Исследование фагоцитоза лейшмании с помощью конфокальной микроскопии

Лейшманиоз является запущенным тропическим заболеванием, вызываемым простейшими паразитами рода Leishmania, приводящим к широкому спектру клинических проявлений у позвоночного хозяина, включая кожный лейшманиоз, слизисто-кожный лейшманиоз и висцеральный лейшманиоз¹. По оценкам Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), более одного миллиарда человек находятся в группе риска, причем более одного миллиона новых случаев регистрируются в год².

Leishmania spp. являются облигатными внутриклеточными простейшими, которые выживают внутри клеток-хозяев, включая моноциты, макрофаги и дендритные клетки³. Взаимодействие лейшмании и макрофагов представляет собой сложный процесс, который включает в себя несколько рецепторов клеток-хозяев и лигандов паразитов либо путем прямого взаимодействия, либо путем опсонизации с участием рецепторов комплемента ^4,5. Классические поверхностные рецепторы, такие как CR1, CR3, манноза-фукоза, фибронектин, толл-подобные и поглотители рецепторов, опосредуют прикрепление паразитов к макрофагам ^6,7,8. Эти рецепторы распознают молекулы на поверхности лейшмании, включая гликопротеин 63 кДа (gp63) и гликолипидный липофосфогликан (LPG)⁹. Это наиболее распространенные молекулы на поверхности промастиготов и играют важную роль в подрыве иммунного ответа хозяина, способствуя установлению паразитарной инфекции в клетках млекопитающих¹⁰. После того, как поверхностные лиганды паразитов связываются с рецепторами макрофагов, F-актин накапливается на клеточных поверхностях млекопитающих, окружающих паразитов по мере их фагоцитоза. Впоследствии это приводит к образованию паразитарно-индуцированного компартмента, называемого паразитофорной вакуолей (PV), который представляет фаголисосомальные признаки¹¹. Попав внутрь этих фаголизосом, паразиты претерпевают несколько изменений, необходимых для выживания и размножения³.

Биогенез PV представляет собой высоко регулируемый процесс мембранного трафика, критически важный для внутриклеточной выживаемости этого патогена¹². Образование этого компартмента происходит в результате последовательных слияний между фагосомами и компартментами эндоцитарного пути хозяина. Классические исследования клеточной биологии показали, что созревание PV включает в себя приобретение мономерного G-белка Rab 5 и rab 7 белков, которые в основном связаны с ранним и поздним созреванием эндосом соответственно¹³. Кроме того, эти компартменты приобретают лизосомно-ассоциированные мембранные белки 1 и 2 (LAMP 1, LAMP 2), основные белковые составляющие лизосомальной мембраны и микротрубочки-ассоциированный белок 1A/1B-световая цепь 3 (LC3), аутофагосомный маркер¹⁴. Несмотря на кажущееся сходство, кинетика PV-образования^15,16 и морфология этих компартментов варьируются в зависимости от вида Leishmania. Например, инфекция, вызванная L. mexicana или L. amazonensis, вызывает образование крупных компартментов, содержащих большое количество паразитов¹⁷. Напротив, другие виды, такие как L. braziliensis и L. infantum, образуют более мелкие вакуоли, которые обычно содержат только одного или двух паразитов в каждой вакуоле¹⁸.

Несмотря на эти знания, связанные с взаимодействием клетки-хозяина и лейшмании, первоначальные события, вызванные контактом между рецепторами хозяина и лигандами паразитов, не были полностью выяснены. Эти события, как известно, являются детерминантами исхода заражения паразитами и зависят от видов паразитов, типа рецепторов клеток-хозяев, набираемых для распознавания паразитов, и активации сигнальных путей макрофагов^19,20. Поэтому важно идентифицировать молекулы, участвующие в биогенезе Индуцированных Лейшманией ПВ, и определить роль (роли), которую играют эти молекулы в установлении инфекции и исходе. Здесь мы описываем метод мониторинга ранних событий, происходящих во время фагоцитоза лейшмании, включая связывание, интернализацию, образование и созревание фагосом. Эта работа может помочь прояснить участие PLC, Akt, Rab5, Rab7 и LC3 в формировании PV, индуцированных различными видами Leishmania. Важно отметить, что этот протокол может быть использован для исследования участия других белков, участвующих в pv-созревании. Будущие исследования расширят знания, связанные с механизмами, участвующими во взаимодействии клеток лейшмании и хозяина, и внесут вклад в разработку новых химиотерапевтических стратегий.