Investigación de la fagocitosis de Leishmania mediante microscopía confocal
Summary
El mecanismo asociado con la fagocitosis en la infección por Leishmania sigue siendo poco conocido. Aquí, describimos métodos para evaluar los eventos tempranos que ocurren durante la interacción de Leishmania con las células huésped.
Abstract
La fagocitosis es un proceso orquestado que implica distintos pasos: reconocimiento, unión e internalización. Los fagocitos profesionales absorben los parásitos Leishmania por fagocitosis, que consiste en reconocer ligandos en las superficies del parásito por múltiples receptores de células huésped. La unión de Leishmania a las membranas de macrófagos ocurre a través del receptor del complemento tipo 1 (CR1) y el receptor del complemento tipo 3 (CR3) y los receptores de reconocimiento de patrones. El lipofosfoglicano (LPG) y la glicoproteína de 63 kDa (gp63) son los principales ligandos implicados en las interacciones macrófago-leishmania . Tras el reconocimiento inicial de los ligandos del parásito por los receptores de la célula huésped, los parásitos se internalizan, sobreviven y se multiplican dentro de las vacuolas parasitóforas. El proceso de maduración de las vacuolas inducidas por Leishmania implica la adquisición de moléculas de vesículas intracelulares, incluidas las proteínas G monoméricas Rab 5 y Rab 7, la proteína de membrana lisosomal asociada 1 (LAMP-1), la proteína de membrana lisosomal asociada 2 (LAMP-2) y la proteína asociada a microtúbulos 1A/1B-cadena ligera 3 (LC3).
Aquí, describimos métodos para evaluar los eventos tempranos que ocurren durante la interacción de Leishmania con las células huésped utilizando microscopía confocal, incluyendo (i) unión (ii) internalización y (iii) maduración del fagosoma. Al agregar al cuerpo de conocimiento que rodea estos determinantes del resultado de la infección, esperamos mejorar la comprensión de la patogénesis de la infección por Leishmania y apoyar la eventual búsqueda de nuevos objetivos quimioterapéuticos.
Introduction
La leishmaniasis es una enfermedad tropical desatendida causada por parásitos protozoarios del género Leishmania, que da lugar a un amplio espectro de manifestaciones clínicas en el huésped vertebrado, incluyendo leishmaniasis cutánea, leishmaniasis mucocutánea y leishmaniasis visceral1. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estima que más de mil millones de personas están en riesgo, con más de un millón de nuevos casos reportados por año2.
Leishmania spp. son protozoos intracelulares obligados que sobreviven dentro de las células huésped, incluyendo monocitos, macrófagos y células dendríticas3. La interacción Leishmania-macrófagos es un proceso complejo que involucra múltiples receptores de células huésped y ligandos parásitos, ya sea a través de interacción directa o por opsonización que involucra receptores del complemento 4,5. Los receptores de superficie clásicos, como CR1, CR3, manosa-fucosa, fibronectina, toll-like y receptores eliminadores, median la unión del parásito a los macrófagos 6,7,8. Estos receptores reconocen moléculas en la superficie de Leishmania, incluyendo la glicoproteína de 63 kDa (gp63) y el lipofosfoglicano glicolípido (LPG)9. Estas son las moléculas más abundantes en la superficie de los promastigotes y juegan un papel esencial en la subversión de la respuesta inmune del huésped, favoreciendo el establecimiento de la infección parasitaria en células de mamíferos10. Después de que los ligandos de superficie del parásito se unen a los receptores de macrófagos, la actina F se acumula en las superficies celulares de los mamíferos, rodeando a los parásitos a medida que se fagocitan. Posteriormente, esto conduce a la formación de un compartimento inducido por parásitos denominado vacuola parasitófora (PV), que presenta características fagolisosomales11. Una vez dentro de estos fagolisomas, los parásitos sufren varias alteraciones esenciales para la supervivencia y la multiplicación3.
La biogénesis de PVs es un proceso de tráfico de membrana altamente regulado crítico para la supervivencia intracelular de este patógeno12. La formación de este compartimento resulta de eventos de fusión secuencial entre fagosomas y compartimentos de la vía endocítica del huésped. Los estudios clásicos de biología celular han revelado que la maduración de PVs implica la adquisición de proteínas monoméricas G Rab 5 y Rab 7, que se asocian principalmente con la maduración temprana y tardía del endosoma, respectivamente13. Además, estos compartimentos adquieren proteínas de membrana asociadas a lisosomas 1 y 2 (LAMP 1, LAMP 2), los principales constituyentes proteicos de la membrana lisosomal y proteína asociada a microtúbulos 1A/1B-cadena ligera 3 (LC3), un marcador autofagosómico14. A pesar de las similitudes aparentes, la cinética de la formación de PV15,16 y la morfología de estos compartimentos varían dependiendo de las especies de Leishmania. Por ejemplo, la infección causada por L. mexicana o L. amazonensis induce la formación de grandes compartimentos que contienen un gran número de parásitos17. Por el contrario, otras especies, como L. braziliensis y L. infantum, forman vacuolas más pequeñas que normalmente contienen sólo uno o dos parásitos en cada vacuola18.
A pesar de este conocimiento que rodea la interacción entre la célula huésped y Leishmania, los eventos iniciales desencadenados por el contacto entre los receptores del huésped y los ligandos del parásito no se han dilucidado completamente. Se sabe que estos eventos son determinantes del resultado de la infección parasitaria y dependen de las especies de parásitos, el tipo de receptores de células huésped reclutados para reconocer parásitos y la activación de las vías de señalización de macrófagos19,20. Por lo tanto, es esencial identificar las moléculas involucradas en la biogénesis de PV inducidas por Leishmania y determinar el papel (s) desempeñado por estas moléculas en el establecimiento y el resultado de la infección. Aquí, describimos un método para monitorear los eventos tempranos que ocurren durante la fagocitosis de Leishmania, incluida la unión, la internalización, la formación de fagosomas y la maduración. Este trabajo podría ayudar a aclarar la participación de PLC, Akt, Rab5, Rab7 y LC3 en la formación de PVs inducidos por diferentes especies de Leishmania. Es importante destacar que este protocolo se puede utilizar para investigar la participación de otras proteínas involucradas en la maduración fotovoltaica. Los estudios futuros ampliarán el conocimiento sobre los mecanismos involucrados en la interacción Leishmania-célula huésped y contribuirán al diseño de nuevas estrategias quimioterapéuticas.
Protocol
Representative Results
Discussion
La interacción leishmania-macrófagos es un proceso complejo e involucra varios pasos que pueden influir en el desarrollo de la enfermedad5. Para comprender mejor los mecanismos implicados en la interacción de la Leishmania no opsonizada y las células huésped, hemos descrito un protocolo que emplea microscopía de fluorescencia confocal para evaluar la fagocitosis desde las etapas tempranas hasta las últimas de la infección por Leishmania. El uso de técnicas de fl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Instituto Gonçalo Moniz, Fiocruz Bahía, Brasil y al departamento de microscopía por su ayuda. Este trabajo fue apoyado por INOVA-Fiocruz número 79700287000, P.S.T.V. tiene una beca para productividad en investigación del CNPq (305235/2019-2). Los plásmidos fueron amablemente proporcionados por Mauricio Terebiznik, Universidad de Toronto, CA. Los autores desean agradecer a Andris K. Walter por la revisión del idioma inglés y la asistencia en la edición de manuscritos.
Materials
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | Tem varios no site | |
| anti-LC3 antibody | Novus Biologicals | NB600-1384 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | X | |
| CellStripper | Corning | 25-056-CI | |
| CellTracker Red (CMTPX) Dye | Thermo Fisher Scientific | C34552 | |
| Centrífuga | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ciprofloxacin | Isofarma | X | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Confocal fluorescence microscope (Leica SP8) | Leica | Leica SP8 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | |
| Fluorescence microscope (Olympus Lx73) | Olympus | Olympus Lx73 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750045 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N’-2-ethane-sulfonic acid) | Gibco | X | |
| Histopaque | Sigma | 10771 | |
| M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | |
| Nucleofector solution | Lonza | VPA-1007 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Phorbol myristate acetate (PMA) | Sigma | P1585 | |
| Phosphate buffer solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade kit | Life Technologies | P36931 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco | 11875-093 | |
| Saponin | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Schneider's Insect medium | Sigma | S0146 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Triton X-100 | Sigma | X |
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