Qui, presentiamo un protocollo per studiare la competitività dell’accoppiamento di Aedes aegypti maschi usando il colorante fluorescente come marcatore. Le zanzare femmine sono esposte a maschi sia marcati che non contrassegnati per la copulazione. Dopo l’accoppiamento, le loro spermatece vengono esaminate al microscopio a fluorescenza per determinare il loro partner di accoppiamento.
Il successo dei programmi di soppressione della popolazione basati sulla tecnica degli insetti sterili o incompatibili dipende dalla capacità dei maschi rilasciati di competere per le femmine selvatiche e indurre sterilità nella popolazione target. Quindi, la valutazione di laboratorio della competitività dell’accoppiamento maschile è essenziale per valutare l’idoneità del ceppo di rilascio prima del rilascio sul campo. Convenzionalmente, tale test viene eseguito determinando la proporzione di uova vitali prodotte dalle femmine dopo essere state esposte simultaneamente a due gruppi di maschi (ceppi selvatici e di rilascio) per l’accoppiamento. Tuttavia, questo processo richiede molto tempo e laborioso a causa della necessità di nutrire prima le femmine per la produzione di uova e quindi schiudere ed enumerare le uova covate per determinare la vitalità delle uova.
Inoltre, questo metodo non è in grado di discernere il grado di competitività tra due linee di zanzare sterili o infette da Wolbachiapoiché le zanzare femmine selvatiche produrranno uova non vitali solo dopo l’accoppiamento con entrambe. Per aggirare queste limitazioni, questo documento descrive un metodo più diretto per misurare la competitività dell’accoppiamento delle zanzare maschili in ambienti di laboratorio utilizzando il colorante fluorescente, la rodamina B (RhB), che può essere utilizzato per contrassegnare i maschi alimentandoli in soluzione di saccarosio contenente RhB. Dopo il test di accoppiamento, la presenza di spermatozoi fluorescenti nelle spermatece di una femmina può essere utilizzata per determinare il suo partner di accoppiamento. Questo metodo è conveniente, riduce il tempo sperimentale del 90% e consente il confronto dell’idoneità all’accoppiamento tra due linee sterili o infette da Wolbachia.
L’allevamento e il rilascio di maschi sterili o incompatibili per la soppressione delle popolazioni di zanzare Aedes è attualmente in fase di valutazione sul campo come nuovo strumento per prevenire focolai di dengue e altre malattie trasmesse da Aedes1. Le strategie di soppressione del rilascio maschile che sono attualmente in fase di sperimentazione sul campo includono l’uso del metodo genetico2,irradiazione (Sterile Insect Technique, SIT)3,batteri endosimbiotici Wolbachia (Insect Incompatible Technique, IIT)4,o una combinazione delle ultime due tecniche5,6. Il successo di questi approcci dipende in gran parte dalla capacità dei maschi rilasciati di superare i maschi selvatici e cercare femmine per garantire la copulazione. In caso contrario, la sterilità non può essere indotta nella popolazione target.
In un programma SIT classico, ad esempio, l’idoneità all’accoppiamento maschile può essere influenzata da fattori come la dose di irradiazione7,8,9,il protocollo di allevamento di massa e l’entità della consanguineità nella colonia10,11, 12,13,14. Inoltre, gli studi sulla competitività dell’accoppiamento possono fornire importanti conoscenze sul comportamento di accoppiamento delle zanzare che potrebbero essere utilizzate per informare le strategie di controllo dei vettori.
In SIT e IIT, la competitività di accoppiamento delle zanzare maschio è tipicamente valutata consentendo sia al ceppo selvatico che a quello di rilascio di competere per le femmine selvatiche in una gabbia8,11,15,16. Le femmine vengono quindi alimentate con sangue e le loro uova si schiudono per determinare la vitalità. Si presume che le femmine che depongono uova non vitali o uova con un basso tasso di schiusa si siano accoppiate con maschi di ceppo di rilascio, mentre le femmine che producono uova vitali si presume si siano accoppiate con maschi selvatici. La competitività di accoppiamento viene quindi calcolata con l’indice fritto17. Sfortunatamente, questo metodo richiede molte risorse e molto tempo, e l’indice fritto complessivo può essere influenzato da fattori confondenti esterni che influenzano la vitalità delle uova come la scarsa manipolazione delle uova e l’eccessiva essiccazione possono comportare un basso tasso di schiusa nella croce di compatibilità che può quindi portare a un indice di fried artificialmente basso.
Inoltre, questo metodo non consente il confronto diretto della competitività di accoppiamento tra zanzare Aedes che sono infettate da diversi ceppi di Wolbachia o che sono esposte a diverse dosi di irradiazione. Pertanto, è necessario un metodo più diretto per affrontare queste sfide. Recenti studi18,19 hanno dimostrato l’efficacia dell’uso del colorante fluorescente, RhB, per contrassegnare il liquido seminale delle zanzare maschili. Il liquido seminale marcato viene trasferito e immagazzinato nelle spermatece delle zanzare femmine dopo l’accoppiamento riuscito, consentendo la misurazione diretta dell’interazione dell’accoppiamento femminile con i maschi marcati. Rhodamine B è un colorante fluoronico tiolica-reattivo comunemente usato come biomarcatore per studi di ricerca ecologica e comportamentale su animali tra cui insetti20. Per gli studi sulle zanzare, RhB viene introdotto alimentandosi con acqua di zucchero o miele contenente rhB in polvere disciolta18,19,21,22,23,24. Al momento dell’assorbimento, il colorante RhB si lega alle proteine, macchiando il tessuto corporeo con una macchia rosa-rossastra che fluoresce di colore arancione brillante sotto una fonte di luce fluorescente.
Il forte segnale di fluorescenza e la stabilità della marcatura, unita alla sua capacità di macchiare i fluidi seminali degli insetti, consente il monitoraggio del trasferimento del liquido seminale marcato dal maschio marcato agli organi di stoccaggio dello sperma dell’insetto femminile per gli studi di accoppiamento18,19,21,24. L’uso di RhB in un test di competitività dell’accoppiamento maschile non solo consente la misurazione diretta dell’interazione di accoppiamento delle femmine con maschi marcati e non marcati, ma i risultati possono anche essere ottenuti entro 24 ore in quanto evita il processo di determinazione della vitalità dell’uovo, che in genere richiede circa 10-14 giorni. Inoltre, questo metodo supera la potenziale perdita di dati quando le zanzare femmine non si nutrono di sangue o muoiono prima dell’ovodeposizione. Ciò è particolarmente cruciale perché nelle prove semi-campo, dove le zanzare femmine sono soggette a danni e morte durante la raccolta post-accoppiamento utilizzando uno zaino o un aspiratore meccanico. Per affrontare le attuali limitazioni dell’uso della fertilità femminile, presentiamo un metodo alternativo che utilizza la colorazione RhB per misurare direttamente la competitività dell’accoppiamento delle zanzare maschili. Il metodo semplifica il flusso di lavoro, accorciando il tempo sperimentale da circa due settimane a un giorno, consentendo di eseguire più repliche sperimentali e consente il confronto tra due ceppi di rilascio. Questo protocollo sarà adatto per i laboratori che si stanno imbarcando in programmi di soppressione della popolazione di zanzare basati sul rilascio maschile e può essere utilizzato per il controllo di qualità di routine e la valutazione del ceppo.
La marcatura è comunemente usata nella ricerca entomologica per studiare la dinamica della popolazione di insetti, la dispersione, il comportamento e la biologia dell’accoppiamento26. Nei programmi SIT e IIT, la marcatura viene effettuata per differenziare il ceppo di rilascio dalla popolazione di campo per studiarne la dispersione e ottimizzare il rapporto di rilascio. I metodi di marcatura utilizzati includono la marcatura genetica27,28, incorporando isotopi negli alimenti larvali29,30, polvere fluorescente31e colorante32. Per la soppressione delle popolazioni di zanzare utilizzando SIT o IIT, dove l’idoneità all’accoppiamento maschile è una componente critica, i coloranti fluorescenti sono stati utilizzati come marcatori per studiare la biologia dell’accoppiamento delle zanzare18,19.
Convenzionalmente, la valutazione della competitività dell’accoppiamento maschile del ceppo di rilascio è stata valutata utilizzando saggi di fertilità femminile. Tuttavia, questo test richiede molto tempo e manodopera a causa dei processi sperimentali a valle post-accoppiamento (Figura supplementare S1). Questi processi includono l’alimentazione delle femmine, la raccolta delle uova, la schiusa delle uova e l’enumerazione della proporzione di uova schiuse per determinare la vitalità delle uova. In media, questo test richiede 30 ore-uomo e due settimane di lavoro sperimentale (a partire dalla creazione delle gabbie per il saggio di competitività) fino alla determinazione finale della competitività dell’accoppiamento maschile.
il suo articolo presenta l’uso di un colorante fluorescente, RhB, (alimentato allo 0,2% di RhB-saccarosio alle zanzare, Figura supplementare S2) per misurare direttamente le interazioni di accoppiamento tra femmine e maschi marcati rhB. Mentre questo protocollo richiede uno stereomicroscopio a fluorescenza, evita la necessità di eseguire le lunghe procedure sperimentali sopra menzionate. In media, questo test basato su RhB richiede circa 10 ore-uomo e circa un giorno per ottenere dati equivalenti a quello dei test di fertilità femminile. Questo >90% di risparmio di tempo consente ai ricercatori ricercatori di eseguire più repliche sperimentali, fornendo una convalida più robusta della forma fisica dell’accoppiamento maschile. Inoltre, questo test può essere utilizzato per confrontare la competitività dell’accoppiamento tra due linee di zanzare sterili o infette da Wolbachia.
Questo tipo di confronto non è possibile con i test di fertilità femminile convenzionali, poiché le femmine produrrebbero uova non vitali all’accoppiamento con entrambe le linee. Ciononostante, qualsiasi accoppiamento misto nell’esperimento comporterà una distorsione verso la popolazione marcata in quanto è difficile identificare spermatozoi non marcati nelle spermatece femminili che contengono liquido seminale da maschi marcati con RhB e non marcati. Una conclusione simile è stata fatta in uno studio che valuta la competitività dell’accoppiamento di Anopheles gambiae usando RhB18, per cui una percentuale maggiore di femmine nel test di accoppiamento è risultata essere accoppiata da maschi marcati. Poiché la poliandria è più probabile che si verifichi nelle femmine che in precedenza si erano impegnate in un accoppiamento interrotto33, la probabilità che ciò si verifichi è stata ridotta in questo studio utilizzando meno zanzare (da 20 maschi a 10 femmine) in un volume di gabbia più grande (0,216 m3) in questi esperimenti.
I risultati non hanno mostrato alcun pregiudizio verso la popolazione marcata RhB, indicando che l’accoppiamento misto era limitato. In sintesi, l’incorporazione di RhB per contrassegnare i maschi in un test di competitività dell’accoppiamento è un modo economico e rapido per valutare l’idoneità dell’accoppiamento maschile. Questo metodo consente anche il confronto diretto della competitività dell’accoppiamento tra maschi esposti a diverse dosi di irradiazione, allevati in diversi regimi di allevamento, o quelli infetti da diversi ceppi di Wolbachia, rendendolo uno strumento prezioso per la valutazione dell’idoneità all’accoppiamento maschile per qualsiasi programma di soppressione della popolazione di zanzare basato sul rilascio maschile.
The authors have nothing to disclose.
Questo studio è stato finanziato dalla National Environment Agency (NEA), Singapore. Ringraziamo Il signor Chew Ming Fai, vice amministratore delegato (salute pubblica), NEA, per la sua approvazione a pubblicare lo studio, e A / Prof Ng Lee Ching, direttore del gruppo (Environmental Health Institute Group), NEA, per il suo supporto in questo studio. Ringraziamo anche il dottor Shuzhen Sim e la dottoressa Denise Tan per aver corretto il manoscritto.
Compound light microscope | Olympus | CX23 | To score for spermathecae insemination |
Dissection forceps | Bioquip | Rubis forceps (4524) | |
Fluorescence stereo-light microscope with RFP1 filter | Olympus | SZX16 | To check for Rhodamine B fluorescence signal |
Mosquito cages | Bugdorm | 4F3030 | W 32.5 cm x D 32.5 cm x H 32.5 cm; mesh size of 150 x 150; 160 µm aperture For holding of male and female adult mosquitoes prior to mating assay |
6M610 | W 60 cm x D 60 cm x H 60 cm; mesh size of 44 x 32; 650 µm aperture For mating competitiveness assay |
||
Mosquito netting | 150 x 150, 160 µm aperture | ||
Rhodamine B | Sigma Aldrich | R6626 | ≥95% (HPLC) |
Stereo-light microscope | Olympus | SZ61 | For spermathecae dissection |
Sucrose | MP Biomedicals | SKU 029047138 | Food grade |
TetraMin tropical flakes | Tetra | 77101 | Fish food for feeding larvae |