht sich auf den chimären Spaltungsleitfaden. Spur 1: Erfolgreiche Generierung einer 20 nt Ziel-RNA. Es gibt nur wenige kürzere und längere Produkte. Spur 2a: Unvollständige Spaltung des Tandem-Transkripts. Obwohl eine HPLC-Reinigung möglich ist, würde viel Material verschwendet. Lane 2b: Die fortgesetzte RNase H-Spaltung von Lane 2 erzeugt eine saubere Probe, die für die HPLC-Injektion bereit ist (identisch mit Lane 1). Lane 4: RNase H Dekolleté war weitgehend erfolglos, und es wurde kein Zielband produziert. Das Tandem-Transkript in voller Länge ist bei 600 nt noch sichtbar. Lane 5: Es wurde ein Zielband produziert, aber ein starkes -1-Band ist vorhanden. Obwohl HPLC durchgeführt werden kann, ist eine sorgfältige Entfernung des Nebenprodukts erforderlich. (B) Beispiel für eine erfolgreiche HPLC-Injektion. Der Peak bei 38 min enthält reine RNA der Ziellänge, während längere und kürzere Produkte gut von der Ziel-RNA getrennt sind. Panel B wurde von 21geändert. Abkürzungen: IVT = in vitro transkription; HPLC = Hochleistungsflüssigkeitschromatographie; nt = Nukleotide; AU = beliebige Einheiten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 4: Beispiel einer RNA-Haarnadel vor (blau) und nach (rot) dem Faltungsschritt 2.4 (siehe Protokoll) in NMR. (A) Imino-Region eines 1H-1D-Spektrums einer A-markierten 22-mer-RNA. Erwartete Regionen für die Basenpaaridentität von Imino-Signalen sind unten grau dargestellt. (B) 1H,13C-HSQC Spektrum der aromatischen Resonanzen der RNA aus Panel A. Die Probe nach der Faltung (rot) zeigt 4 Signale wie erwartet, während die Probe vor der Faltung (blau) nur 3 Signale zeigt. (C) Mc-Fold-Vorhersage der 22-mer-RNA als Haarnadel. Von dieser Sekundärstruktur sind fünf Iminosignale zu erwarten, die in beiden Proben in Panel A zu finden sind. (D) Vorgeschlagene Struktur eines homodimeren, das von der 22-mer-RNA gebildet wird, was zu den gleichen 5 Basenpaaren wie die Haarnadelstruktur führt. Abkürzungen: NMR = Kernspinresonanz; 1D = eindimensional; HSQC = heteronukleäre Einzelquantenkorrelation; ppm = Teile pro Million. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 5: 1H R1ρ RD repräsentative Ergebnisse für zwei verschiedene Konstrukte basierend auf einer RNA-Haarnadel. (A) Die linke Spalte zeigt die Ergebnisse, die auf der RNA mit einem C-G-Basenpaar über dem gewölbten U erzielt wurden, während die rechte Spalte die Ergebnisse einer Probe zeigt, bei der das Basenpaar stattdessen auf G-C umgestellt wurde. (B) und (F) zeigen flache Dispersionsprofile, wie sie für A4H8 für die beiden Konstrukte erhalten wurden, was auf keinen Konformationsaustausch hinweist. (C–E) zeigen On-Resonanz-, Off-Resonanz- und Angepasste-Daten, die für G6 im (G-C) -Konstrukt erhalten wurden. Die Laguerre-Passung führt zu folgendem Ergebnis: R1 = 2,87 ± 0,01 Hz, R2 = 7,76 ± 0,03 Hz, kEX = 292 ± 40 Hz, pES = 0,31 ± 0,03 %, Δω = 112 ± 4 Hz. (G–I) zeigen On-Resonanz-, Off-Resonanz- und Angepasste Daten, die für G6 im (G-C) Konstrukt erhalten wurden. Die Laguerre-Passform führt zu folgendem Ergebnis: R1 = 1,93 ± 0,02 Hz, R2 = 6,71 ± 0,86 Hz, kEX = 43.502 ± 38.478 Hz, pES = 27 ± 16 %, Δω = 203 ± 166 Hz. Diese Zahl wurde von 20geändert. Abkürzung: SL = Spin Lock. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Das hier vorgestellte Protokoll ist eine Synthese mehrerer Protokolle, die zuvor in Form von^{Forschungsartikeln 10}^,²⁰^,²¹^,31 veröffentlicht^wurden. Daher können Segmente des Protokolls angewendet werden, während andere nach Den Wünschen des Lesers ausgetauscht werden können. Zum Beispiel können die _{R1ρ-Messungen} an einer RNA-Probe durchgeführt werden, die mit jeder Methode hergestellt wurde, vorausgesetzt, dass Faltung und Homogenität der Länge angenommen werden. Darüber hinaus enthält das Protokoll keine Informationen über die Resonanzzuordnung der RNA-Sequenz – ein Schritt, der für RD-Experimente erforderlich ist^-,da dies in der früheren Literatur ausführlich behandelt wurde¹⁹,³⁷^,³⁸. Partielle, segmentale oder ortsspezifische Markierungsschemata³⁶^,⁴¹^,⁴²^,⁴³^,⁴⁴ sind Ansätze zur Erleichterung der Resonanzzuordnung oder zur Verringerung der Überlappung von Resonanzen, die in RD-Experimenten von Interesse sind und in der Literatur ausführlich beschrieben wurden. Diese Methode ermöglicht die Verwendung einer einheitlichen Markierung beliebiger Nukleotididentitäten, was die Resonanzzuordnung bereits erheblich vereinfachen kann.

Die hier vorgestellte IVT-Methode überwindet bekannte Probleme mit Sequenzen und Kennzeichnung, steigert den Ertrag und senkt Kosten und Arbeitszeit im Vergleich zu anderen Methoden. Die Verwendung der viralen Initiationssequenz reduziert die Notwendigkeit einer Reaktionsoptimierung, was ein bekanntes Problem im Feld ist, das zeitaufwendig durchzuführen sein kann und im Falle einer Nicht-G-Initiation nur wenige Kopien des Transkripts liefert. Die T7 IVT- und RNase H-Spaltung des Tandem-Transkripts kann gleichzeitig im selben Gefäß durchgeführt werden. Ein Muster multimerer Tandemwiederholungen ist auf einem denaturierenden PAGE-Gel während der Reaktion zu sehen, das nach Abschluss der RNase-H-Reaktion zu einem einzigen Band auf der Ziel-RNA verschmolz(Abbildung 3A,Bahnen 1 und 2b). Typische Ausbeuten mit dieser Methode liegen zwischen 30 und 70 nmol RNA pro 1 ml IVT. Die methode, die auf der RNase H-Spaltung von Tandemwiederholungen basiert, ist jedoch nicht ohne gewisse Probleme. Die RNase H-Spaltungsreaktion geht oft nicht zum Abschluss, wenn sie gleichzeitig mit der T7-Transkription ausgeführt wird(Abbildung 3A,Bahn 2a).

Die Trennung der Tandemeinheiten kann durch Glühen der Spaltungsführung zum Transkript und Hinzufügen weiterer RNase H abgeschlossen werden(Abbildung 3A,Bahn 2b, Schritt 2.1.2). Da das Erhitzen großer Volumina langsam ist und zu einer^Mg2+-katalysierten Hydrolyse von RNA führt, wurde ein herkömmlicher Mikrowellenofen verwendet, der die Probe in 10-15 s auf >95 °C erhitzen wird. Schädliche Auswirkungen auf die produzierten Proben wurden bisher nicht beobachtet. Einige Konstrukte zeigen ein kleines zweites Band, das durch die Optimierung der Reaktionsbedingungen nicht eliminiert werden konnte (Abbildung 3A, Spur 4). In der Regel sind diese im HPLC-Chromatogramm eher deutlich als Schulter sichtbar, wenn ein gut optimierter Elutionsgradient verwendet wird, und können entfernt werden (Schritt 2.2.5). Die folgende Diskussion zielt darauf ab, kritische Schritte im Protokoll hervorzuheben, insbesondere in Bezug auf die Gewinnung hochwertiger Daten, die eine Interpretation der Konformationsdynamik ermöglichen.

RNase-Kontamination
Extrazelluläre RNasen sind allgegenwärtig, hochstabil und stellen die größte Bedrohung für die Langzeitstabilität von NMR-Proben dar. Daher ist es wichtig, in einer RNase-freien Umgebung zu arbeiten und alle Reagenzien und Kunststoffwaren RNase-frei zu halten. Die Verwendung von Filterspitzen und vielleicht sogar Gesichtsmasken wird empfohlen. Dies ist besonders wichtig nach der HPLC-Reinigung. NMR-Proben, die mit RNasen kontaminiert sind, weisen typischerweise nach Tagen oder Wochen aufgrund von Einzelnukleotidabbauprodukten enge Spitzen auf, die in ¹H-1D-Spektren sichtbar sind. Eine solche Probe ist für _{R1ρ-Messungen} nicht geeignet.

NMR-Probe
Aufgrund ihrer hoch geladenen Natur kann RNA im Vergleich zu den meisten Proteinen in hohen Konzentrationen ohne Ausfällung verwendet werden. Die Verwendung von Shigemi NMR-Röhrchen (siehe Materialtabelle)ist vorteilhaft, da sie eine Zentrierung der hochkonzentrierten Probe in der Mitte der Spule ermöglichen und gleichzeitig aufgrund des anfälligkeitsmäßig abgestimmten Glasbodens und -kolbens dennoch ideale Shimming- und Locking-Bedingungen bieten. Auf diese Weise wird die B1-Inhomogenität reduziert, was zu schmaleren Linien führt. Das typische Probenvolumen in einem NMR-Röhrchen beträgt 250 μL und die typische Konzentration 1-2 mM. Proben unter 500 μM werden für RD-Experimente nicht empfohlen, da das Experiment zu lange dauern und ein gutes Shim wäre. Ebenso wird ein Probenvolumen unter 200 μL nicht empfohlen, da eine gute Shim- und Feldstabilität (Lock) erforderlich ist. Beim Einsetzen des Kolbens ist es wichtig, die Bildung von Blasen in der Probe zu vermeiden (Schritt 2.4.5). Wenn der Kolben nicht richtig fixiert wird, kann er in die Probe hineingleiten, wodurch das nachweisbare Volumen reduziert wird. Darüber hinaus können schnelle Temperaturänderungen zur Bildung neuer Blasen in der Probe führen. Daher ist beim Transport der Probe und bei der Änderung der Sondentemperatur im NMR-Spektrometer Vorsicht geboten. Überprüfen Sie die Probe bei erneuter Messung nach längerer Zeit auf Blasen.

RNA-Faltung
Dynamische RNA-Moleküle können in mehreren Konformationen existieren, wenn sie nicht richtig gefaltet werden. Auch wenn die Schmelztemperaturen von Sekundärstrukturen nur geringfügig über raumtemperatur liegen können, empfiehlt sich vor der Messung ein gründliches Heiz- und Schnappkühlverfahren. Hochkonzentrierte Haarnadelproben, die unter kinetischer Kontrolle (Heizen und Schnappen) falten, können im Laufe der Zeit Homodimere bilden, was eine strenge Kontrolle der RNA-Faltung vor jeder NMR-Messung erfordert. Wenn es sich bei der gemessenen RNA nicht um eine Haarnadelstruktur, sondern um einen RNA-Duplex handelt, sollte eine langsame Faltung unter thermodynamischer Kontrolle angewendet werden.

In diesem Fall sollte der Kühlprozess nach dem Erhitzen im Bereich von Stunden liegen, während die RNA in ihrem endgültigen Volumen und ihrer Konzentration in der NMR-Probe verwendet wird. Eine erste Zählung der erwarteten Imino- und aromatischen Resonanzen kann Aufschluss über die Homogenität der Probe geben. Wenn die Probe nicht wie erwartet aussieht, sollte sie wieder gefaltet werden. Mg²⁺ (als Chloridsalz zugegeben) kann bei der Faltung von RNA-Strukturen^{helfen 45}. In der Praxis dient die Faltungssteuerung als Vergleich zu einer Probe, mit der die NMR-Resonanzen zumindest teilweise zugeordnet und die Sekundärstruktur experimentell gelöst wurden.

Überlegungen zu Leistung und Heizung der Spin-Lock
Wenn die 1 H R ^1ρRD-Experimente als 2D-Übersichtsexperimente ausgeführt werden, sollte die SL-Leistung nicht niedriger als 1,2 kHz sein. Die Hochfrequenz-Sendefrequenz sollte in der Mitte des ppm-Bereichs der interessierenden Peaks platziert werden(z. B.7,5 ppm für aromatische Protonen). Die Bandbreite von 1,2 kHz ist dann groß genug, um diese Protonen ohne größere Off-Resonanz-Effekte zu spinnen. Solche Effekte können im RD-Profil identifiziert werden. Treten sie auf, steigen die _R2+R_EX-Werte mit steigenden SL-Leistungswerten an, anstatt zu sinken, insbesondere bei geringer SL-Leistung. Überprüfen Sie, ob die berechneten SL-Leistungswerte mit der an die Probe gelieferten Leistung übereinstimmen. In der Praxis kann die berechnete SL-Leistung verwendet werden, wenn der ¹H 90° harte Impuls sorgfältig auf neueren Spektrometern kalibriert wurde; Dies kann jedoch überprüft werden, indem die SL-Leistung für jede gewünschte Bandbreite kalibriert wird.

Der Bereich der SL-Leistung, der in 1 H R ^1ρRD-Experimenten verwendet werden kann, ist sehr breit, was zu einer unterschiedlichen Probenerwärmung führt (1,2 kHz bis 15 kHz für HSQC für HCP-basierte Sequenzen und 50 Hz bis 15 kHz für SELOPE-Experimente). Ungleiche Probenerwärmung kann als leichte Änderung der chemischen Verschiebung erkannt werden, wenn man 1Ds vergleicht, die für Low-Power-SLs mit . Hochleistungs-SLs. Dieser Effekt wird in der Regel nicht in Wärmekompensationen in _{R1ρ-Experimenten} an Heteronukleien berücksichtigt. Die Wärmekompensation in diesen Experimenten wird normalerweise so eingerichtet, dass sie aufgrund der unterschiedlichen Spin-Lock-Dauern, die in der vd-Liste jeder Spin-Lock-Leistungsreihe angegeben sind, für unterschiedliche Erwärmungen korrigiert wird. Speziell für das SELOPE-Experiment sollte eine zweite Wärmekompensation über alle angewandten SL-Stärken wie in²⁰beschrieben verwendet werden.

Überlegungen zur VD-Liste
Wie bereits erwähnt, sollte die vd-Liste einen Zeitpunkt enthalten, der lang genug ist, um einen signifikanten Intensitätsabfall zu erhalten (idealerweise bis zu 30% des Anfangssignals oder so niedrig wie möglich, wenn es nicht möglich ist, einen 70% igen Zerfall innerhalb der Spezifikationen der Sonde zu erreichen). Obwohl die vd-Liste für eine geringe SL-Leistung (1,2 kHz) optimiert wurde, sollte diese vd-Liste auch bei der höchsten zu verwendenden SL-Leistung(z.B.15 kHz) getestet werden. Dies liegt daran, dass bei Peaks mit signifikantem R_EX-Beitrag der Zerfall bei hoher SL-Leistung viel langsamer ist. So sollte auch bei hoher SL-Leistung ein ausreichender Zerfall nachgewiesen werden. Gleiches gilt für Zerfälle bei hohen Offsets in Off-Resonanz-Experimenten. Der ideale maximale Zeitpunkt der vd-Liste könnte für die verschiedenen Regionen des Dispersionsexperiments signifikant unterschiedlich sein. In diesem Fall könnten mehr Punkte in die vd-Liste aufgenommen werden, und die längeren vd-Listenpunkte für höhere SL-Leistung oder höhere Offsets während der Analyse, basierend auf dem niedrigen SINO, zu dem sie führen, könnten verworfen werden. Im Allgemeinen sollten 5-8 vd-Listenpunkte in Betracht gezogen werden, um potenzielle Artefakte zu erkennen, die zu nicht-exponentiellen Zerfällen wie J-Kopplung führen (siehe unten).

1D–Überlegungen zur HCP-Selektivität
Beim Ausführen der HCP-basierten 1D-Version ist besondere Vorsicht geboten, wenn sich ein weiterer Peak mit dem Peak of Interest in der ¹H-Dimension des 2D HSQC-basierten Experiments überschneidet. HCP-basierte Transfers sind sehr, aber nie 100% selektiv, und es kann daher vorkommen, dass ein anderer Peak zum Intensitäts- und Zerfallsverhalten des Peak of Interest im 1D beiträgt. Ein Hinweis darauf wäre eine Differenz der On-Resonanz-R1ρ-Werte, die mit der 1D- und 2D-Version des markierten Experiments erhalten wurden.

ROE-Überlegungen:
Für Off-Resonanzkurven von Atomen mit langsamem Zwischenaustausch können ROE-Artefakte basierend auf einem Vergleich des erhaltenen Δω mit einem NOESY- oder ROESY-Spektrum identifiziert werden. Wenn ein Kreuzpeak bei einer chemischen Verschiebungsdifferenz entsprechend Δωidentifiziert werden kann, dann könnte der beobachtete angeregte Zustand tatsächlich ein ROE-Artefakt sein(z. B.wurden ROEs zwischen aromatischen Protonen gefunden, die sich alle im gleichen chemischen Verschiebungsbereich befinden und daher von diesen Off-Resonanzkurven abgedeckt werden²⁰). Erfahrungsgemäß führte dies immer auch zu schlechten Passformen mit großen Fehlern, möglicherweise weil der ROE nicht dem gleichen Muster wie R_EX mit zunehmender SL-Leistung folgte. Schwieriger wird die Situation für den mittelschnellen Austausch. Während die On-Resonanz-Kurve (aus dem Vergleich mit ¹³C-Daten, die auf dem benachbarten Kern erhalten wurden) immer noch repräsentativ für den Austauschprozess zwischen GS und ES ist, wird die Off-Resonanz-Kurve durch mehrere ROE-Artefakte beeinflusst.

In diesem Fall ist die SL-Leistung zum Nachweis des Austauschprozesses größer (>1,5 kHz) und umfasst daher eine größere Anzahl von Protonen, da sich Off-Resonanzkurven über chemische Verschiebungsdifferenzen verschiedener ROE-Kandidaten erstrecken (für H8 wären dies: Aminoprotonen bei ca. ±1000 Hz, H5/H1 bei ca. -1200 Hz, Iminoprotonen bei ca. 3500 Hz). Bisher wurde keine Methode gefunden, um diese ROE-Artefakte zu unterdrücken (außer der Verwendung von teilweise deuterierten Nukleotiden^46),und Off-Resonanz-Daten sollten nicht für den schnellen Zwischenaustausch aufgezeichnet werden, da mit dieser Methode keine zuverlässigen Informationen über das tatsächliche Δω extrahiert werden können, wenn der NOE/ROE-Beitrag nicht über NOESY-Spektren ausgeschlossen werden kann.

Überlegungen zur J-Kopplung (Hartmann-Hahn)
Obwohl On-Resonanz-Kurven für homonukleare J-gekoppelte Protonen, wie H6, erfolgreich¹⁰^,²⁰aufgezeichnet wurden, ist bei Off-Resonanz-Messungen besonders vorsichtshalber geboten, insbesondere bei geringer SL-Leistung, da Hartmann-Hahn-Matching-Bedingungen einen weiten Bereich der untersuchten Offsets umfassen können. Hartmann-Hahn-Artefakte können als Schwingungen auf dem exponentiellen Zerfall oder steigende_R2+ R_EX-Werte mit steigenden SL-Stärken in On-Resonanz-RD-Diagrammen²⁰identifiziert werden.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken der Protein Science Facility (PSF) am Karolinska Institutet für die Expression und Reinigung von T7 RNA Polymerase und E. coli RNase H, Martin Hällberg für die großzügige Schenkung der anorganischen Phosphatase und dem gesamten Petzoldlab für wertvolle Gespräche. Wir danken Luca Retattino für die Vorbereitung der U-Bulge-Konstrukte und Emilie Steiner und Carolina Fontana für ihren Beitrag zu Makros und passenden Skripten. Wir danken dem Karolinska Institut und der Abteilung für Medizinische Biochemie und Biophysik für die Unterstützung der Anschaffung eines 600 MHz Spektrometers und der Positionsfinanzierung (KI FoAss und KID 2-3707/2013). Wir danken für den finanziellen Beitrag von Vetenskapsrådet (#2014-4303), Stiftelsen för strategisk Forskning (ICA14-0023 und FFL15-0178) und The Ragnar Söderberg Stiftelse (M91-14), Harald och Greta Jeansson Stiftelse (JS20140009), Carl Tryggers stiftelse (CTS14-383 und 15-383), Eva och Oscar Ahréns Stiftelse, Åke Wiberg Stiftelse (467080968 und M14-0109), Cancerfonden (CAN 2015/388), J.S. erkennt Die Finanzierung durch ein Marie Skłodowska-Curie IF (EU H2020, MSCA-IF Projekt Nr. 747446) an.

Materials

40% Acrylamide/Bis Solution	Bio-Rad	161-0144
5-alpha Competent E. coli	NEB	C2987I
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	49199
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	34851
AFC-3000, HPLC Fraction collector	Thermo Scientific	5702.1
Agarose	Sigma-Aldrich	A9414
Amersham ImageQuant 800 UV	GE Healthcare	29399482	Replacing LAS-4000 or equivalent
Amicon ultra centrifugal filter unit	Sigma-Aldrich	UFC900324
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9518
ATP	Sigma-Aldrich	A2383
ATP-13C10/15N5	Sigma-Aldrich	645702
BamHI restriction enzyme	NEB	R0136L
Bottle top filter	VWR	514-1019
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	1081220005
Cleavage guide	IDT	N/A	or equivalent
CTP	Sigma-Aldrich	C1506
CTP-13C10/15N5	Sigma-Aldrich	645699
D2O	Sigma-Aldrich	151882
Dionex Ultimate 3000 UHPLC system	Thermo Scientific	N/A
DL-Dithiotreitol	Sigma-Aldrich	43815
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
DNAPac PA200 22×250 Semi-Prep column	Thermo Scientific	SP6734
DNAPac PA200 22×50 guard column	Thermo Scientific	SP6731
E.coli RNase H	NEB	M0297L	or made in-house uniprot ref. P0A7Y4
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758
Eppendorf centrifuge, rotor: A-4-44	Eppendorf	5804R
Ethanol 95%	Fisher scientific	11574139
Ethanol 95% denatured	VWR	85829.29
Formamide	Sigma-Aldrich	47671
GelRed	VWR	41003
GeneRuler 1kbp Plus	Fisher Scientific	SM1333	Optional
GMP	Sigma-Aldrich	G8377
GMP-13C10/15N5	Sigma-Aldrich	650684
GTP	Sigma-Aldrich	G8877
GTP-13C10/15N5	Sigma-Aldrich	645680
Hydrochloric Acid	Sigma-Aldrich	H1758
Inorganic pyrophosphatase	Sigma-Aldrich	I1643-100UN	or made in-house uniprot ref. P0A7A9
Invitrogen UltraPure 10X TBE-buffer	Sigma-Aldrich	T4415
Julabo TW8 Water bath	VWR	461-3117
kuroGEL Midi 13 Horizontal gel electrophoresis	VWR	700-0056	or comparable
LB broth (Lennox)	Sigma-Aldrich	L3022
LB broth with agar (Lennox)	Sigma-Aldrich	L2897
Low Range ssRNA Ladder	NEB	N0364S	Optional
LPG-3400RS Pump	Thermo Scientific	5040.0036
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	63068
microRNA Marker	NEB	N2102S
Microwave oven	Samsung	MS23F301EAW
Mini-PROTEAN electrophoresis equipment	Bio-Rad	1658004
NucleoBond Xtra Maxi	Machinery-Nagel	740414.10M
pUC19 plasmid containing tandem insert	Genscript	N/A	or equivalent
RNaseZAP	Sigma-Aldrich	R2020
Shigemi tube 5mm	Sigma-Aldrich	Z529427
Single-use syringe, Luer lock tip	VWR	613-2008
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	730-1470
Sodium perchlorate	Sigma-Aldrich	71853
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S3264
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S3139
Spermidine trihydrochloride	Sigma-Aldrich	85578
SYBR Gold	ThermoFisher	S11494
Syringe filters	VWR	514-0061
T7 RNA polymerase	Sigma-Aldrich	10881767001	or made in-house uniprot ref. P00573
TCC-3000RS Column thermostat	Thermo Scientific	5730
Tetramethylethylenediamine	Sigma-Aldrich	T9281
Tris Base	Fisher Scientific	10103203
UMP	Sigma-Aldrich	U6375
UMP-13C9/15N2	Sigma-Aldrich	651370
Urea	Sigma-Aldrich	U5378
UTP	Sigma-Aldrich	U6625
UTP-13C10/15N5	Sigma-Aldrich	645672
VWD-3100 Detector	Thermo Scientific	5074.0005

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Feyrer, H., Schlagnitweit, J., Petzold, K. Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of ¹H R_1ρ Relaxation Dispersion Experiments of RNA. J. Vis. Exp. (173), e62470, doi:10.3791/62470 (2021).