S 단계 동안 DNA 모집을 연구하는 레이저 미세 조사

1. 인간 골육종 유래 세포의 재배 (U-2 OS) 참고: U-2 OS 세포는 평평한 형태, 큰 핵을 가지고 있으며 유리를 포함한 여러 표면에 강하게 부착되기 때문에 이러한 연구에 이상적입니다. 유사한 특성을 가진 그밖 세포주도 이용될 수 있었습니다. U-2 OS 세포주를 재배하려면 10% 태아 소 혈청(FBS) 및 항생제(100 U/mL 페니실린 및 100μg/mL 연쇄절제술)로 보충된 McCoy의 5A 배지를 사용하십시오. 5%CO2를함유하는 가습된 대기에서 37°C에서 세포를 배양한다. 현미경 검사법의 경우, 충분한 세포 수를 제공하기 위해 10cm 접시에 세포 배양을 유지합니다. 세포가 90%의 합류(~7 x 106 세포/10cm 접시)에 접근할 때, 세포를 분할합니다. PBS로 세포를 헹구고 혈청 내에 함유 된 트립신 억제제를 씻어 낸다. 트립신-EDTA의 1mL을 추가하고 세포 층이 동일하게 덮여 있는지 확인합니다. 세포 층이 플레이트에서 들어올릴 때까지 37°C에서 배양(약 6분). 트립신을 비활성화하는 매체를 포함하는 혈청에서 트립시네이징 된 세포를 다시 중단하고 부피의 1/10th (~0.7 x 106 셀)를 보충 된 성장 배지 10 mL을 포함하는 새로운 10cm 플레이트에 추가합니다. 실험 전에 제조업체의 권고에 따라 범용 마이코플라즈마 검출 키트를 사용하여 마이코플라즈마 오염에 대한 세포를 일상적으로 테스트합니다. 2. 레트로바이러스 감염 참고: BSL-2 안전 대책의 경우 재조합 바이러스와 함께 작업하는 동안 NIH 지침, 섹션 III-D-3: 조직 배양에 있는 재조합 바이러스를 참조하십시오. 종자 4 x 106 HEK293T 셀은 10cm 배양 접시로 도금 한 후 24 시간 이내에 ~60 % 인플루엔성을 달성한다. HEK293T 재배를 위해 이 프로토콜의 1.1-1.3에 설명된 U-2 OS의 재배 단계를 따르십시오. HEK293T의 경우 McCoy의 5A 매체를 DMEM용으로 대체합니다. HEK293T 세포를 조직 배양 판에 약하게 부착할 때 항상 부드럽게 씻어야 합니다. 플라스미드의 바이러스 성 포장을 위한 지질 계 형 형질 전환 시약을 사용하는 Transfect HEK293T 세포. 레트로바이러스 벡터의 경우, VSV-G(Addgene #8454)의 1.5 μg와 pUMVC(Addgene #8449) 패키징 벡터의 1.5 μg와 관심 유전자를 포함하는 벡터의 3 μg(백본에서 푸르오마이신 저항성)을 옵티 메미센트 마이크로리의 250L에 결합한다. Opti-MEM/DNA 혼합물(이 경우 6 μL)에 추가된 각 DNA μg에 대해 P3000 시약 1μL을 추가하고 탭하여 부드럽게 섞습니다. 소용돌이 나 파이펫을 위아래로하지 마십시오. 또 다른 미세센심분리기 튜브에서는 옵티-MEM 감소혈청 의 250 μL과 형질 검사 시약의 μg DNA 당 2 μL(이 경우 12 μL)을 결합합니다. 두 혼합물 (500 μL 결합, 소용돌이하지 말고 부드러운 도청으로만 섞음)을 결합하고 실온에서 15 분 동안 배양하십시오. 조심스럽게, 세포를 분리하지 않고 시드 HEK293T 세포에 혼합물을 드롭 와이즈로 추가합니다. 접시를 부드럽게 소용돌이시다. 안정적인 세포주를 생성하는 바이러스 감염. FEFe후 72h의 HEK293T 세포로부터 상류체를 함유하는 바이러스를 제거한다. 0.45 μm 필터로 용액을 조심스럽게 필터링하여 세포 이물질과 분리된 세포를 제거합니다. 선택적으로, 바이러스 성 감염을 용이하게하기 위해 바이러스 성 상수에 8 μg / mL 폴리브레인을 추가합니다. 10cm 접시 (~3 x 106 셀)에서 ~50 % 합류에서 U-2 OS 세포에 수퍼를 포함하는 바이러스를 추가합니다. 전날 U-2 OS 셀을 시드합니다. 바이러스 함유 상체를 제거하고 폐기하기 전에 6-16h에 감염하십시오.참고: 관심 있는 유전자에 대해 원하는 양의 과발현을 달성하기 위해 고정된 시간 동안 일련의 바이러스 희석을 배양합니다. 내인 성 수준과 비교하는 서양 얼룩을 가진 각각새로 확립된 세포주에서 전환유전자의 발현 수준을 확인하십시오. 세포가 적절한 항생제의 존재하에서 선택할 수 있도록 (2 μg /mL 최종 농도에서 푸오마이신의 경우 3-4 일 동안) 현미경하에서 관심있는 형광 단백질 태그 유전자의 발현을 확인하십시오. 이중 표지된 셀주를 생성하려면 이러한 단계를 반복합니다. 여기에 제시된 실험에서 mPlum-PCNA는 EXO1B-AcGFP와 결합된 레트로바이러스 벡터(pBABE)로부터 발현되었으며, 또한 레트로바이러스 벡터로부터 발현되었다(pRetroQ-AcGFP1-N1). 3. 미세 조사를 위한 세포 준비 도금 세포: 실험 전 24시간, 총 8.0 x 104 세포를 500 μL-1 mL 사이의 부피로 플레이트하여 4번의 잘 챔버커버글래스에 1.5호 보로실리케이트 유리 바닥에 미세한 미생물및 미세레이저 에 대한 이상적인 결과를 제공한다. 세포 결도가 높을수록 단일 시야(FOV)에서 측정되는 더 많은 세포가 허용됩니다. 그러나 완전히 컨할 수 있는 슬라이드는 세포 주기 요철을 소개합니다. 이미징 미디어: 마이크로 조사 한 시간 전에, 플루오로브리테 DMEM에 대한 정기적 인 성장 매체를 교환 10% FBS, 100 U / mL 페니실린과 100 μg / mL 연쇄 절제술, 15 mM HEPES (pH = 7.4) 및 1mM 나트륨 피바테. 이 이미징 미디어는 신호 대 잡음 비율을 최대화하여 매우 희미한 형광을 감지할 수 있도록 도와줍니다. HEPES를 함유하고 있기 때문에 5% CO2 대기가 없는 경우 pH도 안정화됩니다. 이 단계에서 이미징 전에 추가 치료를 적용하십시오. 여기에 제시된 실험에서, 세포는 olaparib (PARP 억제제, 1 μM 최종 농도에서) 또는 차량 제어 (DMSO)1,8,9로이미징하기 전에 1 시간 전에 미리 처리되었다. 4. 현미경을 준비하고 이미징을 위한 S 상 세포를 선택합니다. 최상의 결과를 위해 여기에 설명된 시스템과 유사한 특성을 가지고 있는 공초점 시스템을 사용합니다. 여기에 제시된 실험은 반전된 현미경 스탠드에 장착된 공초점 현미경을 사용하여 수행되었습니다(재료표참조).참고 : 여기에 사용되는 현미경은 50mW 405 nm FRAP 레이저 모듈과 60x 1.4 NA 오일 계획 – 아포크로마트 목표를 장착했다. 공초점 스캔헤드에는 갈바노 스캐너(고해상도용) 및 공진 스캐너(고속 이미징용)의 두 가지 스캐너 옵션이 있습니다. 소프트웨어 제어 XY 갈바노 장치를 통해 샘플에 광표백(FRAP) 레이저(FRAP) 레이저후 형광 복구를 소개합니다. 488 nm 레이저 라인을 사용하여 AcGFP와 561 nm 또는 594 nm 레이저 라인을 자극하여 mPlum을 흥분시킵니다.참고: 다음 필터 조합은 최적의 결과를 제공합니다: 560 nm 길이의 패스 필터를 사용하여, 560 nm보다 낮은 파장을 가진 방출 광은 AcGFP를 위한 525/50 nm 방출 필터를 통과하고, 560nm 이상의 파장을 가진 방출 광은 595/50 nm 방출 필터를 통과시켰다. 최소한의 형광 출혈을 보장하는 모든 적절한 필터 세트(예: FITC/TRITC, GFP/mCherry, FITC/TxRed)를 사용할 수 있습니다. 환경 챔버와 현미경 구성 요소를 켭니다. 가열(스테이지, 목표 및 환경 챔버 가능시),CO2 공급 및 습도 조절기를 실험 시작 4시간 이상 켜면 안정적인 이미지 수집을 위한 열 평형을 보장한다. 현미경으로 세포의 전송 하기 전에 적어도 1 h 레이저 라인과 함께 광 원을 초기화. 형광 태그PCNA를 마커로 사용하여 비동기 집단에서 S-phase 세포를 선택합니다. 아래 단계에 따라 이 작업을 수행합니다. S 상에서 mPlum 태그PCNA의 고유한 국소화 패턴을 찾아이 세포 주기 단계를 식별할 수 있습니다. PCNA는 세포 주기의 G1 및 G2 상에서 핵에 완전히 균일한 분포를 가지며, 핵에서 제외된다. S-phase에서 PCNA는 핵에서 replisomes의 위치에 foci를 형성한다. 도 1은 S-phase 전반에 걸쳐 PCNA 포시의 다양한 패턴을 나타내며, 이를 통해 초기, 중, 후반 S-phase를 구별할 수 있습니다. 현미경을 통해 현미경 조사를 위한 충분한 S-위상 세포가 있는 FOV를 선택하십시오. 비동기 U-2 OS 세포는 일반적으로 S 단계에서 그들의 인구의 30-40%를 가지고 있습니다. PCNA와 관심 있는 단백질(POI)에 대한 발현 수준(밝고 희미한 세포)에서 극한을 피하십시오.이 경우 EXO1b-AcGFP는 실험적인 유물로 이어질 수 있습니다. 적합한 FOV를 찾을 때 광표백 및 원치 않는 DNA 손상을 최소화하기 위해 장시간 필드를 스캔하지 마십시오. 마이크로 조사를 위해 원하는 관심 영역(ROI)을 설정합니다. 관련 소프트웨어(재료 표 참조)를사용하여 먼저 바이너리 라인을 삽입하여 원하는 ROI를 설정합니다(원하는 라인 수 및 간격 설정). 바이너리를클릭한 다음 삽입 선을 클릭| 원 | 타원은 원하는 줄 수를 그립니다. 이러한 이진 선을 ROI로 변환하고 마지막으로 이러한 ROI를 자극 ROI로 변환합니다. 이렇게 하려면 먼저 ROI를클릭한 다음 이진 이동을 ROI로클릭한 다음 ROI를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 자극 ROI: S1로 사용을선택합니다. 이러한 선을 FOV에 배치하여 세포의 핵을 통과한다. 전체 FOV에 걸쳐 1024 픽셀의 길이를 가진 ROI는 프로토콜 전반에 걸쳐 사용되었습니다. 5. 면역 형광 염색 또는 시간 경과 이미징에 대한 미세 조사. 최적의 미세 조사 설정을 결정합니다. 세포의 미세 조사 전에 FOV의 고해상도 이미지를 사용하여 나중에 분석을 위해 PCNA 포시를 식별하십시오. 순차적 스캐닝 대신 두 파장에서 스캔하는 사이의 세포 이동을 피하기 위해 사용되는 광학 채널(녹색과 빨간색)을 동시에 기록합니다. foci의 적절한 해상도를 위해 1x 줌(여기서 사용되는 이미징 시스템의 0.29 μm 픽셀 크기)이 있는 최소 1024 x 1024 픽셀/필드 해상도를 사용하며, 평균 2배의 1/8 프레임/s 스캐닝 속도(4.85 μs/pixel)를 사용합니다. 이러한 매개 변수가 A1 LFOV 컴팩트 GUI및 A1 LFOV 스캔 영역 창에서 설정되면 캡처 버튼을 눌러 FOV를 기록합니다.참고: 유사한 결과를 보장하기 위해 실험 전반에 걸쳐 동일한 픽셀 크기를 유지하는 것이 중요합니다. 마이크로 조사를 설정하려면 이미징 소프트웨어의 ND 자극 탭을 열어 시간 일정(A1 LFOV/Galvano Device) 창에 액세스합니다. 이것은 갈바노 스캐너를 사용하여 일련의 사전 자극 이미지를 획득하고 자극 (LUN-F 50 mW 405 nm FRAP 레이저사용)한 다음 갈바노 스캐너를 사용하여 일련의 자극 후 이미지를 다시 획득합니다. 먼저 시간 일정 창에 세 단계를 설정합니다. Acq/Stim 열에서 인수 | 선택 표백 | 각각 3단계에 대한 인수. 표백 단계의 경우 S1을 ROI로 설정합니다.참고: 여기에 제시된 실험에서는 자극 단계에서 이미지가 수집되지 않았습니다. Galvano XY 창에서마이크로 조사를 위한 주요 요소를 설정: 405 nm 레이저 출력, 거주 시간 (반복은 이 시스템에 기본적으로 1). 여기에 제시된 실험에서, 세포는 1000-3000 μs 가성 시간으로 100% 출력에서 405 nm FRAP 레이저(섬유 팁에서 50mW)로 조사되었다.참고: 레이저 거주 시간은 픽셀 단위로 유지되므로 픽셀 크기가 동일하게 유지되는 한 거주 시간과 전력 밀도 간의 관계는 다른 FOV 간에 유사합니다. 도 2A는 특정 손상 유도에 대한 레이저 전력 설정을 최적화하기 위해 DNA 손상 반응(DDR) 경로 특이적 단백질(DSBs및 NTHL1용 DXL10)의 사용을 나타낸다. 이러한 안정적인 세포주 프로토콜의 섹션 2 다음 바이러스 감염으로 생성되었다. 시간 경과 이미징. 시간 일정, A1 LFOV 컴팩트 GUI 및 A1 LFOV 스캔 영역 창을 사용하여 원하는 시간 창 및 간격에 대한 시간 경과 이미징을 설정합니다. 여기에 제시된 실험에서 EXO1b와 PCNA의 모집은 12분 동안 이미지화되어 5초마다 FOV를 스캔하여 1024 x 1024 픽셀/필드에서 1x 줌(여기서 사용되는 이미징 시스템에서 0.29 μm 픽셀 크기)을 사용하여 평균 0.35 프레임/s 스캐닝 속도(1.45 μs/픽셀)를 표백하지 않고 평균 적으로 감소시켰습니다. A1 LFOV 컴팩트 GUI 창에서 이미징 중에 사진 표백을 줄이기 위해 레이저 전력%%, 게인 및 오프셋 설정을 최적화합니다. POI와 PCNA를 모두 측정하는 것을 목표로 하는 경우, 두 개의 별도 형광에 대한 필드를 스캔하는 사이의 세포 이동을 피하기 위해 순차적 스캐닝 대신 동시 스캐닝을 사용합니다. 이미징 시스템은 다음 설정과 함께 사용되었습니다. 488 nm 레이저 라인 (20 mW)의 경우 : 7 % 레이저 전력, 게인 : 45 (GaAsP 검출기) 와 2, 561 nm 레이저 라인 (20 mW)에 대한 오프셋 : 4 % 레이저 전력, 40 (GaAsP 검출기)와 2의 오프셋. 단백질의 운동학에 따라 이미지 간의 간격또는 총 시간 경과의 간격을 연장하거나 단축합니다. 시간 일정 창에서 세 번째 단계 수집 행에 대해 원하는 간격 과 기간을 설정합니다. 지금 실행을 눌러 미세 조사 및 후속 시간 경과 이미징을 실행합니다. 시간 경과 이미징의 끝에서 자극 ROI를 별도의 이미지로 저장하여 분석에 사용되는 다운스트림 소프트웨어에서 미세 조사 좌표를 식별하는 데 유용합니다. 면역 형광 염색.참고: 단계 5.1.3 및 도 2A는 마이크로 조사에 의해 도입된 DNA 병변의 종류를 평가하기 위하여 알려진 DNA 복구 단백질의 사용을 보여줍니다. 특정 DNA 병변은 또한 세포를 고정한 후에 특정 항체를 사용하여 검출될 수 있습니다. 또한 내인성 단백질의 항체 검출에 의한 POI의 모집을 검출하는 것도 가능하다. DSB를 확인하는 γH2A.X의 시각화는아래(그림 2B)에서입증된다. 도 3은 내인성 및 외인성 태그 PCNA 모두에 대한 세포 주기 전반에 걸쳐 PCNA 국소화 및 모집의 일관성을 나타낸다. 5.1.3 단계 후, mPlum-PCNA의 모집에 따라 적절한 FRAP 이벤트를 보장하기 위해 미세 조사 후 하나의 이미지를 가져 가라. 면역 형광 라벨 링 후 나중에 필드를 찾기 위해 FOV의 정확한 좌표를 기록하십시오. 5-10 분 동안 5 %CO2를 포함하는 가습 된 분위기에서 현미경및 37 °C에서 세포 배양 챔버를 꺼내서 세포를 배양하십시오.참고: 파라포름알데히드(PFA)는 독성이 있으며 통풍이 잘 되는 부위 나 연기 후드에서 작업을 수행해야합니다. 모든 후속 세척 및 배양은 4 웰 챔버 슬라이드에서 0.5 mL 볼륨으로 수행됩니다. 인큐베이션 시간 후, PBS(137m NaCl, 2.7m MM KCl, 8m MM Na2HPO4,2mM KH2PO4)로세포를 세척하고 실온(RT)에서 10분 동안 PBS에서 4%의 PFA0.5mL로 수정한다. PBS로 세포를 한 번 씻은 다음 50m NH4Cl로 씻어 잔류 PFA를 담금질하십시오. PBS에서 0.1% 트리톤 X-100으로 RT에서 15분 동안 세포를 퍼메아빌화합니다. 블로킹 버퍼(5% FBS, 3% BSA, PBS에서 0.05% 트리톤 X-100)로 1h의 샘플을 차단합니다. 차단 용액을 제거하고 RT에서 1h에 대한 차단 버퍼에 희석 된 1 차 항체 (안티 γH2A.X, 1:2000)를 추가합니다. 블로킹 버퍼 3 x 10 분으로 우물을 씻으시면됩니다. 희석 된 이차 항체 (안티 마우스 알렉사 488 플러스 공주, 1:2000)를 RT에서 1 h에 대한 버퍼를 차단하는 데 추가하십시오. 블로킹 버퍼 3 x 10 분으로 우물을 씻으시면됩니다. 15 분 동안 PBS에서 1 μg / mL DAPI 용액으로 핵을 카운터 스테인하십시오. PBS로 한 번 셀을 씻으시다. 이미징은 PBS 또는 안티페이드 시약(예를 들어, AFR3)을 사용하여 PBS 용액에서 직접 수행하여 광표백을 줄일 수 있습니다. 6. 채용 분석 참고: 그림 4A는 DMSO 또는 olaparib의 존재에 엑소1b및 PCNA 모집의 대표적인 이미지를 보여줍니다. 도 4B는 데이터 분석을 위한 대표적인 이미지를 나타낸다. 평균 형광 값은 피지를 사용하여 다른 시점에서 mPlum-PCNA (A, 노란색 사각형)에 의해 강조 된 레이저 트랙을 따라 사각형을 사용하여 평균 AcGFP 강도를 측정하여 계산되었다. PCNA는 ROI 좌표를 따라 성공적인 조사를 강조하는 내부 제어 역할을 할 수 있습니다. 유사하게, 평균 AcGFP 형광 값은 또한 핵의 손상되지 않은 영역에 대해 계산되었다 (B, 파란색 사각형). 배경 신호 강도는 채밀되지 않은 영역(C, 적색 사각형)에서 측정되었으며 평균 형광값(그림 A 및 B)에서빼었다. 따라서, 각 데이터 수집 점에 대한 상대평균 형광 단위(RFU)는 방정식 RFU =(A-C)/(B−C)8,9에의해 계산되었다. 마이크로 조사 영역의 결과 RFU 값은 미세 조사 전에 RFU 값으로 정규화됩니다. 미세 조사 부위의 영역 A를 정의하기 위해, 세포의 뉴클레올라 영역, 복제 포시 및 불규칙한 핵 영역을 측정에서 배제한다. 피지에서 두 개의 ROI를 그리는 사이에 시프트 키를 두 개의 별도 영역을 하나로 그룹화합니다.참고: 단백질 모집은 다른 유전자 와 조사 조건 사이에서 변화할 것입니다; 따라서 지역 A의 크기는 개별적으로 결정되어야 합니다. 지역 A의 픽셀 너비가 결정되면 비교 채용에 대해 일정하게 유지되어야 합니다. 여기에 제시된 실험에서 7픽셀 너비 사각형이 사용되었습니다. 기록된 비디오의 기간 동안 이동한 셀을 분석에서 제외합니다. 고도로 이동성 셀을 포함하려면, 기술된 분석은 프레임별 수행되어야 한다. 채용 프로필을 시각화하려면 통계 소프트웨어를 사용하여 정규화된 RFU 값을 시간에 대해 플롯합니다. Mann-Whitney 테스트를 사용하여 DMSO와 olaparib(n=31) 치료 사이의 표시된 시간 지점에서 차이를 계산합니다.