Antivirale testen met hoge doorvoer om te screenen op remmers van Zika-virusreplicatie
Summary
In dit werk beschrijven we de protocollen die worden gebruikt in op replicon gebaseerde en virale enzymgebaseerde testen om te screenen op remmers van Zika-virusreplicatie in een screeningsformaat met hoge doorvoer.
Abstract
De ontdekking van antivirale geneesmiddelen vereist de ontwikkeling van betrouwbare biochemische en cellulaire assays die kunnen worden uitgevoerd in hts-formaten (high-throughput screening). Van de flavivirus niet-structurele (NS) eiwitten wordt gedacht dat ze co-translationeel assembleren op de endoplasmatische reticulum (ER) membranen, waardoor het replicatiecomplex (RC) wordt gevormd. De NS3 en NS5 zijn de meest bestudeerde enzymen van de RC en vormen de belangrijkste doelen voor de ontwikkeling van geneesmiddelen vanwege hun cruciale rol in virale genoomreplicatie. NS3-proteasedomein, dat NS2B als cofactor vereist, is verantwoordelijk voor de splitsing van het onrijpe virale polyproteïne in de volwassen NS-eiwitten, terwijl het NS5 RdRp-domein verantwoordelijk is voor de RNA-replicatie. Hierin beschrijven we in detail de protocollen die worden gebruikt in replicon-gebaseerde screenings en enzymatische assays om grote samengestelde bibliotheken te testen op remmers van de replicatie van het Zika-virus (ZIKV). Replicons zijn zelfreplicerende subgenomische systemen die tot expressie komen in zoogdiercellen, waarbij de virale structurele genen worden vervangen door een reporter-gen. De remmende effecten van verbindingen op virale RNA-replicatie kunnen eenvoudig worden geëvalueerd door de vermindering van de reporter-eiwitactiviteit te meten. De op replicon gebaseerde screenings werden uitgevoerd met behulp van een BHK-21 ZIKV replicon cellijn die Renilla luciferase tot expressie bracht als een reporter-gen. Om de specifieke doelen van geïdentificeerde verbindingen te karakteriseren, hebben we in-vitro fluorescentie-gebaseerde assays vastgesteld voor recombinant tot expressie gebracht NS3-protease en NS5 RdRp. De proteolytische activiteit van het virale protease werd gemeten met behulp van het fluorogene peptidesubstraat Bz-nKRR-AMC, terwijl de NS5 RdRp-rekactiviteit direct werd gedetecteerd door de toename van het fluorescerende signaal van SYBR Green I tijdens RNA-rek, met behulp van de synthetische gebiotinyleerde zelfaanzuigende sjabloon 3′UTR-U30 (5′-biotine-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3′).
Introduction
Het Zika-virus (ZIKV) is een opkomend door geleedpotigen overgedragen viruslid van het geslacht Flavivirus, dat het nauw verwante Dengue-virus (DENV), Japanse encefalitisvirus (JEV) en Gele Koortsvirus (YFV) omvat, die constante bedreigingen vormen voor de volksgezondheid1. De ZIKV-uitbraak van 2015-16 in Noord- en Zuid-Amerika kreeg wereldwijde aandacht na de opkomst ervan in Brazilië vanwege de associatie met ernstige neurologische aandoeningen, zoals congenitale ZIKV-geassocieerde microcefalie bij pasgeborenen2,3 en Guillain-Barré-syndroom bij volwassenen4. Hoewel het aantal gevallen van infectie in de komende twee jaar afnam, werden autochtone door muggen overgedragen transmissies van ZIKV in 2019 geverifieerd in 87 landen en gebieden, wat het potentieel van het virus waaruit het potentieel blijkt om opnieuw op te duiken als een epidemie5. Tot op heden zijn er geen goedgekeurde vaccins of effectieve geneesmiddelen tegen ZIKV-infectie.
De ontdekking van antivirale geneesmiddelen vereist de ontwikkeling van betrouwbare cellulaire en biochemische testen die kunnen worden uitgevoerd in hts-formaten (high-throughput screening). Replicon-gebaseerde screenings en virale enzymgebaseerde assays zijn twee waardevolle strategieën om verbindingen met kleine moleculen te testen op remmers van ZIKV1. Van de flavivirus niet-structurele (NS) eiwitten wordt gedacht dat ze co-translationeel assembleren op de endoplasmatische reticulum (ER) membranen, het vormen van het replicatiecomplex (RC)6. De NS3 en NS5 zijn de meest bestudeerde enzymen van de RC en vormen de belangrijkste doelen voor de ontwikkeling van geneesmiddelen vanwege hun cruciale rol in virale genoomreplicatie. NS3-proteasedomein, dat NS2B als cofactor vereist, is verantwoordelijk voor de splitsing van het onrijpe virale polyproteïne in de volwassen NS-eiwitten, terwijl het NS5 RdRp-domein verantwoordelijk is voor de RNA-replicatie6.
Replicons zijn zelfreplicerende subgenomische systemen die tot expressie komen in zoogdiercellen, waarbij de virale structurele genen worden vervangen door een reporter-gen. De remmende effecten van verbindingen op virale RNA-replicatie kunnen eenvoudig worden geëvalueerd door de vermindering van de reporter-eiwitactiviteit te meten7. Hierin beschrijven we de protocollen die worden gebruikt voor het screenen van remmers van de ZIKV-replicatie in een 96-well plaatformaat. De replicon-gebaseerde assays werden uitgevoerd met behulp van een BHK-21 ZIKV Rluc replicon cellijn die we onlangs hebben ontwikkeld8. Om de specifieke doelen van geïdentificeerde verbindingen te karakteriseren, hebben we in vitro fluorescentie-gebaseerde assays vastgesteld voor recombinant tot expressie gebracht NS3-protease met behulp van het fluorogene peptidesubstraat, Bz-nKRR-AMC, terwijl we voor NS5 RdRp de verlenging van de synthetische gebiotinyleerde zelfaanzuigende sjabloon 3′UTR-U30 (5′-biotine-U30-ACUGGAGAUCUCGAUCUCCAGU-3) hebben gemeten, met behulp van de intercalerende kleurstof SYBR Green I.
Het ZIKV-protease (45-96 residuen van NS2B-cofactor gekoppeld aan residuen 1-177 van NS3-proteasedomein door een glycinerijke linker [G4SG4]) werd verkregen, zoals beschreven voor YFV9, terwijl het polymerase (276-898 residuen van RdRp-domein) werd gekloond en uitgedrukt, zoals beschreven in10. Beide enzymsequenties zijn afgeleid van GenBank ALU33341.1. Als primaire antivirale screenings worden verbindingen getest op 10 μM en die met activiteiten ≥ 80% worden vervolgens op een dosisafhankelijke manier geëvalueerd, wat resulteert in de effectieve / remming (EC50 of IC50) en de cytotoxische (CC50) concentraties. In de context van representatieve resultaten worden de EC50- en CC50-waarden van NITD008, een bekende flavivirusremmer11, van op replicon gebaseerde screenings getoond. Voor de enzymatische assays worden de IC50-waarden van twee verbindingen uit de MMV/DNDi Pandemic Response Box getoond, een bibliotheek bestaande uit 400 moleculen met antibacteriële, schimmelwerende en antivirale activiteiten. De protocollen die in dit werk worden beschreven, kunnen worden aangepast om te screenen op remmers van andere gerelateerde flavivirussen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hierin beschreven protocollen kunnen gemakkelijk worden aangepast voor screenings in een 384- of 1536-well-formaat. Voor biochemische en/of celgebaseerde screenings die in HTS-formaat worden uitgevoerd, wordt voor elke plaat de Z’-factorwaarde, een statistische parameter, berekend om de gevoeligheid, reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid van die testen te waarborgen12. Een Z’-factorwaarde van 0,5 of hoger wordt verwacht voor op replicon gebaseerde screenings, terwijl een waarde van 0,7 of hoger…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), CEPID-subsidie 2013/07600-3 aan GO, subsidie 2018/05130-3 aan RSF en 2016/19712-9 aan ASG, en Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (subsidie 88887.516153/2020-00) aan ASG. We willen de Medicine for Malaria Ventures (MMV, www.mmv.org) en het Drugs for Neglected Diseases-initiatief (DNDi, www.dndi.org) dankbaar bedanken voor hun steun, het ontwerp van de Pandemic Response Box en het leveren van de verbindingen.
Materials
| 5'-biotin-U30- ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU -3' | Dharmacon | – | 100 ng |
| 96-well cell culture plates | KASVI | K12-096 | |
| 96-well PCR Microplate | KASVI | K4-9610 | |
| 96-well White Flat Bottom Polystyrene High Bind Microplate | Corning | 3922 | |
| AMC (7-amine-4-methylcoumarine) | SIGMA-Aldrich | 257370 | 100 mg |
| Aprotinin from bovine lung | SIGMA-Aldrich | A1153 | 10 mg |
| ATP | JenaBioscience | NU-1010-1G | 1 g |
| Bz-nKRR-AMC | International Peptides | – | 5 mg |
| Class II Biohazard Safety Cabinet | ESCO | ||
| Diethyl pyrocarbonate | SIGMA-Aldrich | D5758 | 25 mL |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | SIGMA-Aldrich | 472301 | 1 L |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | GIBCO | 3760091 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 12657-029 | 500 mL |
| G418 | SIGMA-Aldrich | A1720 | Disulfate salt |
| Glycerol | SIGMA-Aldrich | G5516 | 1 L |
| HERACELL VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| MnCl2 tetrahydrate | SIGMA-Aldrich | 203734 | 25 g |
| MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) | Invitrogen | M6494 | |
| NITD008 ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | SML2409 | 5 mg |
| qPCR system Mx3000P | Agilent | ||
| Renilla luciferase Assay System | PROMEGA | E2810 | |
| SpectraMax Gemini EM Fluorescence Reader | Molecular Devices | ||
| SpectraMax i3 Multi-Mode Detection Platform | Molecular Devices | ||
| SpectraMax Plus 384 Absorbance Microplate Reader | Molecular Devices | ||
| SYBR Green I | Invitrogen | S7563 | 500 µl |
| Triton X-100 | SIGMA-Aldrich | X100 | 500 mL |
| Trizma base | SIGMA-Aldrich | T1503 | 1 kg |
| Trypsin-EDTA Solution 1X | SIGMA-Aldrich | 59417-C | 100 mL |
References
- Zou, J., Shi, P. Y. Strategies for Zika drug discovery. Current Opinion in Virology. 35, 19-26 (2019).
- Cugola, F. R., et al. The Brazilian Zika virus strain causes birth defects in experimental models. Nature. 534 (7606), 267-271 (2016).
- de Araújo, T. V. B., et al. Association between microcephaly, Zika virus infection, and other risk factors in Brazil: Final report of a case-control study. The Lancet Infectious Diseases. 18 (3), 328-336 (2018).
- Cao-Lormeau, V. -. M., et al. Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. The Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).
- Pielnaa, P., et al. Zika virus-spread, epidemiology, genome, transmission cycle, clinical manifestation, associated challenges, vaccine and antiviral drug development. Virology. 543, 34-42 (2020).
- Bollati, M., et al. Structure and functionality in flavivirus NS-proteins: Perspectives for drug design Flaviviral NS3 protein Flaviviral NS5 protein Protease Helicase Polymerase Methyltransferase Flavivirus protein structure Antivirals VIZIER Consortium. Antiviral Research. 87, 125-148 (2010).
- Fernandes, R. S., et al. Reporter replicons for antiviral drug discovery against positive single-stranded RNA viruses. Viruses. 12 (6), (2020).
- Fernandes, R. S., et al. Discovery of an imidazonaphthyridine and a riminophenazine as potent anti-Zika virus agents through a replicon-based high-throughput screening. Virus Research. 299, 198388 (2021).
- Noske, G. D., et al. Structural characterization and polymorphism analysis of the NS2B-NS3 protease from the 2017 Brazilian circulating strain of Yellow Fever virus. Biochimica et Biophysica Acta – General Subjects. 1864 (4), 129521 (2020).
- Godoy, A. S., et al. Crystal structure of Zika virus NS5 RNA-dependent RNA polymerase. Nature Communications. 8, 14764 (2017).
- Yin, Z., et al. An adenosine nucleoside inhibitor of dengue virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (48), 20435-20439 (2009).
- Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Brecher, M., Zhang, J., Li, H. The flavivirus protease as a target for drug discovery. Virologica Sinica. 28 (6), 326-336 (2013).
- Noble, C. G., Seh, C. C., Chao, A. T., Shi, P. Y. Ligand-bound structures of the dengue virus protease reveal the active conformation. Journal of Virology. 86 (1), 438-446 (2012).
- Chen, X., et al. Mechanisms of activation and inhibition of Zika virus NS2B-NS3 protease. Cell Research. 26 (11), 1260-1263 (2016).
- Eyer, L., Nencka, R., de Clercq, E., Seley-Radtke, K., Růžek, D. Nucleoside analogs as a rich source of antiviral agents active against arthropod-borne flaviviruses. Antiviral Chemistry and Chemotherapy. 26, (2018).
- Xie, X., et al. Zika Virus Replicons for Drug Discovery. EBioMedicine. 12, 156-160 (2016).
- Pan, K. L., Lee, J. C., Sung, H. W., Chang, T. Y., Hsu, J. T. A. Development of NS3/4A protease-based reporter assay suitable for efficiently assessing hepatitis C virus infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (11), 4825-4834 (2009).
- Khumthong, R., Angsuthanasombat, C., Panyim, S., Katzenmeier, G. In Vitro Determination of Dengue Virus Type 2 NS2B-NS3 Protease Activity with Fluorescent Peptide Substrates. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 35 (2), (2002).
- Ulanday, G. E. L., Okamoto, K., Morita, K. Development and utility of an in vitro, fluorescence-based assay for the discovery of novel compounds against dengue 2 viral protease. Tropical Medicine and Health. 44 (1), 1-10 (2016).
- Ong, I. L. H., Yang, K. L. Recent developments in protease activity assays and sensors. Analyst. 142 (11), 1867-1881 (2017).
- Eltahla, A. A., Lackovic, K., Marquis, C., Eden, J. S., White, P. A. A fluorescence-based high-throughput screen to identify small compound inhibitors of the genotype 3a hepatitis c virus RNA polymerase. Journal of Biomolecular Screening. 18 (9), 1027-1034 (2013).
- Eydoux, C., et al. A fluorescence-based high throughput-screening assay for the SARS-CoV RNA synthesis complex. Journal of Virological Methods. 288, 114013 (2021).
- Shimizu, H., et al. Discovery of a small molecule inhibitor targeting dengue virus NS5 RNA-dependent RNA polymerase. PLoS Neglected Tropical Diseases. 13 (11), 1-21 (2019).
- Sáez-Álvarez, Y., Arias, A., del Águila, C., Agudo, R. Development of a fluorescence-based method for the rapid determination of Zika virus polymerase activity and the screening of antiviral drugs. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
- Kocabas, F., Turan, R. D., Aslan, G. S. Fluorometric RdRp assay with self-priming RNA. Virus Genes. 50 (3), 498-504 (2015).
- Niyomrattanakit, P., et al. A fluorescence-based alkaline phosphatase-coupled polymerase assay for identification of inhibitors of dengue virus RNA-Dependent RNA polymerase. Journal of Biomolecular Screening. 16 (2), 201-210 (2011).
- Simeonov, A., Davis, M. I. . Interference with Fluorescence and Absorbance Flow Chart Fluorescence Interferences. (Md). , 1-8 (2016).
- Genick, C. C., et al. Applications of biophysics in high- Throughput screening hit validation. Journal of Biomolecular Screening. 19 (5), 707-714 (2014).
- Smith, T. M., et al. Identifying initiation and elongation inhibitors of dengue virus RNA polymerase in a high-throughput lead-finding campaign. Journal of Biomolecular Screening. 20 (1), 153-163 (2015).
- Porecha, R., Herschlag, D. RNA radiolabeling. Methods in enzymology. 530, 255-279 (2013).
