Producción de anticuerpos monoclonales dirigidos a la aminopeptidasa N en el epitelio de la mucosa intestinal porcina
Summary
La proteína de anticuerpo recombinante expresada en células pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO y anticuerpos monoclonales producidos utilizando la tecnología tradicional de hibridoma puede reconocer y unirse a la proteína N aminopeptidasa porcina (APN).
Abstract
La aminopeptidasa porcina N (APN), una metalopeptidasa unida a la membrana abundantemente presente en la mucosa del intestino delgado, puede iniciar una respuesta inmune de la mucosa sin ninguna interferencia, como baja expresión de proteínas, inactividad enzimática o cambios estructurales. Esto hace que APN sea un candidato atractivo en el desarrollo de vacunas que se dirigen selectivamente al epitelio de la mucosa. Estudios previos han demostrado que la APN es una proteína receptora tanto para la Escherichia coli enterotoxigénica (E. coli) F4 como para el virus de la gastroenteritis transmisible. Por lo tanto, APN se muestra prometedora en el desarrollo de conjugados anticuerpo-fármaco o nuevas vacunas basadas en anticuerpos específicos de APN. En este estudio, comparamos la producción de anticuerpos monoclonales específicos de APN (mAbs) utilizando la tecnología tradicional de hibridoma y el método de expresión de anticuerpos recombinantes. También establecimos una línea celular de ovario de hámster chino (CHO) transfectada de manera estable utilizando pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN y una cepa BL21 (DE3) de expresión de E. coli que alberga el vector pET28a (+)-rAbs-APN. Los resultados muestran que los anticuerpos expresados en células pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO y mAbs producidos mediante hibridomas podrían reconocer y unirse a la proteína APN. Esto proporciona la base para una mayor elucidación de la función del receptor de APN para el desarrollo de terapias dirigidas a diferentes epítopos específicos de APN.
Introduction
La aminopeptidasa N (APN), una enzima moonlighting que pertenece a la familia de la metaloproteinasa M1, actúa como marcador tumoral, receptor y molécula de señalización a través de vías dependientes de enzimas e independientes de enzimas 1,2. Además de escindir los residuos de aminoácidos N-terminales de varios péptidos bioactivos para la regulación de su actividad biológica, APN juega un papel importante en la patogénesis de diversas enfermedades inflamatorias. La NPA participa en el procesamiento y presentación de antígenos por péptidos recortados que se unen estrechamente a las principales moléculas del complejo de histocompatibilidad de clase II 2,3. La NPA también ejerce efectos antiinflamatorios al unirse con receptores acoplados a proteínas G que participan en la transducción de señales múltiples, modulando la secreción de citoquinas y contribuyendo a la fagocitosis mediada por el receptor gamma Fc en la respuesta inmune 4,5,6,7.
Como exopeptidasa unida a la membrana ampliamente distribuida, la NPA es abundante en la mucosa del intestino delgado porcino y está estrechamente asociada con la endocitosis mediada por receptores 1,5,8. La NPA reconoce y se une a la proteína espiga del virus de la gastroenteritis transmisible para la entrada celular, e interactúa directamente con la subunidad FaeG de las fimbrias enterotoxigénicas Escherichia coli F4 para afectar la adherencia bacteriana con las células huésped 9,10,11. Por lo tanto, la NPA es una potencial diana terapéutica en el tratamiento de enfermedades infecciosas virales y bacterianas.
Desde el desarrollo de la tecnología de hibridoma y otras estrategias para la producción de anticuerpos monoclonales (mAbs) en 1975, los mAbs se han utilizado ampliamente en inmunoterapia, administración de fármacos y diagnóstico12,13,14. Actualmente, los mAbs se utilizan con éxito para tratar enfermedades como el cáncer, la enfermedad inflamatoria intestinal y la esclerosis múltiple12,15. Debido a su fuerte afinidad y especificidad, los mAbs pueden ser objetivos ideales en el desarrollo de conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) o nuevas vacunas16,17. La proteína APN es crítica para la entrega selectiva de antígenos a células específicas, y puede provocar una respuesta inmune de la mucosa específica y fuerte contra patógenos sin ninguna interferencia, incluida la baja expresión de proteínas, la inactividad enzimática o los cambios estructurales 5,8,18. Por lo tanto, los productos terapéuticos basados en mAbs específicos de APN son prometedores contra las infecciones bacterianas y virales. En este estudio, describimos la producción de mAbs específicos de APN utilizando tecnología de hibridoma y la expresión de anticuerpos recombinantes anti-APN (rAbs) utilizando vectores procariotas y eucariotas. El resultado indica que la proteína APN fue reconocida tanto por rAbs expresados en células pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO como por mAbs derivadas de hibridomas.
Protocol
Representative Results
Discussion
La inducción de la inmunidad de la mucosa es uno de los enfoques más efectivos para contrarrestar los patógenos y en la prevención y el tratamiento de diversas enfermedades. La NPA, una proteína unida a la membrana altamente expresada en la mucosa intestinal, está implicada en la inducción de la respuesta inmune adaptativa y en la endocitosis viral y bacteriana mediada por receptores 1,5,8. La NPA se utiliza como partícu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por la Beca de la Fundación Nacional de Ciencias de China (No. 32072820, 31702242), subvenciones de la Beca del Gobierno de Jiangsu para Estudios en el Extranjero (JS20190246) y Talentos de Alto Nivel de la Fundación de Investigación Científica de la Universidad de Yangzhou, un proyecto fundado por el Programa Académico Prioritario de Desarrollo de la Institución de Educación Superior de Jiangsu.
Materials
| Complete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Animal immunization |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1002 | Nuclear counterstain |
| DMEM | Gibco | 11965092 | Cell culture |
| DMEM-F12 | Gibco | 12634010 | Cell culture |
| Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody | Abbkine | A23310 | Indirect immunofluorescence analysis |
| Enhanced Cell Counting Kit-8 | Beyotime Biotechnology | C0042 | Measurement of cell viability and vitality |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10091 | Cell culture |
| Geneticin™ Selective Antibiotic | Gibco | 11811098 | Selective antibiotic |
| HAT Supplement (50X) | Gibco | 21060017 | Cell selection |
| HT Supplement (100X) | Gibco | 11067030 | Cell selection |
| Incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Animal immunization |
| isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich | I5502 | Protein expression |
| kanamycin | Beyotime Biotechnology | ST102 | Bactericidal antibiotic |
| Leica TCS SP8 STED confocal microscope | Leica Microsystems | SP8 STED | Fluorescence imaging |
| Lipofectamine® 2000 Reagent | Thermofisher | 11668019 | Transfection |
| LSRFortessa™ fluorescence-activated cell sorting | BD | FACS LSRFortessa | Flow cytometry |
| Microplate reader | BioTek | BOX 998 | ELISA analysis |
| Micro spectrophotometer | Thermo Fisher | Nano Drop one | Nucleic acid concentration detection |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | Culture broth |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | Culture broth |
| Opti-MEM | Gibco | 31985088 | Cell culture |
| Polyethylene glycol 1500 | Roche Diagnostics | 10783641001 | Cell fusion |
| PrimeScript™ 1st strand cDNA Synthesis Kit | Takara Bio | RR047 | qPCR |
| protein A agarose | Beyotime Biotechnology | P2006 | Antibody protein purification |
| Protino® Ni+-TED 2000 Packed Columns | MACHEREY-NAGEL | 745120.5 | Protein purification |
| SBA Clonotyping System-HRP | Southern Biotech | May-00 | Isotyping of mouse monoclonal antibodies |
| Seamless Cloning Kit | Beyotime Biotechnology | D7010S | Construction of plasmids |
| Shake flasks | Beyotime Biotechnology | E3285 | Cell culture |
| Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer | Beyotime Biotechnology | C0221A | Cell culture |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 170-3940 | Western blot |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Culture broth |
| Ultrasonic Homogenizer | Ningbo Xinzhi Biotechnology | JY92-IIN | Sample homogenization |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | Culture broth |
| 96-well microplate | Corning | 3599 | Cell culture |
References
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