激光微辐射研究S阶段DNA招募

1. 培养人类骨肉瘤衍生细胞（U-2操作系统） 注：U-2操作系统细胞非常适合这些研究，因为它们具有扁平的形态、大核和紧密连接到多个表面，包括玻璃。也可以使用具有类似特征的其他细胞系。 对于U-2操作系统细胞系的培养，使用麦考伊的5A介质补充10%胎儿牛血清（FBS）和抗生素（100U/mL青霉素和100微克/mL链霉素）。在含有 5% CO2的潮湿大气中在 37 °C 下孵育细胞。对于显微镜研究，保持细胞培养在10厘米的盘子，以提供足够的细胞计数。 当细胞接近90%的汇流（+7 x 106 细胞/10厘米盘），分裂细胞。 用PBS冲洗细胞，洗去血清中含有的试丁香抑制剂。 加入1兆L的Trypsin-EDTA，并确保细胞层被平等覆盖。 在 37 °C 下孵育，直到细胞层从板上抬起（约 6 分钟）。 将含有介质的血清中的试用细胞重新激活，使试剂素失活，并将体积的 1/10（+0.7 x 106细胞）添加到包含 10 mL 补充生长介质的新 10 厘米板中。 在实验之前，根据制造商的建议，使用通用支原体检测套件对细胞进行支原体污染的常规测试。 2. 逆转录病毒感染 注：有关 BSL-2 安全措施，在处理重组病毒时，请参阅：NIH 指南，III-D-3 节：组织培养中的重组病毒。 种子 4 x 106 HEK293T 细胞在电镀成 10 厘米培养皿后，可在 24 小时内实现 +60% 的汇流。 对于培养 HEK293T，请遵循本协议中 1.1-1.3 中描述的 U-2 操作系统的培养步骤。对于 Hek293t 替代麦考伊的 5a 媒体为 Dmem 。当 HEK293T 细胞弱弱地附着在组织培养板上时，请务必轻轻地清洗它们。 使用脂质转染试剂对质粒进行病毒包装的 HEK293T 细胞进行转化。 对于逆转录病毒载体，请将 1.5 μg 的 VSV-G（添加基因 #8454）和 1.5 μg 的 pUMVC（添加剂 #8449）包装载体相结合 以及含有感兴趣基因的3微克载体（在具有纯霉素耐药性的逆转录病毒载体骨干中），在微中心管中加入250微升Opti-MEM减少血清介质。加入Opti-MEM/DNA混合物（在此例中为6微升），并轻敲轻轻混合，每加入1微克P3000试剂。不要上下漩涡或移液器。 在另一个微中心管中，将每 μg DNA（在此例中为 12 μL）的转染试剂与 250 μL Opti-MEM 减少血清介质结合。 将两种混合物（500 μL 组合在一起，不要旋转，只需轻轻敲击混合），让它在室温下孵育 15 分钟。 小心地将混合物滴入种子的 HEK293T 细胞，而不会分离细胞。轻轻地旋转盘子。 病毒感染产生稳定的细胞系。 转染后 72 h 从 HEK293T 细胞中取出含有超高纳坦的病毒。使用 0.45 μm 过滤器仔细过滤溶液，以去除细胞碎屑和分离的细胞。可选，在病毒超高分子中加入 8 μg/mL 聚苯乙烯，以促进病毒感染。 将含有超纳坦的病毒添加到 U-2 操作系统细胞中，在 10 厘米盘（+3 x 106 细胞）中以 +50% 的汇流度添加。前一天播种 U-2 操作系统单元。 在去除和丢弃含有病毒的超高超纳特之前感染 6-16 小时。注：为了达到对感兴趣的基因的预期过度表达量，在一定时间内培养一系列病毒稀释。检查每个新建立的细胞系中转基因的表达水平与西方斑点将其与内源水平进行比较。 允许细胞在适当的抗生素存在的情况下进行选择（在2μg/mL最终浓度的纯霉素的情况下3-4天），并在显微镜下验证荧光蛋白标记感兴趣的基因的表达。 重复这些步骤以生成双标记的细胞线。在本此间提出的实验中，mPlum-PCNA由逆转录病毒载体（pBABE）与EXO1B-ACGFP相结合，也从逆转录病毒载体（pRetroQ-ACGFP1-N1）表达。 3. 为微辐射制备细胞 电镀细胞：实验前24小时，将总共8.0×104 个细胞平板成500微升-1毫升介质（约70%的汇合）体积，在4个室室盖玻璃上，并配以1.5号玻硅酸盐玻璃底，为高放大镜和激光微辐射提供理想的结果。更高的细胞汇流允许在单个视场 （FOV） 中测量更多的细胞：然而，完全汇合的幻灯片将引入细胞周期不规则。 成像介质：在微辐照前一小时，用常规生长介质交换氟Brite DMEM，辅以10S、100 U/mL青霉素和100微克/mL链霉素、15mM HEPES（pH=7.4）和1mM钠-丙烯酸酯。这种成像介质有助于最大限度地提高信号与噪声比，从而检测出非常暗的荧光。由于它包含 HEPES，因此在没有 5% CO2 大气的情况下，它也能稳定 pH 值。 在此步骤的成像前应用任何其他治疗。在下面提出的实验中，细胞在成像前一小时用奥拉帕里布（PARP抑制剂，最终浓度为1微米）或车辆控制（DMSO）1，8，9进行预处理。 4. 准备显微镜并选择S相细胞进行成像。 使用具有与此处概述的系统类似的属性的同焦系统，以获得最佳效果。这里提出的实验是使用安装在倒置显微镜支架上的共聚焦显微镜进行的（见 材料表）。注：此处使用的显微镜配备了 50 mW 405 nm FRAP 激光模块和 60x 1.4 NA 石油计划-阿波克罗马特目标。共聚焦扫描头有两个扫描器选项：galvano 扫描仪（用于高分辨率）和共振扫描仪（用于高速成像）。 通过软件控制的 XY galvano 设备将光出血 （FRAP） 激光后的荧光恢复引入样品。使用 488 nm 激光线激发 AcGFP 和 561 nm 或 594 nm 激光线来激发 mPlum。注：以下滤光片组合提供最佳效果：使用 560 nm 长的通过过滤器，波长小于 560 nm 的发射光通过 ACGFP 的 525/50 nm 排放滤光片，而波长大于 560 nm 的发射光通过 595/50 nm 的排放滤波器传递。任何适当的过滤器集（例如，FITC/TRITC、GFP/mcherry、FITC/TxRed），确保最少的荧光流过可以使用。 打开环境室和显微镜组件。 在实验开始前至少 4 小时打开加热（舞台、目标和环境室）、CO2 供应和湿度调节器，以确保热平衡以获得稳定的图像采集。 在细胞转移到显微镜之前，至少 1 小时将光源与激光线一起初始化。 使用荧光标记的 PCNA 作为标记，在异步人群中选择 S 相细胞。按照下面的步骤做到这一点。 在 S 相中查找 mPlum 标记 PCNA 的独特本地化模式，从而可能识别此细胞周期阶段。PCNA 在细胞周期的 G1 和 G2 阶段的核中具有完全均匀的分布，同时被排除在细胞核之外。在 S 相中，PCNA 在核中重体的位置形成 foci。 图1 显示了整个S相的PCNA foci的不同模式，这使得甚至有可能区分早期、中期和后期S相。 透过眼部寻找一个FOV，它有足够的S相细胞进行微辐射。异步U-2操作系统细胞通常有30-40%的人口在S阶段。 尽量避免PCNA和感兴趣的蛋白质（POI）的表达水平（明亮和昏暗的细胞）的极端，在这种情况下EXO1b-ACGFP，这可能导致实验性人工制品。 找到合适的 FOV 时，尽量避免长时间扫描该字段，以尽量减少光出血和不需要的 DNA 损伤。 设置微辐照所需的感兴趣区域 （ROI）。使用相关软件（参见 材料表），首先插入二进制行（设置所需的行数和间距）设置所需的投资回报率。单击 二进制，然后单击 “插入”行|圆圈|椭圆形 绘制所需的线数。 将这些二进制行转换为 ROI，最后将这些 ROI 转换为刺激性投资回报率。为此，请首先单击 投资回报率，然后单击 “移动二进制”到 ROI，然后右键单击任何 ROI，然后选择 “用作刺激投资回报率：S1″。将这些线放入 FOV 中，以穿过细胞核。在整个协议中都使用了长度为 1024 像素的 ROI，该 ROV 横跨整个 FOV。 5. 免疫荧光染色或延时成像的微辐照。 确定最佳的微辐照设置。 在细胞进行微辐射之前，请拍摄 FOV 的更高分辨率图像，以识别 PCNA foci 以供以后分析。而不是连续扫描，同时记录使用的两个光通道（绿色和红色），以避免细胞在扫描之间的移动在两个波长。对于 foci 的正确分辨率，请使用至少 1024 x 1024 像素/场分辨率，1 倍变焦（此处使用的成像系统 0.29 μm 像素大小），扫描速度为 1/8 帧/s（4.85 μs/像素），平均为 2 倍。一旦这些参数设置在 A1 LFOV 紧凑型 GUI 和 A1 LFOV 扫描区域 窗口中，点击 捕获 按钮来记录 FOV。注：在整个实验过程中保持相同的像素大小以确保可比结果非常重要。 要设置微辐照，请打开成像软件中的 ND 刺激 选项卡以访问 时间表（A1 LFOV /Galvano 设备） 窗口。这使用 galvano 扫描仪获取一系列刺激前图像，刺激（使用 LUN-F 50mW 405 nm FRAP 激光），然后使用 galvano 扫描仪再次获取一系列刺激后图像。首先在 时间安排 窗口中设置三个阶段。在 Acq/Stim 列中选择 收购|漂白| 分别为三个阶段进行收购。对于漂白阶段，将 S1 设置为投资回报率。注：在此处介绍的实验中，在刺激阶段未获取任何图像。 在 Galvano XY窗口，设置了微辐照的关键因素：405纳米激光功率输出，停留时间（默认情况下迭代为1）。在此介绍的实验中，细胞以 100% 功率输出，以 1000-3000 μs 的居住时间，以 405 nm FRAP 激光照射（光纤尖端为 50 mW）。注：由于激光居住时间是按像素计算的，只要像素大小保持不变，居住时间和功率密度之间的关系将在不同的FOV之间进行比较。 图2A 显示使用DNA损伤反应（DDR）通路特定蛋白质（DSB的FBXL10和NTHL1的氧化碱基损伤），以优化激光功率设置，以进行特定的损伤诱导。这些稳定的细胞系是在协议第2节之后产生的病毒感染。 时间推移成像。 使用时间 表、A1 LFOV 紧凑型 GUI 和 A1 LFOV 扫描区域 窗口为所需的时间窗口和间隔设置时间延迟成像。在此处介绍的实验中， EXO1b 和 PCNA 的招募被成像 12 分钟，每 5 秒扫描一次 FOV，扫描 1024 x 1024 像素/场，使用 1 倍变焦（导致此处使用的成像系统 0.29 μm 像素大小），扫描速度为 0.35 帧/秒（1.45 μs/像素），而平均而言，可减少照片漂白。 优化 激光功率百分比， 增益 和 偏移设置 ，以减少 在A1 LFOV紧凑型GUI 窗口成像过程中的光漂白。如果一个人的目标是测量POI和PCNA，使用同步扫描，而不是连续扫描，以避免细胞运动之间的扫描场为两个单独的荧光。 成像系统用于以下设置。对于 488 nm 激光线 （20 mW）： 7% 激光功率， 增益： 45 （GaAsP 探测器） 与和偏移 2， 对于 561 nm 激光线 （20 mW）： 4% 激光功率， 获得 40 （GaAsP 探测器） 与和偏移 2. 根据蛋白质的动能，延长或缩短图像之间的间隔或总时间间隔。在 时间表 窗口中，设置第三阶段获取行所需的 间隔 和 持续时间 。 现在按运行以执行微辐照和随后的时间推移成像。 在时间推移成像结束时，将刺激性 ROI 保存为单独的图像，这将有助于识别用于分析的任何下游软件中的微辐照坐标。 免疫荧光染色。注：第5.1.3步和第 2A图 演示了使用已知的DNA修复蛋白来评估微辐照引入的DNA病变类型。修复细胞后，也可以使用特定的抗体检测某些DNA病变。也有可能通过内源性蛋白质的抗体检测来检测POI的招募。下图显示了检查 DSB 的 +H2A.X 的可视化 （图 2B）。 图3 显示了PCNA本地化和整个细胞周期对内源性和外源性标记PCNA的一致性。 第 5.1.3 步之后，在微辐射后只拍摄一张图像，以确保基于 mPlum-PCNA 的招聘，进行适当的 FRAP 活动。注意 FOV 的确切坐标，以便在免疫荧光标记后找到该字段。 将细胞培养室从显微镜中取出，在 37 °C 的潮湿大气中孵育细胞，其中含有 5% CO2， 时间为 5-10 分钟。注：副甲醛（PFA）是有毒的，工作应在通风良好的区域或烟气罩内进行。所有后续的清洗和孵化将在 4 井室滑梯中以 0.5 mL 的体积完成。孵化时间后，用 0.5 mL 的 PBS（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8 mM Na2HPO4和 2 mM KH2PO4）清洗细胞，并在室温下在 PBS 中用 0.5 mL 的 4% PFA 固定 10 分钟（RT）。 用 PBS 清洗细胞一次，然后用 50 mM NH4Cl 清洗它们，以淬火残留的 PFA。 在 Rt 用 Pbs 中的 0.1% Triton X – 100 使细胞渗透 15 分钟。 用阻塞缓冲器（5% FBS、3% BSA、PBS 中 0.05% 特里顿 X-100）将样品屏蔽 1 小时。 取出阻塞溶液，在 RT 的阻塞缓冲器中加入稀释的原发抗体（抗 +H2A.X，1：2000）1 小时。 用阻塞缓冲器清洗井 3 x 10 分钟。 在 RT 的阻塞缓冲 1 小时中加入稀释的二级抗体（抗鼠标 Alexa 488 Plus 结合体，1：2000）。 用阻塞缓冲器清洗井 3 x 10 分钟。 在 PBS 中使用 1 μg/mL DAPI 解决方案对核进行 15 分钟的计数。 用 PBS 清洗细胞一次。成像可直接在 PBS 或带有防褪料试剂（例如 AFR3）的 PBS 溶液中执行，以减少光出血。 6. 招聘分析 注：图4A显示Exo1b和PCNA招聘在DMSO或奥拉帕里布面前的代表性图像。图 4B显示用于数据分析的代表性图像。平均荧光值的计算方法是使用 mPlum-PCNA （A，黄色矩形） 在使用斐济的不同时间点上突出的激光轨道上使用矩形测量平均 ACGFP 强度。PCNA 可以用作内部控制，以突出显示沿投资回报率坐标的成功辐照。同样，平均 ACGFP 荧光值也用于计算核未损坏区域（B、蓝色矩形）。背景信号强度在无人居住区（C、红色矩形）测量，并从平均荧光值（图A和B）中减去。因此，每个数据收集点的相对平均荧光单元 （RFU） 由方程 RFU = （A + C）/ （B + C）8、9计算。由此产生的微辐照区域的 RFU 值在微辐照之前与 RFU 值正常化。 要定义微辐照位点的区域 A，则将细胞的核区、复制区和不规则核区域排除在测量之外。在斐济绘制两个 ROI 到将两个独立的区域为一个区域之间保持 移位 键。注：蛋白质的招募因基因和辐照条件而异：因此，A区域的大小必须单独确定。一旦确定区域 A 的像素宽度，任何比较招聘都应保持不变。在此处介绍的实验中，使用了 7 像素宽矩形。 将录制视频期间移动的单元格排除在分析中。要包含高度移动的单元格，必须逐帧执行上述分析。 要可视化招聘配置文件，请使用统计软件绘制标准化的 RFU 值与时间对比。 使用曼-惠特尼测试计算 DMSO 和奥拉帕里布 （n+31） 治疗之间指示的时间点的差异。