조직과 소변에서 인간 신장 tubuloids의 생성

참고: 여기에 설명된 실험은 에라스무스 의료 센터 (로테르담, 네덜란드)와 소아 종양학을위한 공주 말시마 센터 (위트레흐트, 네덜란드)의 의료 윤리위원회에 의해 승인되었다. 1. 조직으로부터 인간 신장 관형의 세대 자료 37°C에서 하룻밤 동안 예비다웰 조직 배양 플레이트(6, 12 및 24웰). 1x L-알라닌/L-글루타민 보충제, 1%w/v 4-(2-하이드록세틸)-1-피프라진 에탄에설포닉산(HEPES, 10mM), 1% 페니실린/스트렙토마이신 항생제를 고급 DMEM/FM에 추가하여 기저 배지(AdDF++++)를 준비하십시오. 1.5% B27 보충제, 10% R-척추 조절 배지를 첨가하여 배양 배지를 준비, 표피 성장 인자(50 ng/mL), 섬유아세포 성장 인자-10(100 ng/mL), N-아세틸시스테인(1.25mMM), 로키나제 억제제 Y-27632(10 μM), 광범위한 항생제(0.1 mg/mL), A83-01(5Μd++++A). 사용하기 전에 37 °C로 따뜻하게합니다. 4°C에서 밤새 알리쿼트를 해동하여 지하 멤브레인 추출물(BME)을 준비한다. 절차 중에 BME를 얼음 위에 보관하십시오. 콜라게나아제1mg/mL의 최종 농도인 AdDF+++로 희석하여 콜라게나아제 용액을 준비하여 10μM Y-27632를 추가합니다. 최대 37°C까지 데우실 수 있습니다. 페트리 요리, 메스, 핀셋 10cm를 준비합니다. 20분 동안 자외선 램프를 바르고 소독제, 데미워터, 70% v/v 에탄올로 세척하여 식기를 소독합니다. 기구를 공기 건조시. 수평 셰이커를 37°C로 미리 데우습니다. 절차 AdDF+++ 배지의 30-40 mL로 채워진 50mL 튜브에서 신장 조직을 수집합니다. 10cm 페트리 접시에 중간 크기의 ~ 1 mL에 티슈 조각을 놓습니다. 메스를 사용하여 ~ 1mm3 사이즈의 조각으로 조직을 다진다(도1A). 다진 조직을 집게와 메스를 사용하여 15mL 튜브로 옮기습니다. 페트리 접시에 AdDF++++의 5mL를 추가하고, 세척하고, 10mL 멸균 파이펫으로 매체를 수집합니다. 이러한 모든 내용을 동일한 튜브로 전송합니다. 300 g에서 원심분리기는 실온에서 5 분 동안 ×, 상체를 제거합니다. 15mL 튜브에 콜라게나제 용액 3-4mL를 추가합니다. 튜브를 37°C로 설정된 수평 셰이커와 250rpm의 속도로 이동합니다. 처음 15분 동안 잠복한 후 샘플을 확인하고 튜브를 힘차게 흔들어 줍니다. 현탁액이 균일하고 대부분의 조직이 사라질 때까지 반복하며 최대 잠복 시간 45-60 분(그림 1B). AdDF+++로 튜브를 채우고 튜브 5-10x를 반전하여 섞습니다. 300g에서 원심분리기는 4°C에서 5분 동안 ×, 상부체를 제거한다. 펠릿이 빨간색인 경우 1.2.6단계를 진행합니다. 그렇지 않으면 1.2.8 단계로 이동하십시오. 세포 펠릿 위에 적혈구 리시스 버퍼 1mL(재료 표참조)를 추가합니다. 튜브를 부드럽게 탭하여 펠릿을 다시 놓습니다(파이펫 팁으로 다시 중단하지 마십시오). 실온에서 5분 동안 배양하십시오. AdDF +++로 튜브를 채웁니다. 300g에서 원심분리기는 4°C에서 5분 동안 ×, 상부체를 제거한다. 혈액 세포가 아직도 보이는 경우에, 단계 1.2.6에서 시작하는 절차를 다시 한 번 반복합니다. 그렇지 않으면 1.2.8 단계를 진행하십시오. 조직의 덩어리가 프로토콜의이 시점에서 볼 수 있는 경우, 단계 1.2.8진행. 그렇지 않으면, 1.2.9 단계에서 펠릿 부피의 측정을 진행한다. 튜브에 AdDF++++의 5mL를 추가하고 10mL 멸균 파이펫으로 다시 일시 중지합니다. 50mL 튜브에 놓인 100 μm 나일론 셀 스트레이너를 통해 서스펜션을 필터링합니다. 필터링된 서스펜션을 새로운 15mL 튜브로 전송합니다. 300g에서 원심분리기는 4°C에서 5분 동안 ×, 상부체를 제거한다. 알려진 부피로 설정된 p1000 파이펫을 사용하여 셀 펠릿의 부피를 측정합니다. 기포를 만들지 않고 재중단하기 위해 조심스럽게 피펫 위아래로 피펫. 튜브를 얼음으로 1분 동안 옮기십시오. 펠릿에 70-75% 부피를 추가합니다. p1000 또는 p200 파이펫을 사용하여 재중단, 및 플레이트 15 μL 방울을 예비, 다중 웰 세포 배양 플레이트 (6, 12, 또는 24 우물, 총 도금 부피 (200 μL, 6 웰). 플레이트를 거꾸로 뒤집어 서 플레이트를 37°C(도1C)에서15-20분 동안 인큐베이터에 놓습니다. 미리 따뜻해지는 배양 매체를 추가하고 배양을 검사합니다(도1C,D). 2. 소변에서 인간의 신장 관형의 세대 참고: 소변은 세포에 대 한 적대적인 환경. 소변 샘플이 가능한 한 빨리 처리되는이 프로토콜의 성공적인 실행을 위해 중요합니다, 바람직하게는 배설에서 4 시간 안에. 그 동안, 소변 샘플은 4 °C에 저장해야합니다. 자료 37°C에서 하룻밤 동안 예비다웰 조직 배양 플레이트(6, 12 및 24웰). 세탁 매체 준비: 광범위한 항생제(0.1 mg/mL) 및 10 μM Y-27632로 보충된 AdDF+++. 위에서 설명한 바와 같이 배양 배지를 준비한다. 사용하기 전에 37 °C에서 따뜻하게하십시오. BME 행렬을 준비합니다. 시술 중에 얼음을 유지하십시오. 절차 소변 샘플을 수집하고 50 mL 튜브(그림 2A-I)로균등하게 나눕니다. 각 튜브에 10-20mL의 세탁 매체를 추가합니다. 300g에서 원심분리기는 4°C(도2A-II)에서5분 동안 g로 ×, 주체를 주의 깊게 제거한다. 각 튜브에 10mL의 세탁 매체를 추가합니다. 10mL 멸균 파이펫을 사용하여 펠릿을 조심스럽게 재보페합니다. 원심분리기는 300 x g에서 5분 동안 4°C(도2A-III)에서조심스럽게 상주체를 제거합니다. 펠릿을 다시 중단하고 모든 튜브의 내용을 15mL 튜브로 전송합니다. 튜브를 세탁 매체로 채웁니다. 원심분리기는 300 x g에서 5분 동안 4°C(도2A-IV)에서,상류체를 제거한다. 알려진 부피로 설정된 p1000 파이펫을 사용하여 셀 펠릿의 부피를 측정합니다. 기포를 만들지 않고 재중단하기 위해 조심스럽게 피펫 위아래로 피펫. 튜브를 얼음으로 1분 동안 옮기십시오. 펠릿에 BME의 70-75% 부피를 추가합니다. p1000 또는 p200 파이펫을 사용하여 재중단, 및 플레이트 15 μL 방울을 예비, 다중 웰 세포 배양 플레이트 (6, 12, 또는 24 우물, 총 도금 부피 (200 μL, 6 웰). 37°C에서 15-20분 동안 인큐베이터에서 플레이트를 거꾸로 뒤집습니다. 미리 따뜻해지는 배양 매체를 추가하고 배양을 검사합니다(도2B). 3. 튜블러이드 문화의 확장 참고: 투불로이드 배양은 1:2-1:3의 분할 비율로 대략 1-2 주마다 통과될 수 있습니다. 일반적으로 약 15개의 구절에 대해 줄별 변형을 통해 확장할 수 있습니다. 자료 37°C에서 하룻밤 동안 예비다웰 조직 배양 플레이트(6, 12 및 24웰). 기초 매체(AdDF++++)를 준비하고 시술 중에 얼음 위에 보관하십시오. 이전에 설명한 대로 배양 배지를 준비합니다. 사용하기 전에 최대 37 °C까지 데우습니다. BME 매트릭스를 준비하고 시술 중에 얼음을 유지하십시오. Y-27632를 10 μM의 농도로 첨가하여 트립신 교체제를 준비하십시오. 필터링되지 않은 p10 팁자동 clave. 원심분리기를 4°C로 식힙니다. 절차 우물에 존재하는 매체를 사용하여 p1000 파이펫으로 위아래로 피펫을 하여 튜블러노이드를 함유한 방울을 방해합니다. 팁을 사용하여 우물 바닥을 긁어 바닥에 부착 된 모든 세포를 수집하십시오. 15mL 튜브에서 내용을 수집합니다. AdDF ++++의 10mL를 추가합니다. 원심분리기는 300 x g에서 5분 동안 4°C에서, 상체를 제거한다. 펠릿의 크기에 따라 10 μM Y-27632로 보충된 트립신 교체제를 추가하십시오. 튜룰로이드를 함유한 BME 물방울 200 μL에 트립신 교체 제1mL을 사용하십시오. 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 팁이 있는 p1000 파이펫을 사용하고 1000 μL 팁 위에 필터링되지 않은 멸균 p10 팁을 삽입합니다. 파이펫은 20-30x상하로 오르가노이드를 기계적으로 방해합니다. 현미경아래에서 많은 온전한 오르가노이드가 여전히 튜브에 존재하는지 확인하십시오(그림3A). 이 시점에서 그대로 유기체의 10% 이상이 존재하는 경우, 3.2.3 단계에서 5분 배양에서 3.2.5 단계에서 그대로 유기체에 대한 현미경 관찰까지 다시 한 번 반복한다. 그렇지 않으면 3.2.6 단계를 진행하십시오. AdDF +++로 튜브를 채웁니다. 300× g에서 원심분리기는 4°C에서 5분 동안, 상부체를 제거한다. 알려진 부피로 설정된 p1000 파이펫을 사용하여 셀 펠릿의 부피를 측정합니다. 기포를 만들지 않고 재중단하기 위해 조심스럽게 피펫 위아래로 피펫. 튜브를 얼음으로 1분 동안 옮기십시오. 펠릿에 70-75% 부피를 추가합니다. p1000 또는 p200 파이펫을 사용하여 재중단, 및 플레이트 15 μL 방울을 예비, 다중 웰 세포 배양 플레이트 (6, 12, 또는 24 우물, 총 도금 부피 (200 μL, 6 웰). 플레이트를 거꾸로 뒤집어 서 플레이트를 37°C에서 15-20분 동안 인큐베이터에 놓습니다. 미리 따뜻해지는 배양 매체를 추가하고 배양을 검사합니다(그림3B).