Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Hannes Feyrer; Judith Schlagnitweit; Katja Petzold

doi:10.3791/62470

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

生物化学

الجوانب العملية لإعداد عينة والإعداد من ¹H R_1ρ تجارب التشتت الاسترخاء من الجيش الملكي النيبالي

Published: July 09, 2021

doi:

10.3791/62470

Hannes Feyrer¹, Judith Schlagnitweit¹, Katja Petzold¹

¹Department of Medical Biochemistry and Biophysics,Karolinska Institutet

Summary

نقدم بروتوكول لقياس ديناميات الصغرى إلى مللي ثانية على ¹³C /¹⁵N المسمى وغير المسمى الجيش الملكي النيبالي مع ¹H R_1ρ الاسترخاء تشتت الرنين المغناطيسي النووي (NMR) الطيفية. ينصب تركيز هذا البروتوكول على إعداد عينات عالية النقاء وإعداد تجارب NMR.

Abstract

RNA هو جزيء حيوي مرن للغاية ، حيث تلعب التغييرات في الهياكل أدوارا حاسمة في الوظائف التي تنفذها جزيئات الحمض النووي الريبي كرسل ومغيرات خلوية. في حين أن هذه الدول الديناميكية لا تزال مخفية لمعظم الأساليب الهيكلية، R_1ρ التشتت الاسترخاء (RD) الطيف يسمح لدراسة ديناميات تشكيلية في النظام الصغرى إلى مللي ثانية في القرار الذري. استخدام ¹H كالنواة الملاحظة يزيد من توسيع نظام الوقت المشمول ويعطي الوصول المباشر إلى روابط الهيدروجين والاقتران الأساسي.

الخطوات الصعبة في مثل هذه الدراسة هي إعداد عينات عالية النقاء وعالية الغلة ، يحتمل أن تكون ¹³C – و ¹⁵N – المسمى ، فضلا عن إعداد التجارب وتركيب البيانات لاستخراج السكان ، سعر الصرف ، والهيكل الثانوي للدولة غير مرئية سابقا. يوفر هذا البروتوكول خطوات عملية حاسمة في إعداد العينات لضمان إعداد عينة RNA مناسبة وإعداد تجارب ¹H R_1ρ مع كل من عينات الحمض النووي الريبي المسماة بالنظائر وغير المسماة.

Introduction

RNAs أداء العديد من^{التنظيمية 1}،²الحفاز ، والهيكلية³ وظائف في الخلية ، وكثير منها ترتبط مرنة التركيب الجزيئي والتغيرات المعقدة لتلك الهياكل⁴،⁵^،⁶^،⁷. تبقى الدول ذات الكثافة السكانية المنخفضة غير مرئية لمعظم أساليب تحديد البنية أو لا تسمح بدراسة هذه الدول المخفية بدقة ذرية عالية. الحل الدولة النووية الرنين المغناطيسي (NMR) التحليل الطيفي يجمع بين كلا الجانبين من خلال توفير الوصول إلى النوى الذرية الفردية، فضلا عن تقديم مجموعة كبيرة من التجارب التي تستهدف ديناميات من خلال جميع النظم الزمنية⁸. توفر تجارب RD NMR إمكانية الوصول إلى التبادل التشكيلي في النطاق الزمني المتوسط ، حيث يمكن توقع التغييرات في أنماط الاقتران الأساسي وإعادة الترتيب الهيكلي المحلي⁵^و⁹^و¹⁰^و¹¹^و¹²^و¹³^و¹⁴. يتم إجراء تجارب RD طالما _{R 2 القياسات} في شكل قطار نبض كار بورسيل-ميبوم-جيل¹⁵ أو كقياسات الاسترخاء في الإطار الدورية, دعا R_1ρ RD التجارب¹⁶.

على الرغم من أنه يمكن استخدام كليهما لاستخراج السكان من سعر الصرف والفرق التحول الكيميائي إلى الدولة الثانوية، R_1ρ RD التجارب تعطي أيضا علامة على الفرق التحول الكيميائي للدولة متحمس. وهذا يسمح بالاستدلال على الهيكل الثانوي ، والذي يرتبط ارتباطا وثيقا بالتحول الكيميائي في هياكل الحمض النووي الريبي^17. التحول الكيميائي هو مؤشر جيد على الهلية في حالة البروتونات العطرية والكربونات على النيوكليوباس ، وشركاء الاقتران الأساسي للبروتونات إيمينو ، وتجعد السكر على ذرات C4 و C1¹⁸^،¹⁹. تجدر الإشارة إلى أن مؤخرا تبادل تبادل المواد الكيميائية التشبع نقل (CEST) تجربة باستخدام أعلى قفل الدوران (SL) السلطة، وبالتالي تحويل إمكانية تطبيق تجربة CEST لجداول زمنية أسرع تبادل، ونشرت كبديل لتجربة R_1ρ RD لأنظمة مع حالة واحدة متحمس.

على الرغم من أن ¹³C و ¹⁵N النظائر غالبا ما تستخدم للوصول إلى التبادل الهيكلي, العمل الأخير من هذا المختبر تستخدم البروتونات العطرية وإيمينو كمسبارات لتبادل تشكيلي⁹^,¹⁰. استخدام ¹H كالنواة الملاحظة يجلب العديد من المزايا، على سبيل المثال، الوصول إلى التبادل على جداول زمنية أسرع وأبطأ، وحساسية أعلى، وأوقات قياس أقصر. ومما يسهل ذلك كذلك نهج تجربة البروتون الأمثل SELective (SELOPE) ، وتوفير الوصول إلى البروتونات العطرية من خلال تفكيك الطيف أحادي البعد (1D) باستخدام اقترانات زناوية متجانسة ، بدلا من نقل المغناطيسية غير النووية ، والقضاء على الحاجة إلى تسميات النظائر²⁰. يتناول هذا البروتوكول القياس في ^{تجارب RD 1} H R_1ρ الموحدة ¹³C/¹⁵N-labeled والعينات غير المسماة. لذلك، تقدم هذه الورقة طريقة إعداد العينة التي تم العثور على أن تكون الأكثر تنوعا لإعداد عينة مختلفة يحتاج²¹ ويناقش البدائل في القسم الأخير من هذه المقالة (الشكل 1).

عند هذه النقطة، يجب على القارئ أن يلاحظ أن تقنيات إعداد العينات الأخرى مقبولة لتجارب 1 H R_1ρ RD، وأنه يمكن إجراء طرق أخرى للتحليل الهيكلي والوظيفي مع ^{العينات}المركبة مع التقنية المقدمة. ¹ H R_1ρ RD التجارب تتطلب تركيزات الحمض النووي الريبي عالية (من الناحية المثالية >1 mM) ، فضلا عن التجانس عالية ، سواء في طول الجيش الملكي النيبالي والتطابق الهيكلي لضمان توصيف موثوق بها من الديناميات الجزيئية. في المختبر النسخ (IVT) هو الأسلوب المفضل لكثير من الباحثين لإنتاج ¹³C /¹⁵N-المسمى عينات الحمض النووي الريبي بسبب توافر الفوسفات ثلاثي الفوسفات النيوكليوسيد المسمى (NTPs) ودمج سهل في رد الفعل الأنزيمي²². ومع ذلك، فإن البوليمرات T7 RNA المستخدمة على نطاق واسع (T7RNAP)²³^،²⁴^،²⁵ يعاني من انخفاض 5 ‘التجانس في حالة بعض تسلسل بدء²⁶^،²⁷ وغالبا أيضا 3 ‘التجانس أثناء الجريان السطحي النسخ²⁸. تنقية الأنواع المستهدفة RNA يصبح أكثر تكلفة وشاقة بسبب الحاجة إلى كميات كبيرة من ~ 200 نانومول. وقد عرضت الطريقة المستخدمة هنا سابقا حيث نوقشت مزايا في²¹كبيرة. باختصار ، فإنه يحل القضايا الموصوفة عن طريق نسخ نسخة أكبر جنبا إلى جنب التي يتم بعد ذلك موقع محدد مشقوق من قبل Escherichia coli RNase H ، مسترشدة أوليغونوكليوتيد²⁹^،³⁰ (انظر الشكل 2 للحصول على تفاصيل).

إدراج تسلسل فاصل في نهايات 5 ‘و 3’ من نص جنبا إلى جنب يسمح باستخدام تسلسل بدء عالية الغلة وإزالة يتدلى محطة قريبة من موقع الخطية من قالب البلازميد، على التوالي (الشكل 2B). وقد ثبت أن هذه الطريقة لتحسين الغلة بشكل كبير، مع خفض التكلفة والعمالة، مع التحذير من توليف قالب أكثر تعقيدا والحاجة إلى إنزيم إضافي وoligonucleotide. خصوصية عالية من شق RNase H يسهل تنقية بسبب عدم وجود أنواع الحمض النووي الريبي في نطاق حجم مماثل. يستخدم هذا البروتوكول تبادل الأيونات عالية الأداء السائل الكروماتوغرافيا (HPLC) الخطوة التي تم نشرها من قبل هذا المختبر مؤخرا³¹، على الرغم من أن أساليب أخرى هي بدائل ممكنة. ¹ H R_1ρ RD يمكن, بشكل عام, يمكن الحصول عليها على عينات المسمى أو غير المسمى مع اثنين من تسلسل النبض كل منهما, “المسمى” ¹H R_1ρ ارتباط الكم واحد heteronuclear (HSQC) القائم على تجربة مع البعد غير المباشر ¹³C¹⁰ و “غيرالمسمى“ ¹H R_1ρ SELOPE القائم على تجربة مع البعد غير المباشر ¹H²⁰.

يمكن أن تكون هذه التجارب ثنائية الأبعاد (ثنائية الأبعاد) بمثابة فحص أول ، بغض النظر عما إذا كانت الديناميكيات على مقياس الوقت R_1ρ موجودة في العينة. ويمكن الحصول على لمحة عامة عن RD لجميع القمم التي تم حلها في الأطياف ، ويمكن تحديد قمم الاهتمام لتحليل RD أكثر شمولا. وهذا يعني أنه حتى العينات غير المسماة يمكن فحصها قبل اتخاذ قرار بإنتاج عينة أكثر تكلفة وعلامة. بمجرد اختيار ذروة مساهمة التبادل التوافقي ليتم دراستها بشكل أكثر شمولا ، فمن الأفضل التحول إلى الإصدارات 1D من التجارب المذكورة أعلاه (إذا كان لا يزال من الممكن حل الذروة) لإجراء ما يسمى بتجارب الرنين. للإصدار المسمى، يتم استبدال نقل HSQC إلى ¹³C بخطوة انتقائية عبر الاستقطاب غير النووي (HCP) كما هو مستخدم في ¹³C R_1ρ التجارب³²^،³³^،³⁴^،³⁵، بينما في حالة تجربة SELOPE ، يتم تشغيل التجربة ببساطة ك 1D ، وهو مفيد بشكل خاص لإشارات H8 و H2 التي تكذب على قطري في 2D على أي حال. وأحد المعايير التي يمكن استخدام التسلسل فيها، شريطة توافر عينة تحمل علامات أو عينات غير محددة، هو مدى عزل ذروة الاهتمام في التجربتين.

بشكل عام ، يوصى بتجربة SELOPE لعينات الحمض النووي الريبي التي تصل إلى 50 نيوكليوتيدات. وبالنسبة لرناس أكبر، سيكون التداخل أكبر؛ ومع ذلك، فإن النيوكليوتيدات المثيرة للاهتمام هيكليا غالبا ما تظهر في مناطق التحول الكيميائي التي هي أقل تداخلا ولا يزال من الممكن الوصول إليها في الرنانات الأكبر. وثمة حجة أخرى هي أنه في العينات غير الم عنها، لا يحدث اقتران J بين ¹H و ¹²C. ومع ذلك ، كما يتم تعريف الحد الأدنى من قوة قفل الدوران من خلال الحد الأدنى من الطاقة المستخدمة لفصل هاتين الدورانتين (~ 1 كيلوهرتز) في التجربة المسماة ، تسمح التجربة غير المسماة باستخدام نطاق أوسع من نقاط قوة قفل الدوران (SL) وبالتالي الوصول إلى مقياس زمني أوسع للتبادل. هذه التجارب خارج الرنين توفير معلومات إضافية إلى ك_{السابقين}، مثل السكان من الدولة متحمس (بديل conformer) ، ع_ES، فضلا عن معلومات قيمة جدا التحول الكيميائي في شكل Δω (الفرق التحول الكيميائي للدولة الأرض والدولة متحمس).

الشكل 1: سير العمل للبروتوكول المقدم. التحضير قبل الإنتاج الفعلي على نطاق واسع عينة، وتتكون من إعداد القالب وتأكيد النسخ في المختبر الناجحة وانشقاق RNase H. إنتاج واسع النطاق بما في ذلك تنقية HPLC، وملء أنبوب NMR، وتأكيد للطي الحمض النووي الريبي. وفي حالة التوليف المسمى بالنظائر، ينبغي إجراء تنقية غير المسماة لتحسين التدرج في نفس اليوم. وصف NMR للديناميكيات التوافقية مع تجارب R_1ρ. يمكن تنفيذ كل خطوة بشكل مستقل، على سبيل المثال،يمكن تطبيق تحليل ^{RD 1} H R_1ρ على أي عينة RNA مناسبة تنتج بطريقة أخرى. المختصرات: IVT = في النسخ المختبري؛ HPLC = الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء؛ NMR = الرنين المغناطيسي النووي. RD = تشتت الاسترخاء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الهدف من هذا البروتوكول هو توفير تفاصيل عملية ومعلمات حاسمة لدراسة ديناميات تشكيلية مع ¹H R_1ρ تشتت الاسترخاء في جزيئات دبوس الشعر RNA. بعد تقديم بروتوكول مفصل للتصميم، والتوليف، وتبادل أيونات HPLC تنقية RNA الهدف التي يمكن تنفيذها باستخدام جميع، بعض، أو لا شيء NTPs كما ¹³C/¹⁵N-المسمى الإصدارات، وقد وصفت سير العمل لوضع اللمسات الأخيرة على عينة NMR وتأكيد تبادل المطابقة مع التحليل الطيفي NMR. وأخيرا، يتم وصف تفاصيل الإعداد من ¹H R_1ρ RD التجارب على مطياف بروكر NMR(الشكل 1). البروتوكول يعطي كل خطوة لإعداد الإصدار 1D لعينات المسمى وتعليقات إضافية وجدول لضبط لإعداد إصدار SELOPE (الجدول 2). بعد البروتوكول، تتم مناقشة الخطوات الهامة والطرق البديلة لإعداد العينة وإعداد ¹ H R_1ρ RD.

Protocol

الشكل 2: التمثيل التخطيطي لبروتوكول IVT الترادفي المبلغ عنه. (A) النسخ جنبا إلى جنب من قالب بلازميد خطي مع T7RNAP (يسار) والانقسام المتعاقب من قبل RNAse H من النص لتحقيق طول الهدف الجيش الملكي النيبالي، من إخراج دليل الحمض النووي الشميري (يمين). (ب) تخطيط مفصل للقالب جنبا إلى جنب بدءا من المروج T7RNAP الفيروسية، تسلسل بدء. تسلسل الهدف (الأزرق الداكن، المثال هنا هو 20 NT طويلة) يتكرر “ن” مرات. يكرر يحيط بها تسلسل 5′ و 3′ المسافة تتكون من النيوكليوتيدات الثمانية الأخيرة والأربعة الأولى, على التوالي, للسماح لإزالة تسلسل بدء وتقييد من وحدة تكرار الأولى والأخيرة. (ج) تهجين النص المترادف (الأحمر) وأدلة شق الشمير (الأخضر). RNase H يشق الجيش الملكي النيبالي مقابل الحمض النووي 5′ نهاية. الجناحين 2′-OMe الجيش الملكي النيبالي زيادة خصوصية من خلال تعزيز تقارب ملزمة من دليل الانقسام إلى الجيش الملكي النيبالي الهدف. وقد تم تعديل هذا الرقم من 21. الاختصارات: T7RNAP = T7 RNA بوليمرات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 1. إعداد العمل لبناء الجيش الملكي النيبالي الجديد تصميم وإعداد بلازميد اكتب تسلسل القالب في أداة استنساخ، على سبيل المثال. خذ تسلسل T7 الترويجي وأضف تسلسل بدء عالي الغلة (T7: 5′-TAATACGACTCACTATA ^GGGAGA-3′).ملاحظة: سيبدأ النسخ من النيوكليوتيدات المشار إليها مع الإقطور (^). تسلسل بدء GGGAGA متغير، ولكن تعتمد بقوة على التسلسل؛ لذلك، ينصح باستخدام هذا التسلسل. إضافة النيوكليوتيدات 8 الأخيرة (NT) من التسلسل الهدف كمسافة 5 ‘(5’S). إضافة تكرارات التسلسل الهدف (TS). إضافة النيوكليوتيدات الأربعة الأولى كمسافة 3 ‘بعد التكرار (5’S). إضافة موقع تقييد BamHI (RS) أو موقع تقييد فريد مشابه.ملاحظة: سيتم استنساخ التسلسل الكلي كما هو مبين أو طلبها بسهولة في البلازميد البكتيري عالي النسخ(على سبيل المثال.، pUC19): 5’T7-5’S-(TS)n-3’S-RS-3 ‘(الشكل 2B). يجب أن يكون عدد التكرارات مرتفعا كما يسمح به تخليق الجينات (بحد أقصى 600 nt في هذا البروتوكول). تضخيم البلازميد في الإشريكية القولونية باستخدام مجموعة تجارية. الخطية plasmid المنقى في 20 نانوغرام / ميكرولتر باستخدام موقع التقييد المناسب. مقياس تقييد هضم مع BamHI بنسبة تصل إلى 1 مل. تنقية البلازميد المهضوم ، وتأكيد الخطية الناجحة على هلام الآغاروز 1٪. تخزين البلازميد الخطي في -20 درجة مئوية لعدة أشهر. تصميم دليل الانقسام (الشكل 2C) اكتب النيوكليوتيدات الثمانية الأخيرة من تسلسل الحمض النووي الريبي المستهدف في اتجاه 5′-3 ، وأضف أول أربع نويدات من تسلسل الحمض النووي الريبي المستهدف في النهاية 3 أيضا في اتجاه 5’-3. توليد تكملة الحمض النووي العكسي لهذا التسلسل تغيير النيوكليوتيدات الأربعة الأولى والأخيرة إلى تعديلاتها 2’OMe بإضافة ‘م’ قبل حرف النيوكليوتيدات.ملاحظة: بالنسبة للتوليف، يتم استخدام وحدة mU بدلا من mT. اطلب القلة مع تنقية تحلية قياسية.ملاحظة: تحقق مما إذا كان oligo التي تم إنشاؤها يمكن ربط في مكان آخر غير الاتصال تسلسلين RNA. ويلزم التكامل الكامل في النيوكليوتيدات الأربعة المركزية للحمض النووي، في حين أن المناطق المحيطة يمكن أن تسمح بعدم التطابق. إذا لزم الأمر، توسيع الجناحين إلى ما يصل إلى 18 NT لتوليد تسلسل ربط فريدة من نوعها36. IVT صغير النطاقملاحظة: للعمل الخالي من RNase، قم بإعداد جميع الكواشف في ظل ظروف معقمة وخالية من RNase. استخدم كاشف إزالة التلوث RNase (انظر جدول المواد)و95٪ v/v الإيثانول لتنظيف أسطح العمل والمواسير قبل الاستخدام. اغسل القفازات مع الإيثانول بنسبة 95٪ وارتد ملابس طويلة الأكمام خالية من الوبر. لتقليل تلوث الرناس، لا تتنفس فوق الأنابيب المفتوحة. إعداد حلول المخزون من تريس-Cl (pH 8.0)، dithiothreitol، MgCl2،الحيوانات المنوية، وNTPs / GMP (غير مطهر). خلط الكواشف كما هو مبين في الجدول 1. إعداد مزيج رئيسي من هذه الكواشف مقدما، قبل إضافة الإنزيمات أو الأحماض النووية.ملاحظة: إذا كنت تستخدم الكواشف المجمدة، فاخلطها جيدا بعد ذوبانها. وقد تترسب الكواشف إذا خلطت بتركيزات عالية جدا، لذلك يوصى بشدة باتباع الترتيب الوارد في الجدول 1. إضافة بالترتيب التالي: البلازميد، دليل الانقسام، فوسفاتاز غير العضوي (IPPase)، RNase H، T7RNAP. وبما أن نشاط الإنزيم قد يختلف بالنسبة للإنزيمات المنتجة داخل المنزل، فاختبر عدة تركيزات قبل اختيار أفضلها.ملاحظة: تضمين عنصر تحكم سالب لرد فعل الانقسام، على سبيل المثال، بدون RNase H، لإسناد نطاق هدف مفقود إلى شق RNase H معيبة وليس إلى النسخ غير الناجح. احتضان رد الفعل عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة وتأكيد رد الفعل على إلكتروفورسيس هلام البولي أكريلاميد (PAGE)(الشكل 3A). تمييع العينة 10 أضعاف في تحميل الحل، وتحميل 1 ميكرولتر على هلام.ملاحظة: خليط الجل: 8 م يوريا، 20٪ أكريلاميد (19:1 أكريلاميد: بيساكريلاميد) في 1x TBE. محلول التحميل: 5 مليون حمض إيثيلينديامين رباعي الأسيتيك (EDTA)، 300 ميكرومتر بروموفينول أزرق في فورماميد. لا يمكن توقع أن تكون ردود فعل RNase H الانشقاق كاملة بعد 1 ساعة، كما يتم إنتاج الحمض النووي الريبي الجديد باستمرار. عند هذه النقطة، ابحث عن نطاق هدف واضح وعدم وجود نوع من الوزن الجزيئي مماثلة(على سبيل المثال،±3 النيوكليوتيدات (NT) المنتجات). الكاشف تركيز المخزون مقياس صغير للكمية (ميكرولتر) H2O – 24 تريس 1 م 5 مجمكل2 1 م 0.5 DTT 1 م 0.5 الحيوانات المنوية 250 مليون متر 5 GMP 100 مليون متر 2.5 ATP 100 مليون متر 1.5 GTP 100 مليون متر 1.5 UTP 100 مليون متر 1.5 CTP 100 مليون متر 1.5 بلازميد 20 نانوغرام/ميكرولتر 5 دليل الانقسام 100 ميكرومتر 10 iPPase 10 ملغم/مل 0.5 RNase H 10 ميكروغرام/مل 2 T7 RNA بوليمراز 5 ملغم/مل 2 الجدول 1: جدول الكاشف لIVT جنبا إلى جنب وانشقاق RNase H المتزامن. يمكن تكييف تركيزات المخزون لراحةالمستخدم. إذا كان يجب أن يتم إجراء RNase H الانقسام بعد T7 IVT، إضافة دليل الانقسام وRNase H بعد تعطيل الحرارة من T7RNAP. المبالغ المستخدمة مقياس خطيا مع مقياس رد الفعل. الاختصارات: T7RNAP = T7 RNA بوليمرات؛ IVT = النسخ في المختبر. 2. إعداد عينة NMR توسيع نطاق رد الفعل على حجم المطلوب (عادة 10 مل)، وتشغيل رد الفعل بين عشية وضحاها. اختبار لاستكمال رد الفعل في اليوم التالي مع هلام الصفحة denaturing (الشكل 3A).ملاحظة: يظهر رد فعل الانقسام غير المكتمل من خلال أنواع الوزن الجزيئي الأعلى فوق النطاق المستهدف. إذا لم يكن الانقسام ناجحا أو كاملا ، فإن الحمض النووي الريبي ومرشد الانقسام في وعاء التفاعل عن طريق تسخين المحلول في ميكروويف تقليدي عند 450 واط لمدة 15 ث. تبريد الحل ببطء إلى 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة. استخدم كتلة تسخين لأحجام أقل من 1 مل. لاحظ تشكيل عجل جديدة. إضافة المزيد من IPPase وRNase H، واحتضان لآخر 1-3 ساعة في 37 درجة مئوية. تأكيد الانتهاء من رد فعل الانقسام مع إزالة النتور الصفحة. عند اكتمال رد فعل RNase H الانقسام، إخماد رد الفعل عن طريق إضافة EDTA إلى التركيز النهائي 50 mM ودوامة جيدا.ملاحظة: هطول الأمطار البيرفوسفات المحتملة سوف تذوب، وأشكال جديدة من البروتين الراسب. تصفية الحل من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر، والتركيز على حجم حقن في نظام HPLC، اعتمادا على حجم حلقة الحقن.ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا بواسطة نموذج التجميد عند -20 درجة مئوية. تنقية HPLC على نطاق واسع إعداد المخازن المؤقتة تبادل الأيونات A و B في غضون أسبوع واحد من الاستخدام. تصفية وإزالة الغاز عن المخازن المؤقتة.ملاحظة: المخزن المؤقت A: خلات الصوديوم 20 mM; 20 مليون بيركلورات الصوديوم، pH 6.5. العازلة B: خلات الصوديوم 20 mM; 600 مليون بيركلورات الصوديوم، pH 6.5. إعادة توازن العمود مع 100٪ المخزن المؤقت B متبوعا المخزن المؤقت A 100٪ لوحدات تخزين عمود 2 على الأقل عند 75 درجة مئوية. إعداد تسلسل HPLC (الشكل 3B) بمعدل تدفق 5.5 مل/دقيقة. استخدم التسلسل التالي لتنقية الحمض النووي الريبي بين 20 و 30 nt: 0-7 دقيقة: 0٪ B؛ 7-16 دقيقة: تدرج 0-20٪ B؛ 16-46 دقيقة: elution، وعادة مع الانحدار من 20-30٪ B (تحسين وفقا للاحتياجات)؛ 46-62 دقيقة: 100٪ ب; 62-73 دقيقة: 0٪ ب.ملاحظة: تغيير في معدل التدفق من 5.5 إلى 8 مل/دقيقة لم يؤثر على الفصل في هذا البروتوكول. تحسين تدرج elution عن طريق حقن ما يعادل 1 مل من رد فعل النسخ (غير تسمية) في وقت واحد.ملاحظة: لمزيد من التفاصيل والمناقشة، راجع كارلسون وآخرون31 وفير وآخرون21. اختبار الكسور التي تم جمعها على صفحة إزالة التشوهات. إذا كانت ذروة elution الرئيسية معزولة بشكل جيد وتحتوي على الحمض النووي الريبي المستهدف النقي ، فتدرج التنقية إلى ما يعادل 10 مل من تفاعل النسخ. جمع كسور الفائدة، والتركيز، وتبادل المخزن المؤقت مع المخزن المؤقت NMR. استخدم وحدة فلترة فائقة المركزية (راجع جدول المواد)للكميات التي تزيد عن 50 مل.ملاحظة: NMR العازلة: 15 مليون فوسفات الصوديوم; 25 مليون كلوريد الصوديوم. 0.1 mM EDTA، رقم الحموضة 6.5. لتقليل الخسارة الناتجة عن التزام الحمض النووي الريبي بجدران الأنبوب البلاستيكي، اغسل جميع أنابيب التجميع 1 مل من الماء ودوامة وطارد مركزي لجمع جميع السوائل. تحديد التركيز عن طريق التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية. حساب العائد رد فعل وفقا لفيرر وآخرون21.ملاحظة: يجب ألا يقل تركيز عينة NMR لتجارب RD عن 130 نانومول، وهو ما يعادل 500 ميكرومتر في حجم عينة من 250 ميكرولتر باستخدام أنابيب NMR (جدول المواد). طي عينة الحمض النووي الريبي تمييع وaliquot عينة من حجم ~ 10 مل إلى 1 مل لكل أنبوب. سخني ال RNA aliquots إلى 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. التقط العينات لتبريدها عن طريق وضعها على الجليد أو في خليط من الماء والجليد والملح واحتضان لمدة 30 دقيقة. تجمع العينات والتركيز إلى ~ 250 ميكرولتر في وحدة تصفية الطرد المركزي 2 مل. ملء أنبوب NMR تنظيف أنبوب NMR في نظافة أنبوب NMR عن طريق التنظيف بالماء الوفير، RNase إزالة التلوث الكاشف، والمياه، 95٪ الإيثانول (EtOH)، والماء مرة أخرى. يترك ليجفف. تنظيف المكبس عن طريق الشطف بالماء ومسح مع كاشف إزالة التلوث RNase و 95٪ EtOH باستخدام مسح خالية من الوبر. يترك ليجفف. إضافة 10٪ (v/v) من D2O إلى عينة NMR. ملء عينة الجيش الملكي النيبالي في أنبوب NMR باستخدام تلميح ماصة كبيرة. دع السائل يتدفق على طول جانب جدار الأنبوب. إدراج المكبس وإزالة فقاعات الهواء عن طريق دفع المكبس إلى أسفل جنبا إلى جنب مع حركة التواء سريع. سحب المكبس ببطء دون خلق فقاعات الهواء الجديد وإصلاحه مع فيلم شمع البارافين. تأكيد للطي من قبل NMR.ملاحظة: في هذه المرحلة، من الضروري إجراء مهمة الرنين الجزئي على الأقل لتأكيد البنية الثانوية لعينة الحمض النووي الريبي وتحديد المناطق ذات الأهمية لدراسة الديناميكيات التركيبية. وصف شامل على واجب الرنين الجيش الملكي النيبالي يتجاوز هذا البروتوكول، وبالتالي نشير إلى الأدب راسخة في هذه المرحلة19،37،38. يمكن أن يكون فحص تحول الحركة الكهربائية (EMSA) مؤشرا مفيدا على طي الحمض النووي الريبي ويكون بمثابة بيانات تكميلية لتجارب NMR. قارن الأطياف التالية للعينة التي يتم إجراء تجارب RD 1 H R1ρ مع العينة المرجعية المطوية بشكل صحيح(الشكل 4): 1H 1D ، وخاصة منطقة إيمينو 10-15 جزء في المليون ؛ العطرية 1H،13C-HSQC؛ 1 H،1H-SELOPE (اختياري).ملاحظة: بصمة العطرية ضروري أيضا، حتى في حالة الاتفاق بين إشارات إيمينو، لأن تشكيل ديمر غالبا ما يظهر نفس أو ما شابه ذلك إشارات imino كما دبوس الشعر RNA. يمكن أن تحل تجربة SELOPE محل 1H و13C-HSQC لبصمات الأصابع العطرية ، حيث تستغرق التجارب غير النووية على العينات غير المبوبة وقتا طويلا جدا. استخدم حلقة UUCG كمرجع بصمة الإصبع (إذا كان موجودا). إجراء هذه المقارنة في كل مرة قبل 1H R1ρ RD التجارب المسجلة. 3. 1H R1ρ تشتت الاسترخاء—على الرنين(وصفت 1D الإصدار) ملاحظة: تصف الخطوات أدناه إعداد تجارب RD لعينة تحمل علامة باستخدام الإصدار 1D من تسلسل نبض RD المستند إلى HSQC. اتبع نفس الخطوات للتسلسل 1D المستندة إلى SELOPE لعينات غير تسمية. يتم عرض نظرة عامة على أسماء المعلمات والإعدادات لكلتا الحالتين في الجدول 2. التركيز على الإصدارات 1D لأنها أكثر عملية لقياسات خارج الرنين، وإعداد الإصدارات 2D من التجارب المستندة إلى SELOPE وHSQC وقد نوقشت بالتفصيل من قبل شلاغنيتويت وآخرون20 وشتاينر وآخرون10،على التوالي. تحديد 1H السلطة لنبض 90 درجة الثابت (P1). الخيار أ: استخدم الأمر نبض بروكر. الخيار ب: في تجربة zg، حدد نبض 360درجة عن طريق قياس منحنى الجوز في مستوى الطاقة البروتون الثابت نبض على ذروة المياه.ملاحظة: طول النبض 90 درجة هو ربع المدة التي يتم فيها ملاحظة إشارة الصفر (إذا تم قياس منحنى النودق الكامل ، فهو الصفر الثاني ؛ ومع ذلك ، في الممارسة العملية ، يتم أخذ عينات فقط من المنطقة المحيطة بالقيمة المتوقعة ل 360درجة). تشغيل 1H 1D الطيف zgesgp.f2f3dec باستخدام طول النبض المحدد في الخطوة 3.1 لتأكيد للطي الجيش الملكي النيبالي قبل كل قياس R1ρ.ملاحظة: إذا تم تشغيل تجارب 1H SL للمرة الأولى، تحقق مما إذا كانت طاقة SL المحسوبة تتوافق مع الطاقة التي تم تسليمها إلى العينة عن طريق معايرة طاقة SL لكل عرض النطاق الترددي المطلوب. وترد تفاصيل خطوات المعايرة في شتاينر وآخرون10. إنشاء 1H R1ρ لمجموعة البيانات المسماة، وتعيين المعلمات الرئيسية. إنشاء مجموعة بيانات جديدة; بشكل مثالي استنادا إلى 1H-13C العطرية HSQC مجموعة البيانات كما تستخدم على عينات الحمض النووي الريبي المسمى بالكامل لمهمة الجيش الملكي النيبالي.ملاحظة: هذا سيضمن أن 13C بالإضافة إلى 15N الطاقة و طاقة فصل تم إعدادها بالفعل. تعيين المعلمات العامة وفقا للجزء الأول من الجدول 2. تعيين معلمات RD محددة وفقا للجزء الثاني من الجدول 2. تعيين 1H SL الطاقة إلى أدنى قيمة (1.2 كيلو هرتز) للاختبار. إنشاء قائمة vd اختبار مع إدخال واحد فقط، 0 مللي ثانية، (لتحسين قائمة vd، كما هو موضح في الخطوة 3.4)، تعيين TDF1 إلى 1، وتحديث D30. تشغيل طيف اختبار مع هذه الإعدادات. تحسين قائمة vd (قائمة أطوال SL ليتم استخدامها). تشغيل التجربة مع قائمة VD اختبار (على سبيل المثال،ستة إدخالات: 0 متر، 5 م، 10 م، 20 م، 30 م، 40 م؛ التدافع هذه القيم لتجنب الأخطاء المنهجية بسبب التدفئة). تحديث D30 و TDF1 وفقا لذلك (في هذا المثال، D30 = 42m و TDF1 = 6). كثافة المؤامرة من ذروة مقابل طول SL. تحديد طول SL الذي تنخفض فيه كثافة الذروة الأصلية إلى 1/3. إنشاء قائمة vd النهائية لاستخدامها في التجربة، مع الأخذ في الاعتبار ما يلي: تحديد أطول طول SL كما هو موضح في الخطوة السابقة؛ تحديد طول SL أطول كما هو موضح في الخطوة السابقة; تجنب استخدام قائمة بترتيب تنازلي أو تصاعدي؛ وإضافة بعض التكرارات للدراسات الإحصائية. تذكر تحديث D30 و TDF1 في كل مرة توجد أية تغييرات في قائمة VD.ملاحظة: يتم تشغيل التجربة مع أطوال SL مختلفة كما هو معطى في قائمة VD بطريقة زائفة 2D. حدد عدد عمليات المسح الضوئي بحيث يكون لأضعف قمة في القائمة نسبة إشارة إلى ضوضاء (SINO) لا تقل عن 10.ملاحظة: على الرغم من أن قائمة vd تم تحسينها لطاقة SL منخفضة (1.2 كيلوهرتز)، إلا أنه يجب أيضا اختبار قائمة vd هذه بأعلى طاقة SL لاستخدامها(على سبيل المثال،15 كيلوهرتز). وذلك لأن الاضمحلال سيكون أبطأ بكثير في قوة SL عالية لقمة مع مساهمة كبيرة كEX. لذلك، ينبغي أيضا التحقق من اضمحلال كافية في قوة SL عالية. وصف المعلمة اسم المعلمة في تسلسل النبض 1D المسمى 1D سيلوب برنامج نبض ل 1Ds على الرنين 1HR1rho_HCP_onres1D.es 1HR1r_HH_onres1D.js 1 ترددات الحامل H (ppm) O1P = صدى الماء في ppm O1P = التحول الكيميائي لذروة الاهتمام (جزء في المليون) CNST28 = التحول الكيميائي لذروة الاهتمام (جزء في المليون) CNST29 = صدى الماء في ppm 1 H الثابت 90º نبض P1 @ PL1 (كما تم معايرة في 3.1.1) P1 @ PL1 (كما تم معايرة في 3.1.1) البقول على شكل والقوى لقمع المياه P25 = 1000 لنا @ sp3 P12 = 2000 لنا @ sp1 (ووترغيت) (نحت الإثارة) 13 C الناقل التردد، على الرنين مع 13C التحول الكيميائي من ذروة الاهتمام O2P – 15 N تردد الناقل، متوسط 15N التحول الكيميائي لفصل (كما هو مستخدم في HSQC العطرية) O3P – 13 C/15N فصل (إعداد كما هو الحال في HSQC) pcpd2، cpd2 – pcpd3، cpd3 نقل HCP (على سبيل المثال، p=1/J @ 100 هرتز) – يمكن استخدام الأوامر pulsef2 والنبض لتحديد القوى من النبضات الصلبة المدة (تعيين إلى 1/J (1H -13C) ذروة الاهتمام) P11 قوة 1H وطاقة على 13C SP1، SP12 SELOPE نقل (د = 1/4J (H5-H6)) – D5 نبض انتقائي (على سبيل المثال، منطقة العطرية) لسيلوب (4000 لنا، Eburp) – P13 و SP4 SL / RD محددة المعلمات: 1 H SL السلطة، التي تم الحصول عليها من النبض الصلب معايرة (على سبيل المثال، باستخدام الأمر نبض). Pl25 وCNST12 (1.2 – 15 كيلوهرتز) Pl24 (50 هرتز – 15 كيلوهرتز) قائمة تأخير متغير لمدة SL (في البداية إدخال 1، 0، التحسين الموضحة تحت 3.1.3) vdlist (~ 0 – 40 مللي ثانية) vdlist (~ 0 – 150 مللي ثانية بسبب انخفاض R2 في عينات غير موسلة) TDF1 عدد الإدخالات في قائمة VD (1 في البداية) TDF1 TDF1 تعويض الحرارة: D30 = أكبر قيمة في قائمة VD + 2ms D30 D30 تعويض حراري إضافي لمجموعة واسعة جدا من SLs PL25 معلمات محددة خارج الرنين: برنامج نبض ل 1Ds خارج الرنين 1HR1rho_HCP_offres1D.es 1HR1r_HH_offres1D.js إزاحة للتجارب خارج الرنين CNST30 CNST30 الجدول 2: نظرة عامة على المعلمات لإعداد تجارب 1D HCP المستندة إلى و 1D-SELOPE المستندة إلى 1H R1ρ. الاختصارات: 1D = أحادي الأبعاد؛ HCP = الاستقطاب عبر الغيرية؛ SELOPE = تجربة بروتون محسنة SELective; جزء في المليون = أجزاء في المليون؛ HSQC = ارتباط الكم تدور غير نووية; SL = قفل الدوران; RD = تشتت الاسترخاء إعداد واكتساب تجارب الرنين 1H R1ρ نسخ التجربة من القسم 3.4 إلى مجلد جديد في Topspin. في هذا المجلد، قم بإعداد التجارب في نقاط القوة SL مختلفة، في كل مرة تغيير PL25 وCNST12. تحديد مستوى الطاقة الصحيح لكل قوة SL باستخدام الأمر نبض. استخدم نقاط قوة SL تتراوح بين 1.2 إلى 15 كيلوهرتز، مع أخذ عينات أكثر كثافة لنقاط القوة المنخفضة في SL (انظر الشكل 5G للحصول على نقاط قوة SL محددة). إضافة نسخ من بعض التجارب أن يكون التكرارات لبعض نقاط القوة SL. قم بتشغيل هذه التجارب. تحليل التجارب على الرنين 1H R1ρ في TopSpin، معالجة كل شريحة من كل مجموعة بيانات زائفة 2D باستخدام معلمات المعالجة نفسها(على سبيل المثال، توسيع الخط، المرحلة) باستخدام الأمر xf2،وتقسيم مجموعة البيانات إلى 1Ds باستخدام برنامج Bruker AU split2D. الحصول على كثافة الإشارة ووحدات التخزين لكل شريحة 1D.ملاحظة: في الممارسة العملية، فمن الأفضل أن deconvolve الأطياف للتخلص من المساهمات من القمم المتداخلة المحتملة ويسمح باستخدام برنامج الاتحاد الافريقي Bruker multidcon، الذي يلخص مريح كثافة أو مناطق من قمم جميع شرائح في تجربة واحدة في ملف النص decall.txt، التي يمكن بعد ذلك أن تقرأ بسهولة مع برامج أخرى (استخدمت نصوص بيثون مكتوبة في المنزل هنا، كما وصفها شتاينر وآخرون10)في الخطوتين 3.6.3 و 3.6.4. تناسب الاضمحلال الأسي أحادية لكل قوة SL للحصول على R1ρ (أو على الرنين، R2+REX) قيمة. رسم تلك القيم R2+REX (ص) مقابل. قوة SL (x) (الشكل 5F، G).ملاحظة: إذا كانت القيم أعلى بكثير لنقاط القوة المنخفضة SL وانخفاض مع قوة SL أعلى (كما هو موضح في الشكل 5G)،ثم الذروة التحقيق يظهر التشتت، وأنه قد يكون من المثير للاهتمام لإجراء تجارب إضافية (خارج الرنين) للحصول على معلومات حول السكان والفرق التحول الكيميائي للدولة متحمس مقابل. الحالة الأرضية. 4. 1H R1ρ التشتت الاسترخاء- خارج الرنين (المسمى الإصدار 1D) إعداد واكتساب تجارب الرنين 1H R1ρ في مجلد topspin جديد، إعداد التجارب في قوة SL معينة (عادة أولا في أدنى قوة SL كما مساهمة REX هو أعلى هناك، انظر الشكل 5G لاختيار ممثل من SLs خارج الرنين)، ولكن مع إزاحات مختلفة، في كل مرة تغيير CNST30. استخدام الإزاحات تصل إلى ± (3 أو 4)* قوة SL، مع أخذ عينات أكثر كثافة حول 0 الإزاحة، كما يمكن أن نرى في الشكل 5H،I. قم بتشغيل هذه التجارب. تحليل التجارب خارج الرنين 1H R1ρ استخدم نفس استراتيجية المعالجة، كما في 3.6.1-3.6.3، لتحديد قيمة R1ρ لكل إزاحة. رسم تلك القيم مقابل الإزاحة (الشكل 5G).ملاحظة: عدم التماثل في هذا المنحنى يمكن أن تشير بالفعل إلى أنه يمكن الحصول على معلومات التحول الكيميائية لحالة متحمس. تركيب شامل وتحليل باستخدام معادلات بلوخ ماكونيل أو لاغيري يجب أن تنفذ للحصول على معلومات عن كEX، عES وكذلك Δω10،20 ( الشكل5G). يمكن العثور على مجموعات البيانات وبرامج النبض ووحدات الماكرو لكل من التجارب 1D على مستودع Petzold Lab Github (https://github.com/PetzoldLab). ويرد في الجدول 2نظرة عامة على المعلمات.

Representative Results

بروتوكول لإنتاج الحمض النووي الريبي يسهل تنقية من خلال توليد النصوص عالية النقاء. ويبين الشكل 3 ألف نتائج عدة ردود فعل انشقاقية للنصوص المترادف، مما يوفر ردود فعل ناجحة وغير ناجحة على حد سواء. يظهر Lane 1 الحالة المثلى لنسخة مشقوقة بالكامل مع آثار باهتة فقط للمنتجات الجانبية. يظهر Lane 2a انشقاقا غير مكتمل ، والذي يمكن حله عن طريق إعادة التلين وإضافة المزيد من RNase H (Lane 2b ، الخطوة 2.1.2). بناء الجيش الملكي النيبالي من الممرات 1، 2a، و 2b هي نفسها. العينة في الممر 3 تظهر انشقاق غير ناجح. استكشاف هذا التفاعل ينطوي على التحقق من تسلسل دليل الانقسام، ونقاء قالب الحمض النووي، ودرجات الحرارة الصلبة. يحتمل أن يكون RNase H الانقسام يجب أن يتم بعد T7 IVT كما هو مبين للعينة 2. العينة في حارة 4 يظهر كمية كبيرة من المنتجات الجانبية الانقسام، والتي يصعب إزالتها عن طريق HPLC تبادل الأيونات. استكشاف أخطاء مثل هذه العينة يمكن أن تتضمن (أ) خفض درجة الحرارة، ومقدار RNase H، أو وقت رد الفعل، (ب) تقليل تدرج elution وحجم الحقن ومحاولة فصل الكسور المستهدفة عن المنتجات الجانبية. وقد نوقشت معلومات إضافية حول كيفية زيادة القرار في تبادل الأيونات تنقية HPLC كارلسونوآخرون. يفصل HPLC الحمض النووي الريبي المستهدف عن الأحماض النووية الأطول أو الأقصر والبروتين أو الملوثات ذات الجزيئات الصغيرة. ويبين الشكل 3B النتيجة المثلى لتنقية HPLC لتبادل الأيونات. وينبغي اختيار تدرج الإلتواء بحيث أن الأنواع المستهدفة من الحمض النووي الريبي تختفي على الأقل حجم عمود واحد (في هذا المثال: 35 مل) بعد الأنواع الصغيرة التالية وحجم عمود واحد قبل الأنواع الأكبر التالية. وتشمل الأنواع الأصغر في هذه الطريقة النيوكليوتيدات المفردة، والمنتجات المجهضة (8-12 nt)، وتسلسل الفواصل 3 و 5 بوصات (5-14 nt)، ودليل الانقسام (12 nt حمض النيوكليك الشميري)، في حين أن التسلسلات الأطول هي تكرارات ترادفية غير نظيفة وبلازميد. عندما يتم تحقيق ذروة elution فصلها جيدا، يمكن توسيع نطاق تنقية تصل إلى ما يعادل ~ 20 مل من تفاعل IVT لكل حقنة. إن الحظيرة الصحيحة لعينة الحمض النووي الريبي أمر بالغ الأهمية لتجارب RD ويجب تأكيدها قبل كل قياس. يظهر الشكل 4 RNA 22 mer المسمى A قبل تطبيق بروتوكول الطي في الخطوة 2.4 (الأزرق) ، وتم تحقيق نفس العينة بعد الطي الصحيح (أحمر). A ماك أضعاف التنبؤ هيكل ثانوي (الشكل 4C) يقترح هيكل دبوس الشعر المقدمة مع 4 أزواج قاعدة مما أدى إلى 5 إشارات إيمينو. يؤكد كلا الأطياف في الشكل 4A هذه الإشارات المتوقعة ، وإن كانت بكثافات نسبية مختلفة قليلا ، مما يشير إلى أن بعض البنية المطوية (هنا ، باهتة) يمكن أن تكون إشكالية في التقييم مع أطياف 1H 1D فقط. العطرية 1H،13C-HSQC الطيف (الشكل 4B)،ومع ذلك، يظهر فقط 3 من الإشارات العطرية للعينة قبل بروتوكول للطي (الأزرق)، ولكن جميع الإشارات 4 للعينة التي تم طيها وفقا للخطوة 2.4 (أحمر). العينة المعروضة باللون الأزرق شكلت على الأرجح homodimer (هيكل المقترحة في الشكل 4D)من شأنها أن تؤدي إلى إشارات imino نفسه كما دبوس الشعر. ويبدو أن إشارة A13H2 قد اتسع نطاق التبادل. تساعد هذه النتائج على تسليط الضوء على أهمية تأكيد للطي مع كل من تجارب بصمات الأصابع إيمينو والعطرية قبل كل تجربة RD. تسمح تسلسلات النبض 1H R1ρ الموصوفة في هذا البروتوكول بالكشف عن الديناميكيات في نظام الصرف الوسيط. في البداية يتم تسجيل منحنى على الرنين، وإذا كانت الديناميات موجودة لبقايا محددة، تشتت مرئية داخل R 2 +Rالقيم EX التي تم الحصولعليها، في حين أن هذا المنحنى هو شقة للمخلفات دون تبادل. الشكل 5 يظهر تمثيل على الرنين منحنيات التي تم الحصول عليها لاثنين من مختلف الذرات H8 في دبوس الشعر الحمض النووي الريبي الاصطناعية (الشكل 5A)، حيث G6H8 تبادل الخبرات (الشكل 5C)، في حين أن A4H8 لا (الشكل 5B). وبما أن التبادل بطيء نسبيا في هذه العينة (kEX = 292 ± 40 هرتز)، فقد تم استغلال ميزة تجربة SELOPE لتحقيق نقاط قوة منخفضة في SL، وتم تسجيل المنحنيين على الرنين باستخدام الإصدار 1D من تسلسل النبض. ثم استخدم نفس تسلسل النبض للحصول على بيانات خارج الرنين للبقايا التي تظهر التشتت في الملف الشخصي على الرنين. يوضح الشكل 5D قيم R1ρ التي تم الحصول عليها مقابل الإزاحة حيث يشير عدم التماثل الطفيف للمنحنى بالفعل إلى علامة Δω. هذا يصبح أكثر وضوحا في R2+ REX مؤامرة حيث تتم إزالة مساهمة R1 (الشكل 5E). يظهر العمود الأيمن من نفس الشكل منحنيات تمثيلية على الرنين تم الحصول عليها لذرتين مختلفتين من H8 في دبوس شعر RNA اصطناعي مختلف قليلا مع تبادل أسرع ، حيث تبادل تجارب G6H8 (الشكل 5G) ، في حين أن A4H8 لا (الشكل 5F). سعر الصرف الأسرع(كEX = 43,502 ± 38,478 هرتز) سمح بتسجيل RD لجميع البروتونات العطرية في وقت واحد باستخدام إصدار SELOPE 2D للحصول على كل من البيانات على الرنين وخارجه (بيانات G6H8 المعروضة في الشكل 5H، I). المعرفات العامة للنتائج الإيجابية والسلبيةيمكن تحديد النتائج الإيجابية في IVT جنبا إلى جنب وRNase H الانقسام على النحو التالي: 1) الفرقة المستهدفة هي أقوى الفرقة في هلام الصفحة denaturing. 2) لا توجد أو فقط عصابات ضعيفة حول النطاق الرئيسي. 3) لا توجد أو فقط ضعف الأنواع الوزن الجزيئي أعلى. 4) يظهر الكروماتوجرام HPLC ذروة منفصلة جيدا من الجيش الملكي النيبالي الهدف. 5) عندما يتم أخذ عينات من الذروة الرئيسية ، يظهر شريط واحد فقط على هلام PAGE. النتائج السلبية في IVT جنبا إلى جنب وRNase H الانقسام الحالي على النحو التالي: 1) لا أو مجرد شريط رئيسي ضعيف مرئيا على هلام الصفحة الناسخة. 2) وهناك نمط من الأنواع ذات الوزن الجزيئي عالية من يكرر جنبا إلى جنب الجيش الملكي النيبالي مرئيا. 3) على الرغم من أن الفرقة الرئيسية موجودة، والعصابات من كثافة مماثلة هي فوق أو تحت النطاق الرئيسي داخل ± 3 NT. ويمكن تحديد عينة مطوية جيدا على النحو التالي: 1) عدد البروتونات imino لوحظ يطابق عدد البروتونات ايمينو المتوقع من محاكاة بنية ثانوية (على سبيل المثال، ماك أضعاف39، الشكل 4A). 2) وSyn G-U تمايل قاعدة الزوج في حلقة UUCG (إذا كان موجودا) مرئيا في ~ 9.5 ppm، وأحيانا مرئية فقط في درجة حرارة أقل. وقد وصف مزيد من بصمات الأصابع من حلقة UUCG من قبل Fürtig وزملاؤه40. 3) بصمة العطرية يتفق مع عينة المعينة سابقا التي تم تأكيدها لأضعاف بشكل صحيح(الشكل 4C). يمكن تحديد عينة مطوية أو متدهورة على النحو التالي: 1) هناك إشارات إيمينو أكثر مما تتوقعه محاكاة البنية الثانوية (ملاحظة: إشارات imino أقل لا تعني بالضرورة طيها ، حيث أن أزواج قاعدة الإغلاق غالبا ما تكون غير مرئية ، والتبادل التوافقي يوسع الخطوط). 2) عدم وجود إشارات إيمينو. 3) إشارات ضيقة من كثافة عالية في المنطقة العطرية، مما يدل على منتجات تدهور النيوكليوتيدات واحد. 4) الاختلاف بين إشارات imino أو العطرية لعينة مرجعية من للطي مؤكدة (الشكل 4C). يمكن تحديد ذرة تظهر أي تبادل في مقياس الوقت القابل للكشف على النحو التالي: 1) من ملف تعريف RD مسطح (بسبب مساهمة REX المفقودة التي تختلف مع قوة SL المطبقة)(الشكل 5B والشكل 5F). 2) يجب توخي الحذر في حالة التبادل البطيء الوسيط عندما تكون kEX و Δω بنفس الحجم. وفي هذه الحالة، يمكن أن تكون المساهمة على الرنين صغيرة جدا كما يمكن أن نرى في الشكل 5C (في هذه الحالة المعلمات المجهزة هي كEX = 292 ± 40 هرتز و Δω = 112 ± 4 هرتز). إذا كنت في شك، يمكن تسجيل منحنى SL منخفضة خارج الرنين للتحقق. يمكن تحديد الذرة التي تظهر التبادل في المقياس الزمني المتوسط 1) من ملف تشتت الاسترخاء غير المسطح في تجربة RD على الرنين(الشكل 5B والشكل 5F)؛ 2) يمكن أن يكون خط أوسع في تجربة HSQC أو SELOPE أيضا مؤشرا للتبادل. قيم الطاقة SL مختارة بشكل جيد لمنحنيات خارج الرنين (الشكل 5E، F): 1) لها مساهمة كبيرة ك EX في منحنى على الرنين (يشار إلى قيم الطاقة SL مختارة في الشكل 5C والشكل 5G). 2) كما يتم قياس منحنيات خارج الرنين لقيم الطاقة لا يقل عن 3 SL، ينبغي توزيع قيم الطاقة SL مختارة على المنطقة من منحنى على الرنين مع مساهمة كEX. 3) يؤدي إلى غير شقة R2+REX المنحنيات بعد احتواء Laguerre (على سبيل المثال، الشكل 5D: SL نقاط القوة 25، 50، و 75 هرتز؛ الشكل 5E). قيم الطاقة SL مختارة بشكل سيئ لمنحنيات خارج الرنين (الشكل 5E، F) يؤدي إلى شقة R2+REX المنحنيات بعد تناسب Laguerre. يظهر مثال في الشكل 5E، حيث يكون منحنى 100 Hz خارج الرنين مسطحا جدا ، وبالتالي لا يوفر معلومات مهمة عن Δω. مؤشرات على الإطار الدوار تأثير Overhauser النووية (ROE) القطع الأثرية: 1) Δω التي تم الحصول عليها من منحنيات الرنين قبالة تطابق التحولات الكيميائية من البروتونات في المنطقة المجاورة المكانية / البروتونات، والتي تظهر ذروة الصليب مع ذروة الاهتمام في الطيف الطيفي تأثير Overhauser النووية (NOESY). (على سبيل المثال، يظهر الشكل 5I منحنيات واسعة خارج الرنين كما هو متوقع للتبادل السريع الوسيط ، ولكن المنحنيات لها أيضا ميزات أكثر وضوحا ، على سبيل المثال، عند -3000 هرتز و +1500 هرتز. هذه هي المرجح جدا بسبب قطعة أثرية ROE بدلا من التحول الكيميائي لهذا H8 في مطابق مختلف). 2) لا يصلح Laguerre لا يعمل، ولكن لا يعمل بشكل جيد (يعطي أخطاء عالية أو القيم المستحيلة جسديا) لرنين على الأقل و 3 منحنيات خارج الرنين، على الرغم من أن تم الحصول على الأسي من التجارب مع ارتفاع SINO (>20) (على سبيل المثال، كEX = 43502 ± 38478 هرتز). في كثير من الأحيان كل SL يناسب بشكل جيد بشكل فردي، ولكن تركيبها معا يعطي خطأ أعلى من ذلك بكثير؛ ومن المتوقع السلوك المعاكس لحالة متحمس الحقيقي. مؤشرات لتبادل “صحيح” Δω: 1) Δω التي تم الحصول عليها من منحنيات خارج الرنين لا تتطابق مع التحولات الكيميائية من البروتونات في المنطقة المجاورة المكانية / البروتونات، والتي تظهر ذروة الصليب مع ذروة الاهتمام في الطيف NOESY(على سبيل المثال، الشكل 5E). 2) Laguerre تناسب يعطي أخطاء منخفضة لرنين وعلى الأقل 3 منحنيات خارج الرنين (على سبيل المثال، الشكل 5E مقابل. الشكل 5I، انظر التسمية التوضيحية للحصول على نتائج تناسب). الشكل 3: إنتاج عينة من قبل T7 جنبا إلى جنب IVT وRNase H رد فعل الانقسام. (أ) إزالة التشنج الصفحة من النتائج الإيجابية والسلبية للترادف IVT وRNase H الانقسام. ارتفاع سلم يشير إلى مراجع الجيش الملكي النيبالي، 12 * يشير إلى دليل الانقسام chimeric. حارة 1: جيل ناجح من 20 NT الهدف الجيش الملكي النيبالي. عدد قليل من المنتجات أقصر وأطول موجودة. لين 2a: انشقاق غير مكتملة من النص جنبا إلى جنب. على الرغم من أن تنقية HPLC ممكنة ، إلا أن الكثير من المواد ستهدر. حارة 2b: استمرار RNase H انشقاق لين 2 تنتج عينة نظيفة جاهزة لحقن HPLC (مطابقة لين 1). حارة 4: كان RNase H الانقسام غير ناجحة إلى حد كبير، ولم يتم إنتاج الفرقة المستهدفة. النسخة جنبا إلى جنب كامل طول لا تزال مرئية في 600 NT. حارة 5: أنتجت نطاق هدف كان, غير أن قوية -1 فرقة حاضرة. على الرغم من أنه يمكن إجراء HPLC، إزالة دقيق للمنتج الجانبي ضروري. (ب)مثال على حقن HPLC ناجحة. الذروة في 38 دقيقة يحتوي على الحمض النووي الريبي النقي من طول الهدف، في حين يتم فصل المنتجات أطول وأقصر بشكل جيد من الجيش الملكي النيبالي الهدف. تم تعديل الفريق ب من 21. المختصرات: IVT = في النسخ المختبري؛ HPLC = الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء؛ NT = النيوكليوتيدات; الاتحاد الافريقي = وحدات التعسفي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4: مثال على دبوس الشعر RNA قبل (الأزرق) وبعد (أحمر) الخطوة القابلة للطي 2.4 (انظر البروتوكول) في NMR. (A) منطقة Imino من طيف 1H-1D من الحمض النووي الريبي 22 مير المسمى A. المناطق المتوقعة للهوية الثنائية الأساسية لإشارات imino مشار إليها باللون الرمادي أدناه. (ب) 1H،13C-HSQC الطيف من الرنين العطرية للجيش الملكي النيبالي من لوحة A. تظهر العينة بعد طيها (باللون الأحمر) 4 إشارات كما هو متوقع، بينما تظهر العينة قبل طيها (زرقاء) 3 إشارات فقط. (C) ماك أضعاف التنبؤ من RNA 22 مير كما دبوس الشعر. ومن المتوقع خمس إشارات imino من هذا الهيكل الثانوي، والتي يمكن العثور عليها في كلتا العينتين في لوحة A. (D) الهيكل المقترح من homodimer التي شكلتها RNA 22 مير، مما أدى إلى نفس أزواج قاعدة 5 كما هيكل دبوس الشعر. المختصرات: NMR = الرنين المغناطيسي النووي؛ 1D = أحادي البعد؛ HSQC = ارتباط الكم واحد غير نووي; جزء في المليون = أجزاء في المليون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل. 5: 1H R1ρ نتائج ممثل RD لاثنين من البنى المختلفة على أساس دبوس الشعر RNA. (أ)يظهر العمود الأيسر النتائج التي تم الحصول عليها على الحمض النووي الريبي مع زوج قاعدة C-G فوق U منتفخ، في حين يظهر العمود الأيمن النتائج التي تم الحصول عليها على عينة حيث تم تبديل الزوج الأساسي إلى G-C بدلا من ذلك. (B) و (F) إظهار ملامح التشتت المسطح كما تم الحصول عليها ل A4H8 للبناءين، مما يدل على عدم وجود تبادل تشكيلي. (C–E) إظهار على الرنين، خارج الرنين، والبيانات المجهزة التي تم الحصول عليها لG6 في (G-C) بناء. تناسب Laguerre يؤدي إلى النتيجة التالية: R1 = 2.87 ± 0.01 هرتز، R2 = 7.76 ± 0.03 هرتز، كEX = 292 ± 40 هرتز، pES = 0.31 ± 0.03 ٪، Δω = 112 ± 4 هرتز. (G-I) تظهر على الرنين، خارج الرنين، والبيانات المجهزة التي تم الحصول عليها لG6 في (G-C) بناء. لاغيري صالح يؤدي إلى النتيجة التالية: R1 = 1.93 ± 0.02 هرتز، R2 = 6.71 ± 0.86 هرتز، ك EX = 43502 ± 38478 هرتز، p ES = 27 ± 16٪، Δω = 203 ± 166 هرتز. تم تعديل هذا الرقم من 20. اختصار: SL = قفل الدوران. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

البروتوكول المعروض هنا هو توليفة من عدة بروتوكولات نشرت سابقا في شكل مقالات بحثية¹⁰^،²⁰^،²¹^،³¹. ومن ثم، يمكن تطبيق أجزاء من البروتوكول، في حين يمكن تبادل أجزاء أخرى لتفضيل القارئ. على سبيل المثال، يمكن إجراء قياسات R_1ρ على عينة الحمض النووي الريبي المنتجة بأي طريقة، بالنظر إلى أن للطي وتجانس الطول يفترضان. وعلاوة على ذلك، لا يحتوي البروتوكول على معلومات حول تعيين الرنين من تسلسل الجيش الملكي النيبالي-خطوة المطلوبة لتجارب RD- كما تم تغطية هذا على نطاق واسع في الأدب السابق¹⁹^،³⁷^،³⁸. تعد مخططات وضع العلامات الجزئية أو الجزئية أو الخاصة بالموقع³⁶^أو⁴¹أو⁴²أو⁴³^أو⁴⁴ نهجا لتسهيل تعيين الرنين أو تقليل تداخل الرنين الذي يهم تجارب RD وتم وصفه مطولا في الأدبيات. تسمح هذه الطريقة باستخدام وضع علامات موحدة على أي هوية نيوكليوتيد ، والتي يمكن أن تبسط بالفعل مهمة الرنين بشكل كبير.

الأسلوب IVT المعروضة هنا يتغلب على المشكلات المعروفة مع تسلسل ووضع العلامات، ويزيد العائد، ويقلل من التكلفة ووقت العمل مقارنة مع أساليب أخرى. استخدام تسلسل بدء الفيروسية يقلل من الحاجة إلى تحسين رد الفعل، وهي مشكلة معروفة في هذا المجال التي يمكن أن تستغرق وقتا طويلا لأداء وتسفر عن نسخ قليلة فقط من النص في حالة بدء غير G. يمكن إجراء T7 IVT وRNase H الانقسام من النص جنبا إلى جنب في وقت واحد في نفس السفينة. ويمكن رؤية نمط من تكرار الترادف متعددة الأرقام على هلام الصفحة الناح خلال رد الفعل، الذي يتجمع على نطاق واحد على الجيش الملكي النيبالي الهدف عند الانتهاء من رد فعل RNase H (الشكل 3A، الممرات 1 و 2b). الغلة النموذجية باستخدام هذه الطريقة تتراوح بين 30 و 70 RNA نانومول لكل 1 مل IVT. ومع ذلك ، فإن الطريقة القائمة على RNase H انشقاق يكرر جنبا إلى جنب لا يأتي من دون مشاكل معينة من تلقاء نفسها. رد فعل RNase H الانقسام في كثير من الأحيان لا يذهب إلى الانتهاء عند تشغيل في وقت واحد مع النسخ T7 (الشكل 3A، حارة 2a).

يمكن الانتهاء من فصل وحدات جنبا إلى جنب عن طريق تلي دليل الانقسام إلى النص وإضافة المزيد من RNase H (الشكل 3A، حارة 2b ، الخطوة 2.1.2). كما التدفئة من كميات كبيرة بطيئة ويؤدي إلى ملغ^{2 +}-تحلل مائي الحفاز من الحمض النووي الريبي، تم استخدام فرن الميكروويف التقليدية، الذي يسخن العينة إلى >95 درجة مئوية في 10-15 ق. ولم تلاحظ حتى الآن آثار ضارة على العينات المنتجة. تظهر بعض البنى شريطا ثانيا بسيطا لا يمكن القضاء عليه من خلال تحسين ظروف التفاعل(الشكل 3A، حارة 4). عادة ما تكون هذه مرئية بشكل واضح إلى حد ما ككتف في الرسم اللوني HPLC ، إذا تم استخدام تدرج elution محسن بشكل جيد ، ويمكن إزالته (الخطوة 2.2.5). وتهدف المناقشة التالية إلى تسليط الضوء على الخطوات الحاسمة في البروتوكول، وتحديدا فيما يتعلق بالحصول على بيانات عالية الجودة تسمح بتفسير الديناميات التوافقية.

تلوث RNase
RNases خارج الخلية هي في كل مكان، مستقرة للغاية، وتشكل أكبر تهديد للاستقرار على المدى الطويل من عينات NMR. لذلك ، من المهم العمل في بيئة خالية من RNase والحفاظ على جميع الكواشف والأدوات البلاستيكية خالية من RNase. ينصح باستخدام نصائح التصفية وربما حتى أقنعة الوجه. وهذا مهم على وجه التحديد بعد تنقية HPLC. وعادة ما تظهر عينات الرنين المغناطيسي الملوثة بالناس قمم ضيقة مرئية في ^أطيافH-1D بعد أيام أو أسابيع بسبب منتجات تدهور النيوكليوتيدات الأحادية. هذه العينة ليست مناسبة لقياسات R_1ρ.

عينة NMR
نظرا لطبيعته المشحونة للغاية ، يمكن استخدام الحمض النووي الريبي بتركيزات عالية دون هطول الأمطار بالمقارنة مع معظم البروتينات. استخدام أنابيب Shigemi NMR (انظر جدول المواد)مفيد لأنها تسمح بتوسيط العينة المركزة للغاية في وسط الملف مع الاستمرار في توفير ظروف الوميض والقفل المثالية بسبب القاع الزجاجي المطابق للحساسية والمغطاس. وبهذه الطريقة، يتم تقليل التجانس B1، مما يؤدي إلى خطوط أضيق. حجم العينة النموذجي في أنبوب NMR هو 250 ميكرولتر، والتركيز النموذجي هو 1-2 mM. لا ينصح العينات أقل من 500 ميكرومتر لتجارب RD كما التجربة سوف يستغرق وقتا طويلا وshim جيدة. وبالمثل، لا ينصح حجم العينة أقل من 200 ميكرولتر لأن هناك حاجة إلى شيم جيدة والاستقرار الميداني (قفل). عند إدخال المكبس ، من المهم تجنب تكوين فقاعات في العينة (الخطوة 2.4.5). إذا لم يتم إصلاحه بشكل صحيح، يمكن للمغطس الانزلاق لأسفل في العينة، مما يقلل من حجم الصوت القابل للكشف. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تؤدي التغيرات السريعة في درجة الحرارة إلى تكوين فقاعات جديدة في العينة. لذلك، ينبغي توخي الحذر عند نقل العينة وعند تغيير درجة حرارة المسبار في مطياف NMR. تحقق من العينة بحثا عن فقاعات عند القياس مرة أخرى بعد فترة أطول.

RNA للطي
يمكن أن توجد جزيئات الحمض النووي الريبي الديناميكي في تشكيلات متعددة عندما لا تكون مطوية بشكل صحيح. على الرغم من أن ذوبان درجات الحرارة في الهياكل الثانوية يمكن أن يكون فقط أعلى قليلا من درجة حرارة الغرفة، ينصح بإجراء التدفئة والتبريد الشامل قبل القياس. يمكن لعينات دبوس الشعر المركزة للغاية القابلة للطي تحت التحكم الحركي (التدفئة والتبريد المفاجئ) أن تشكل تجانسات بمرور الوقت ، مما يتطلب رقابة صارمة على طي الحمض النووي الريبي قبل كل قياس NMR. إذا كان الحمض النووي الريبي المقاس ليس بنية دبوس الشعر ولكن يجب تطبيق دوبلس الحمض النووي الريبي ، للطي البطيء تحت التحكم الديناميكي الحراري.

في هذه الحالة، يجب أن تكون عملية التبريد بعد التدفئة في نطاق ساعات، في حين يتم استخدام الحمض النووي الريبي في حجمه النهائي والتركيز في عينة NMR. يمكن أن يوفر العد الأولي للصدى المتوقع والإيمينو العطري نظرة ثاقبة حول تجانس العينة. إذا كانت العينة لا تبدو كما هو متوقع، يجب إعادة طيها. Mg²⁺ (يضاف ملح كلوريد) يمكن أن تساعد مع هياكل الحمض النووي الريبي للطي⁴⁵. في الممارسة العملية، عنصر التحكم للطي بمثابة مقارنة لعينة التي تم استخدامها لتعيين على الأقل جزئيا الرنين NMR وحل الهيكل الثانوي تجريبيا.

تدور قفل السلطة واعتبارات التدفئة
في حالة تشغيل تجارب ^{RD 1}H R_1ρ كمجريات نظرة عامة على 2D ، يجب ألا تقل طاقة SL عن 1.2 كيلوهرتز. يجب وضع تردد مرسل الترددات الراديوية في منتصف منطقة جزء في المليون من قمم الاهتمام(على سبيل المثال،7.5 جزء في المليون للبروتونات العطرية). وعندئذ سيكون عرض النطاق الترددي البالغ 1.2 كيلوهرتز كبيرا بما يكفي لتدفير هذه البروتونات دون أي آثار رئيسية خارج الرنين. ويمكن تحديد هذه الآثار في ملف RD. إذا حدثت،R₂+R_EX القيم زيادة بدلا من إنقاص مع زيادة قيم الطاقة SL، وخاصة بالنسبة للطاقة SL منخفضة. تحقق مما إذا كانت قيم الطاقة المحسوبة SL تتوافق مع الطاقة التي تم تسليمها إلى العينة. في الممارسة العملية، يمكن استخدام قوة SL المحسوبة إذا تم معايرة النبض الصلب ¹H 90 درجة بعناية على مطيافات أحدث؛ ومع ذلك، يمكن التحقق من ذلك عن طريق معايرة طاقة SL لكل عرض النطاق الترددي المطلوب.

نطاق قوة SL، والتي يمكن استخدامها في ¹H R_1ρ RD التجارب واسعة جدا، مما يؤدي إلى تدفئة عينة متفاوتة (1.2 كيلوهرتز إلى 15 كيلوهرتز لHSQC لتسلسلات المستندة إلى HCP و 50 هرتز إلى 15 كيلوهرتز لتجارب SELOPE). يمكن الكشف عن عدم المساواة في تسخين العينة كتغير طفيف في التحول الكيميائي عند مقارنة 1Ds التي تم الحصول عليها لSLs الطاقة المنخفضة مقابل. SLs عالية الطاقة. عادة لا يتم النظر في هذا التأثير في التعويضات الحرارية في التجارب R_1ρ على heteronuclei. عادة ما يتم إعداد تعويض الحرارة في تلك التجارب لتصحيح التدفئة المختلفة بسبب فترات قفل الدوران المختلفة المحددة في قائمة VD لكل سلسلة طاقة قفل الدوران. خاصة بالنسبة لتجربة SELOPE ، يجب استخدام تعويض حراري ثان عبر جميع نقاط القوة المطبقة في SL كما هو موضح في^20.

اعتبارات قائمة vd
كما ذكر سابقا، يجب أن تحتوي قائمة VD على نقطة زمنية طويلة بما يكفي للحصول على تسوس كبير للكثافة (من الناحية المثالية إلى 30٪ من الإشارة الأولية، أو أقل قدر ممكن إذا لم يكن من الممكن الوصول إلى اضمحلال بنسبة 70٪ ضمن مواصفات المسبار). على الرغم من أن قائمة VD تم تحسينها لطاقة SL منخفضة (1.2 كيلوهرتز)، إلا أنه يجب أيضا اختبار قائمة vd هذه بأعلى طاقة SL لاستخدامها(على سبيل المثال،15 كيلوهرتز). ويرجع ذلك إلى حقيقة, أن لقمة مع مساهمة كبيرة R_EX, وسوف يكون الاضمحلال أبطأ بكثير في قوة SL عالية. لذلك ينبغي أيضا التحقق من اضمحلال كافية في قوة SL عالية. وينبغي النظر في الشيء نفسه بالنسبة للاضمحلالات في الإزاحات العالية في التجارب خارج الرنين. يمكن أن تكون النقطة الزمنية القصوى المثالية لقائمة vd مختلفة بشكل كبير بالنسبة لمختلف مناطق تجربة التشتت. في هذه الحالة، يمكن إدراج المزيد من النقاط في قائمة vd، ويمكن التخلص من نقاط قائمة vd الأطول لقوة SL أعلى أو إزاحات أعلى أثناء التحليل، استنادا إلى انخفاض SINO الذي ستؤدي إليه. بشكل عام، ينبغي اعتبار نقاط قائمة VD 5-8 لتكون قادرة على اكتشاف القطع الأثرية المحتملة التي تؤدي إلى تسوس غير أسي مثل اقتران J (انظر أدناه).

1D–اعتبارات انتقائية HCP
يجب توخي الحذر الخاص عند تشغيل الإصدار 1D القائم على HCP إذا كان هناك ذروة أخرى متداخلة مع ذروة الاهتمام بالبعد ^{H 1}من التجربة المستندة إلى HSQC 2D. التحويلات القائمة على HCP انتقائية للغاية ، ولكنها لا تكون انتقائية بنسبة 100٪ ، وبالتالي يمكن أن يحدث أن ذروة أخرى تساهم في كثافة وسلوك الاضمحلال في ذروة الاهتمام في 1D. ومن المؤشرات على ذلك الفرق في قيم R_1ρ الرنين التي تم الحصول عليها باستخدام الإصدارات 1D و 2D من التجربة المسماة.

اعتبارات العائد على حقوق المساهمين:
بالنسبة للمنحنيات خارج الرنين للذرات ذات التبادل البطيء الوسيط ، يمكن تحديد القطع الأثرية ROE استنادا إلى مقارنة Δω التي تم الحصول عليها مع طيف NOESY أو ROESY. إذا كان يمكن تحديد ذروة الصليب في الفرق التحول الكيميائي المقابلة لΔω، ثم حالة متحمس لوحظ قد يكون في الواقع قطعة أثرية ROE(على سبيل المثال، تم العثور على ROEs بين البروتونات العطرية ، والتي هي كلها في نفس نطاق التحول الكيميائي ، وبالتالي تغطيها تلك منحنيات خارج الرنين^20). من التجربة ، وهذا يؤدي دائما أيضا إلى سوء يناسب أخطاء كبيرة ، وربما يرجع ذلك إلى العائد على حقوق المساهمين لا تتبع نفس النمط كما R_EX مع زيادة قوة SL. ويصبح الوضع أكثر صعوبة بالنسبة للتبادل المتوسط والسريع. في حين أن منحنى الرنين (من المقارنة مع ¹³بيانات C التي تم الحصول عليها على النواة المجاورة) لا يزال يمثل عملية التبادل بين GS و ES ، يتأثر منحنى الرنين من قبل العديد من القطع الأثرية العائد على الاستثمار.

في هذه الحالة، تكون قدرة SL على اكتشاف عملية التبادل أكبر (>1.5 كيلوهرتز) وبالتالي تمتد على عدد أكبر من البروتونات حيث تمتد المنحنيات خارج الرنين على الاختلافات في التحول الكيميائي لمختلف المرشحين ل ROE (بالنسبة ل H8 ستكون هذه: البروتونات الأمينية في كاليفورنيا. ±1000 هرتز، H5/H1 في ca. -1200 هرتز، البروتونات إيمينو في كاليفورنيا 3500 هرتز). وحتى الآن، لم يتم العثور على أي طريقة لقمع هذه القطع الأثرية العائد على الاستثمار (بخلاف استخدام النيوكليوتيدات⁴⁶deuteed جزئيا)، وينبغي عدم تسجيل البيانات خارج الرنين لتبادل سريع الوسيطة، كما لا يمكن استخراج أي معلومات موثوقة عن Δω الفعلية مع هذه الطريقة، إذا NOE / العائد على حقوق المساهمة لا يمكن استبعادها عن طريق أطياف NOESY.

اعتبارات J-اقتران (هارتمان هان)
على الرغم من أن المنحنيات على الرنين للبروتونات J-coupled النووية، مثل H6، تم تسجيلها بنجاح¹⁰^،²⁰، يجب توخي الحذر الخاص للقياسات خارج الرنين ، خاصة بالنسبة لقوة SL المنخفضة حيث يمكن أن تمتد ظروف مطابقة هارتمان هان على نطاق واسع من التعويضات التي تم التحقيق فيها. ويمكن تحديد القطع الأثرية هارتمان هان كما التذبذبات على الاضمحلال الأسي أو_زيادة R2 +R_EX القيم مع زيادة نقاط القوة SL في المؤامرات RD على الرنين²⁰.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر مرفق علوم البروتين (PSF) في معهد كارولينسكا للتعبير وتنقية T7 RNA polymerase و E. coli RNase H ، مارتن هالبرغ على الهدية السخية للفوسفاتاز غير العضوي ، وبيتزولدلاب بأكمله للمناقشات القيمة. نشكر لوكا ريتاتينو على إعداد البنى U-bulge وإميلي شتاينر وكارولينا فونتانا لمساهمتهما في وحدات الماكرو والنصوص المناسبة. نعترف معهد كارولينسكا وقسم الكيمياء الحيوية الطبية والفيزياء الحيوية لدعم شراء 600 ميغاهرتز مطياف وتمويل الموقف (KI FoAss وKI 2-3707/2013). نحن ممتنون للمساهمة المالية من Vetenskapsrådet (#2014-4303) ، ستيفتلسن för استراتيجية فورسكنغ (ICA14-0023 و FFL15-0178) وراجنر سودربرغ ستيفتلسي (M91-14) ، هارالد أوش غريتا جانسون ستيفتليسي (JS 20140009)، كارل تريغرز ستيفتيلسي (CTS14-383 و 15-383)، إيفا أوش أوسكار أهرينس ستيفتيلسي، آكي ويبرغ ستيفتيلسي (467080968 وM14-0109)، سرطان فوندن (CAN 2015/388)، J.S. يعترف التمويل من خلال ماري Skłodowska – كوري IF (الاتحاد الأوروبي H2020 ، MSCA-IF المشروع رقم 747446).

Materials

40% Acrylamide/Bis Solution	Bio-Rad	161-0144
5-alpha Competent E. coli	NEB	C2987I
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	49199
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	34851
AFC-3000, HPLC Fraction collector	Thermo Scientific	5702.1
Agarose	Sigma-Aldrich	A9414
Amersham ImageQuant 800 UV	GE Healthcare	29399482	Replacing LAS-4000 or equivalent
Amicon ultra centrifugal filter unit	Sigma-Aldrich	UFC900324
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9518
ATP	Sigma-Aldrich	A2383
ATP-13C10/15N5	Sigma-Aldrich	645702
BamHI restriction enzyme	NEB	R0136L
Bottle top filter	VWR	514-1019
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	1081220005
Cleavage guide	IDT	N/A	or equivalent
CTP	Sigma-Aldrich	C1506
CTP-13C10/15N5	Sigma-Aldrich	645699
D2O	Sigma-Aldrich	151882
Dionex Ultimate 3000 UHPLC system	Thermo Scientific	N/A
DL-Dithiotreitol	Sigma-Aldrich	43815
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
DNAPac PA200 22×250 Semi-Prep column	Thermo Scientific	SP6734
DNAPac PA200 22×50 guard column	Thermo Scientific	SP6731
E.coli RNase H	NEB	M0297L	or made in-house uniprot ref. P0A7Y4
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758
Eppendorf centrifuge, rotor: A-4-44	Eppendorf	5804R
Ethanol 95%	Fisher scientific	11574139
Ethanol 95% denatured	VWR	85829.29
Formamide	Sigma-Aldrich	47671
GelRed	VWR	41003
GeneRuler 1kbp Plus	Fisher Scientific	SM1333	Optional
GMP	Sigma-Aldrich	G8377
GMP-13C10/15N5	Sigma-Aldrich	650684
GTP	Sigma-Aldrich	G8877
GTP-13C10/15N5	Sigma-Aldrich	645680
Hydrochloric Acid	Sigma-Aldrich	H1758
Inorganic pyrophosphatase	Sigma-Aldrich	I1643-100UN	or made in-house uniprot ref. P0A7A9
Invitrogen UltraPure 10X TBE-buffer	Sigma-Aldrich	T4415
Julabo TW8 Water bath	VWR	461-3117
kuroGEL Midi 13 Horizontal gel electrophoresis	VWR	700-0056	or comparable
LB broth (Lennox)	Sigma-Aldrich	L3022
LB broth with agar (Lennox)	Sigma-Aldrich	L2897
Low Range ssRNA Ladder	NEB	N0364S	Optional
LPG-3400RS Pump	Thermo Scientific	5040.0036
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	63068
microRNA Marker	NEB	N2102S
Microwave oven	Samsung	MS23F301EAW
Mini-PROTEAN electrophoresis equipment	Bio-Rad	1658004
NucleoBond Xtra Maxi	Machinery-Nagel	740414.10M
pUC19 plasmid containing tandem insert	Genscript	N/A	or equivalent
RNaseZAP	Sigma-Aldrich	R2020
Shigemi tube 5mm	Sigma-Aldrich	Z529427
Single-use syringe, Luer lock tip	VWR	613-2008
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	730-1470
Sodium perchlorate	Sigma-Aldrich	71853
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S3264
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S3139
Spermidine trihydrochloride	Sigma-Aldrich	85578
SYBR Gold	ThermoFisher	S11494
Syringe filters	VWR	514-0061
T7 RNA polymerase	Sigma-Aldrich	10881767001	or made in-house uniprot ref. P00573
TCC-3000RS Column thermostat	Thermo Scientific	5730
Tetramethylethylenediamine	Sigma-Aldrich	T9281
Tris Base	Fisher Scientific	10103203
UMP	Sigma-Aldrich	U6375
UMP-13C9/15N2	Sigma-Aldrich	651370
Urea	Sigma-Aldrich	U5378
UTP	Sigma-Aldrich	U6625
UTP-13C10/15N5	Sigma-Aldrich	645672
VWD-3100 Detector	Thermo Scientific	5074.0005

References

Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
Doudna, J. A., Cech, T. R. The chemical repertoire of natural ribozymes. Nature. 418 (6894), 222-228 (2002).
Sehgal, P. B., Westley, J., Lerea, K. M., DiSenso-Browne, S., Etlinger, J. D. Biomolecular condensates in cell biology and virology: phase-separated membraneless organelles (MLOs). Analytical Biochemistry. , 597 (2020).
Herschlag, D., Allred, B. E., Gowrishankar, S. From static to dynamic: the need for structural ensembles and a predictive model of RNA folding and function. Current Opinion Structural Biology. 30, 125-133 (2015).
Kimsey, I. J., Petzold, K., Sathyamoorthy, B., Stein, Z. W., Al-Hashimi, H. M. Visualizing transient Watson-Crick-like mispairs in DNA and RNA duplexes. Nature. 519 (7543), 315-320 (2015).
Dethoff, E. A., Petzold, K., Chugh, J., Casiano-Negroni, A., Al-Hashimi, H. M. Visualizing transient low-populated structures of RNA. Nature. 491 (7426), 724-728 (2012).
Baisden, J. T., Boyer, J. A., Zhao, B., Hammond, S. M., Zhang, Q. Visualizing a protonated RNA state that modulates microRNA-21 maturation. Nature Chemical Biology. 17 (1), 80-88 (2021).
Marušič, M., Schlagnitweit, J., Petzold, K. RNA dynamics by NMR spectroscopy. Chembiochem. 20 (21), 2685-2710 (2019).
Baronti, L., et al. Base-pair conformational switch modulates miR-34a targeting of Sirt1 mRNA. Nature. 583 (7814), 139-144 (2020).
Steiner, E., Schlagnitweit, J., Lundström, P., Petzold, K. Capturing excited states in the fast-intermediate exchange limit in biological systems using 1H spectroscopy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (51), 15869-15872 (2016).
Moschen, T., et al. Ligand-detected relaxation dispersion NMR spectroscopy: dynamics of preQ1-RNA binding. Angewandte Chemie International Edition. 54 (2), 560-563 (2015).
LeBlanc, R. M., Longhini, A. P., Tugarinov, V., Dayie, T. K. NMR probing of invisible excited states using selectively labeled RNAs. Journal of Biomolecular NMR. 71 (3), 165-172 (2018).
Strebitzer, E., Nußbaumer, F., Kremser, J., Tollinger, M., Kreutz, C. Studying sparsely populated conformational states in RNA combining chemical synthesis and solution NMR spectroscopy. Methods. 1148, 39-47 (2018).
Rangadurai, A., Shi, H., Al-Hashimi, H. M. Extending the sensitivity of CEST NMR spectroscopy to micro-to-millisecond dynamics in nucleic acids using high-power radio-frequency fields. Angewandte Chemie International Edition. 59 (28), 11262-11266 (2020).
Hansen, D. F., Vallurupalli, P., Kay, L. E. Using relaxation dispersion NMR spectroscopy to determine structures of excited, invisible protein states. Journal of Biomolecular NMR. 41 (3), 113-120 (2008).
Lundström, P., Akke, M. Off-resonance rotating-frame amide proton spin relaxation experiments measuring microsecond chemical exchange in proteins. Journal of Biomolecular NMR. 32 (2), 163-173 (2005).
Lee, J., Dethoff, E. A., Al-Hashimi, H. M. Invisible RNA state dynamically couples distant motifs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), 9485-9490 (2014).
Schnieders, R., Keyhani, S., Schwalbe, H., Fürtig, B. More than proton detection- new avenues for NMR spectroscopy of RNA. 化学. 26 (1), 102-113 (2020).
Fürtig, B., Richter, C., Wöhnert, J., Schwalbe, H. NMR spectroscopy of RNA. Chembiochem. 4 (10), 936-962 (2003).
Schlagnitweit, J., Steiner, E., Karlsson, H., Petzold, K. Efficient detection of structure and dynamics in unlabeled RNAs: The SELOPE approach. 化学. 24 (23), 6067-6070 (2018).
Feyrer, H., Munteanu, R., Baronti, L., Petzold, K. One-pot production of RNA in high yield and purity through cleaving tandem transcripts. Molecules. 25 (5), 1142 (2020).
Baronti, L., Karlsson, H., Marušič, M., Petzold, K. A guide to large-scale RNA sample preparation. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (14), 3239-3252 (2018).
Brunelle, J. L., Green, R. In vitro transcription from plasmid or PCR-amplified DNA. Methods in Enzymology. 530, 101-114 (2013).
Borkotoky, S., Murali, A. The highly efficient T7 RNA polymerase: A wonder macromolecule in biological realm. International Journal of Biological Macromolecules. 118, 49-56 (2018).
Arnaud-Barbe, N., Cheynet-Sauvion, V., Oriol, G., Mandrand, B., Mallet, F. Transcription of RNA templates by T7 RNA polymerase. Nucleic Acids Research. 26 (15), 3550-3554 (1998).
Guillerez, J., Lopez, P. J., Proux, F., Launay, H., Dreyfus, M. A mutation in T7 RNA polymerase that facilitates promoter clearance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (17), 5958-5963 (2005).
Kuzmine, I., Gottlieb, P. A., Martin, C. T. Binding of the priming nucleotide in the initiation of transcription by T7 RNA polymerase. Journal of Biological Chemistry. 278 (5), 2819-2823 (2003).
Gholamalipour, Y., Karunanayake Mudiyanselage, A., Martin, C. T. 3′ end additions by T7 RNA polymerase are RNA self-templated, distributive and diverse in character – RNA-Seq analyses. Nucleic Acids Research. 46 (18), 9253-9263 (2018).
Inoue, H., Hayase, Y., Iwai, S., Ohtsuka, E. Sequence-dependent hydrolysis of RNA using modified oligonucleotide splints and RNase H. FEBS Letters. 215 (2), 327-330 (1987).
Wang, X., Li, C., Gao, X., Wang, J., Liang, X. Preparation of small RNAs using rolling circle transcription and site-specific RNA disconnection. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 4, 215 (2015).
Karlsson, H., Baronti, L., Petzold, K. A robust and versatile method for production and purification of large-scale RNA samples for structural biology. RNA. 26 (8), 1023-1037 (2020).
Hartmann, S. R., Hahn, E. L. Nuclear double resonance in the rotating frame. Physical Review. 128 (5), 2042-2053 (1962).
Chiarparin, E., Pelupessy, I., Bodenhausen, G. Selective cross-polarization in solution state NMR. Molecular Physics. 95 (5), 759-767 (1998).
Korzhnev, D. M., Orekhov, V. Y., Kay, L. E. Off-resonance R 1ρ NMR studies of exchange dynamics in proteins with low spin-lock fields: an application to a Fyn SH3 domain. Journal of the American Chemical Society. 127 (2), 713-721 (2005).
Hansen, A. L., Nikolova, E. N., Casiano-Negroni, A., Al-Hashimi, H. M. Extending the range of microsecond-to-millisecond chemical exchange detected in labeled and unlabeled nucleic acids by selective carbon R 1ρ NMR spectroscopy. Journal of the American Chemical Society. 131 (11), 3818-3819 (2009).
Duss, O., Maris, C., von Schroetter, C., Allain, F. H. -. T. A fast, efficient and sequence-independent method for flexible multiple segmental isotope labeling of RNA using ribozyme and RNase H cleavage. Nucleic Acids Research. 38 (20), 188 (2010).
Krähenbühl, B., Lukavsky, P., Wider, G. Strategy for automated NMR resonance assignment of RNA: application to 48-nucleotide K10. Journal of Biomolecular NMR. 59 (4), 231-240 (2014).
LeBlanc, R. M., Longhini, A. P., Le Grice, S. F. J., Johnson, B. A., Dayie, T. K. Combining asymmetric 13C-labeling and isotopic filter/edit NOESY: a novel strategy for rapid and logical RNA resonance assignment. Nucleic Acids Research. 45 (16), 146 (2017).
Parisien, M., Major, F. The MC-Fold and MC-Sym pipeline infers RNA structure from sequence data. Nature. 452 (7183), 51-55 (2008).
Fürtig, B., Richter, C., Bermel, W., Schwalbe, H. New NMR experiments for RNA nucleobase resonance assignment and chemical shift analysis of an RNA UUCG tetraloop. Journal of Biomolecular NMR. 28 (1), 69-79 (2004).
Keyhani, S., Goldau, T., Blümler, A., Heckel, A., Schwalbe, H. Chemo-enzymatic synthesis of position-specifically modified RNA for biophysical studies including light control and NMR spectroscopy. Angewandte Chemie International Edition. 57 (37), 12017-12021 (2018).
Marchanka, A., Kreutz, C., Carlomagno, T. Isotope labeling for studying RNA by solid-state NMR spectroscopy. Journal of Biomolecular NMR. 71, 151-164 (2018).
Becette, O., Olenginski, L. T., Dayie, T. K. Solid-phase chemical synthesis of stable isotope-labeled RNA to aid structure and dynamics studies by NMR spectroscopy. Molecules. 24 (19), 3476 (2019).
Zhang, X., Li, M., Liu, Y. Optimization and characterization of position-selective labelling of RNA (PLOR) for diverse RNA and DNA sequences. RNA Biology. 17 (7), 1009-1017 (2020).
Roh, J. H., et al. Effects of preferential counterion interactions on the specificity of RNA folding. The Journal of Physical Chemistry Letters. 9 (19), 5726-5732 (2018).
Juen, M. A., et al. Excited states of nucleic acids probed by proton relaxation dispersion NMR spectroscopy. Angewandte Chemie German Edition. 55 (39), 12008-12012 (2016).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Feyrer, H., Schlagnitweit, J., Petzold, K. Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of ¹H R_1ρ Relaxation Dispersion Experiments of RNA. J. Vis. Exp. (173), e62470, doi:10.3791/62470 (2021).