Studiare la fagocitosi della Leishmania usando la microscopia confocale

La leishmaniosi è una malattia tropicale trascurata causata da protozoi parassiti del genere Leishmania, che provoca un ampio spettro di manifestazioni cliniche nell’ospite vertebrato, tra cui la leishmaniosi cutanea, la leishmaniosi mucocutanea e la leishmaniosi viscerale¹. L’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) stima che oltre un miliardo di persone siano a rischio, con oltre un milione di nuovi casi segnalati ogni anno².

Leishmania spp. sono protozoi intracellulari obbligati che sopravvivono all’interno delle cellule ospiti, inclusi monociti, macrofagi e cellule dendritiche³. L’interazione Leishmania-macrofagi è un processo complesso che coinvolge più recettori delle cellule ospiti e ligandi parassiti sia attraverso l’interazione diretta che per opsonizzazione che coinvolge i recettori del complemento ^4,5. I recettori di superficie classici, come CR1, CR3, mannosio-fucosio, fibronectina, recettori toll-like e scavenger, mediano l’attaccamento del parassita ai macrofagi ^6,7,8. Questi recettori riconoscono le molecole sulla superficie della Leishmania, tra cui la glicoproteina 63 kDa (gp63) e il glicolipide lipofosfoglicano (LPG)⁹. Queste sono le molecole più abbondanti sulla superficie dei promastigoti e svolgono un ruolo essenziale nella sovversione della risposta immunitaria dell’ospite, favorendo l’instaurarsi dell’infezione parassitaria nelle cellule di mammifero¹⁰. Dopo che i ligandi superficiali del parassita si legano ai recettori dei macrofagi, la F-actina si accumula sulle superfici cellulari dei mammiferi, circondando i parassiti mentre sono fagocitati. Successivamente, questo porta alla formazione di un compartimento indotto dal parassita chiamato vacuolo parassitoforo (PV), che presenta caratteristiche fagolisosomiali¹¹. Una volta all’interno di questi fagolisosomi, i parassiti subiscono diverse alterazioni essenziali per la sopravvivenza e la moltiplicazione³.

La biogenesi dei PV è un processo di traffico di membrana altamente regolato critico per la sopravvivenza intracellulare di questo patogeno¹². La formazione di questo compartimento deriva da eventi di fusione sequenziale tra fagosomi e compartimenti della via endocitica dell’ospite. Studi classici di biologia cellulare hanno rivelato che la maturazione dei PV comporta l’acquisizione delle proteine monomeriche G Rab 5 e Rab 7, che sono principalmente associate alla maturazione precoce e tardiva dell’endosoma, rispettivamente¹³. Inoltre, questi compartimenti acquisiscono le proteine di membrana associate ai lisosomi 1 e 2 (LAMP 1, LAMP 2), i principali costituenti proteici della membrana lisosomiale e la proteina 1A/1B-catena leggera associata ai microtubuli (LC3), un marcatore autofagosomico¹⁴. Nonostante apparenti somiglianze, la cinetica della formazione PV^15,16 e la morfologia di questi compartimenti variano a seconda delle specie di Leishmania. Ad esempio, l’infezione causata da L. mexicana o L. amazonensis induce la formazione di grandi compartimenti contenenti un gran numero di parassiti¹⁷. Al contrario, altre specie, come L. braziliensis e L. infantum, formano vacuoli più piccoli che normalmente contengono solo uno o due parassiti in ogni vacuolo¹⁸.

Nonostante questa conoscenza che circonda l’interazione cellula ospite-Leishmania, gli eventi iniziali innescati dal contatto tra i recettori dell’ospite e i ligandi dei parassiti non sono stati completamente chiariti. Questi eventi sono noti per essere determinanti dell’esito dell’infezione parassitaria e dipendono dalle specie di parassiti, dal tipo di recettori delle cellule ospiti reclutati per riconoscere i parassiti e dall’attivazione delle vie di segnalazione dei macrofagi^19,20. Pertanto, è essenziale identificare le molecole coinvolte nella biogenesi dei PV indotti da Leishmania e determinare il ruolo svolto da queste molecole nell’instaurazione e nell’esito dell’infezione. Qui, descriviamo un metodo di monitoraggio degli eventi precoci che si verificano durante la fagocitosi della Leishmania, tra cui il legame, l’internalizzazione, la formazione e la maturazione dei fagosomi. Questo lavoro potrebbe aiutare a chiarire la partecipazione di PLC, Akt, Rab5, Rab7 e LC3 nella formazione di PV indotti da diverse specie di Leishmania. È importante sottolineare che questo protocollo può essere utilizzato per studiare la partecipazione di altre proteine coinvolte nella maturazione del PV. Studi futuri amplieranno le conoscenze sui meccanismi coinvolti nell’interazione Leishmania-cellula ospite e contribuiranno alla progettazione di nuove strategie chemioterapiche.