극저온 전자 단층 촬영 데이터 수집 최적화를 위한 전략
Summary
극저온 전자 단층 촬영에서 대규모 데이터 수집에 대한 수요가 증가함에 따라 처리량이 높은 이미지 수집 루틴이 필요합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 지형 데이터 수집의 시간 효율성과 처리량을 최대화하기 위한 고급 인수 전략의 최근 개발을 구현하는 프로토콜입니다.
Abstract
극저온 전자 단층 촬영(cryoET)은 네이티브에 가까운 상태에서 생물학적 샘플의 3D 구조를 연구하는 강력한 방법입니다. 현재 최첨단 극저온ET와 서브토모그램 평균 분석이 결합되어 지형 재구성 내여러 사본에 존재하는 거대 분자 복합체의 고해상도 구조적 측정이 가능합니다. 토모그래피 실험은 일반적으로 중요한 운영 실행 비용을 가진 고급 전송 전자 현미경을 통해 취득할 수 있는 다량의 틸트 시리즈를 요구합니다. 자동화된 데이터 수집 루틴의 처리량과 신뢰성은 최근 몇 년 동안 지속적으로 개선되었지만, 틸트 시리즈를 획득할 관심 영역을 선택하는 프로세스는 쉽게 자동화할 수 없으며 여전히 사용자의 수동 입력에 의존합니다. 따라서 대규모 데이터 수집 세션의 설정은 틸트 시리즈 획득에 사용할 수 있는 남은 현미경 시간을 상당히 줄일 수 있는 시간이 많이 소요되는 절차이다. 여기서 이 프로토콜은 시리얼EM 패키지와 그리드 스크리닝 및 대규모 틸트 시리즈 데이터 수집의 시간 효율성을 크게 향상시키는 PyEM 소프트웨어를 기반으로 최근에 개발된 구현에 대해 설명합니다. 제시된 프로토콜은 시리얼EM 스크립팅 기능을 사용하여 그리드 매핑, 그리드 사각형 매핑 및 틸트 시리즈 수집을 완전히 자동화하는 방법을 보여 줍니다. 또한 이 프로토콜에서는 자동화된 데이터 수집이 시작된 후 PyEM을 사용하여 오프라인 모드에서 추가 획득 대상을 선택하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜을 설명하기 위해 Sars-Cov-2 tilt 시리즈의 고급 데이터 수집 컨텍스트에서 해당 응용 프로그램이 설명되어 있습니다. 제시된 파이프라인은 획득 대상을 신중하게 선택할 필요가 있는 단층 촬영 실험의 시간 효율성을 극대화하고 동시에 대량의 틸트 시리즈를 수집하는 데 특히 적합합니다.
Introduction
극저온 전자 현미경(cryoEM) 방법은 빠른 유리화 후 전염 전자 현미경(TEM)을 통해 생물학적 시료의 이미징을 기반으로 하며, 종업및 수화 상태에서 시편의 분자 및 세포 구조를 보존하는 샘플 준비 과정1,2. 극저온 전자 단층 촬영(cryoET)에서 상체시의 3D 모델은 상이한 방향, 소위 틸트 계열, 토모그래피3의전산 재구성에 이어 동일한 영역의 다수의 이미지를 획득함으로써 달성된다. 이러한 고급 이미징 기술은 본국 세포 환경4,5,6의맥락에서 생물학적 과정의 구조적 조사를 위한 강력한 방법으로 성숙하였다.
생체화 시료의 초구조적 분석 외에도, 지형 부피 내의 여러 부에 존재하는 거대 분자 복합체의 고해상도 재구성은 평균5의서브토모그램을 적용하여 얻을 수 있다. 이러한 재구성 접근법은 관심 구조를 포함하는 하위 볼륨의 반복적 정렬 및 평균을 기반으로 하며 신호 대 잡음 비율 및 최종 재건7,8의해상도를 높이는 것을 목표로 한다. Subtomogram 평균은 번거로운 운영 실행 비용으로 고급 TEM을 통해 수백 개의 틸트 계열의 인수를 요구하는 많은 양의 데이터의 수집 및 처리에 의존합니다.
현재 이러한 자동화 된 cryoET 세션의 설정은 일반적으로 사용자의 수동 입력9,10,11에의존하는 시간이 많이 소요되는 프로세스입니다. 일반적으로 대상은 매핑된 그리드의 육안 검사로 식별되며, 이후에자동화된 데이터 수집을 위해 설정됩니다. 획득 지점을 식별하는 사용자의 효율성은 종종 샘플의 특성에 의해 영향을 받는 경우가 많으며, 최적 농도로 정제된 거대 분자를 분석하거나 혼잡한 세포 환경 내에서 드문 사건의 경우 코르상대적접근법(12)의사용을 암시하는 경우 특히 도전적이다. 또한, 현재 워크플로우는자동화된 획득11,13,14동안 대상의 정확한 현지화 및 중심에 나중에 사용될 다양한 배율에서 설정 하는 동안 이미지를 수집해야 한다. 이러한 고정밀 재정렬 단계는 고해상도 애플리케이션에 매우 중요하며, 이는 이미징이 높은 배율에서 수행되어야 하며, 결과적인 작은 시야 내에서 관심 영역을 유지하기 위한 정확한 센터링 단계가 필요합니다. TEM이 틸트 시리즈 수집에 관여하지 않는 이 시간 소모적인 절차에 대해 각 데이터 수집 세션의 몇 시간이 모두 커밋됩니다. 따라서 필요한 기울기 계열의 양에 따라, 획득 지점의 식별 및 설정은 극저온 세션 동안 데이터 수집에 사용할 수 있는 현미경 시간에 상당한 영향을 미칠 수 있다.
여기에 설명된 것은 시리얼EM 소프트웨어패키지(15)와 최신 버전인 PyEM소프트웨어(16)를 기반으로 그리드 를 매핑하고, 그리드 사각형을 매핑하고, 대상을 선택하고, 대규모 틸트 시리즈 수집을 위한 자동화된 데이터 수집을 설정하는 데 에 대한 최적화된 프로토콜입니다. 이 방법의 핵심 개념은 대상의 정확한 현지화 및 중심을 위해 가상 맵이라고 불리는 각 획득 항목에 대해 PyEM에서 계산적으로 생성된 이미지를 시리얼EM에 제공하는 것입니다. 실제 획득 시간을 얻으려면 대상 선택과 가상 맵 생성은 SerialEM의 두 번째 더미 인스턴스를 사용하여 오프라인으로 수행되어 TEM 운영에서 획득 대상의 선택 프로세스를 분리합니다. 데이터 품질13,17 또는 틸트 시리즈 획득속도(18,19)를높이는 방법을 다루지는 않지만, 이 프로토콜은 주로 대규모 자동 cryoET 세션 설정의 시간 효율성을 최적화하기 위한 전략에 초점을 맞추고 있습니다. 따라서, 제시된 프로토콜의 구현은 틸트 시리즈 수집에 사용할 수 있는 현미경 시간을 증가시킴으로써 자동화된 데이터 수집의 수율을 극대화하고자 하는 cryoET 데이터 수집 워크플로우를 확립하는 과학자들을 위한 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
틈새 기술에서, cryoET는 지금 전례없는 도달 해상도와 세포 및 분자 수준에서 구조적 연구를 수행하는 광범위한 방법으로 성숙했다21,22. 극저온이미징에 대한 수요가 계속 증가함에 따라 이 기술에 액세스할 수 있는 제한된 리소스에 부담을 주고 있습니다. 다수의 국가 냉동 고엠 시설을 개설하고 전 세계 커뮤니티의 요구를 지원하기 위한 TEM 용량을 늘리기 위한 과학 기관의 노력에도 불구하고, 냉동EM 계측기에 대한 접근은 여전히 제한되어 있으며, 따라서 사용자가 각 현미경 세션의 수율을 극대화하기 위해 데이터 수집에 사용할 수 있는 시간을 효율적으로 사용해야 합니다. 데이터 품질을 손상시키지 않으면서 더 나은 처리량을 달성하기 위해 새로운 이미지 수집 루틴을 요구한 데이터 수집에 사용할 수 있는 제한된 시간과 결합된 수백 개의 틸트 시리즈를 획득해야 합니다. 최근 하드웨어 및 이미징 워크플로우의 개발로 기울기 시리즈 획득 속도가18,19로상당히 증가하여 실제 틸트 시리즈 획득에 필요한 획득 지점과 시간을 설정하는 데 소요되는 시간 간의 비율이 급격히 변화하게 되었습니다. 모두, 획득 지점을 설정하는 절차는 cryoET 세션의 달성 가능한 처리량에 대한 주요 병목 현상 중 하나가되고있다.
여기에 제시된 최적화된 프로토콜을 통해 우리는 냉동 온수 세션 첫날에 자동화된 지형 수집을 위한 171개의 위치를 오프라인 모드로 설정하고 현미경이 다른 작업(예: 제곱 매핑, 튜닝 및 자동 틸트 시리즈 수집)에 적극적으로 관여하여 데이터 수집에 사용할 수 있는 현미경 시간에 영향을 미치지 않도록 했습니다. 이 파이프라인은 극저온ET 세션의 처리량을 최대화하는 것 외에도 자동화된 데이터 수집 세션의 준비 단계에서 사용자가 투자한 시간을 크게 줄입니다. 설명된 프로토콜에서 사용자는 매핑된 그리드 사각형을 탐색하여 관심 있는 적절한 영역을 식별하고 해당 정보를 연속 EM 네비게이터에 인수 지점으로 추가하라는 메시지가 표시됩니다. 그런 다음 모든 대상은 가상 맵16의생산을 위한 PyEM 도구에 의해 SerialEM 내에서 일괄 처리됩니다. 따라서 제시된 계산 접근 방식은 스테이지 이동, 이미지 수집, 뷰와 미리 보기 사이의 이미징 조건 변경과 관련된 대기 기간을 제거하고 높은 배율의 중심에 있는 동안 이러한 단계의 최종 반복을 제거하여 실제 앵커링 맵을 획득하는 것보다 상당히 빠릅니다. 또한, 각 획득된 이미지가 관심대상(23)에전자 용량의 축적을 유도함에 따라, 대상의 정확한 재조정을 위한 가상 맵의 사용은 실제 틸트 시리즈 획득 전에 극저온ET 세션의 예비 단계에서 도입된 방사선 손상을 감소시킨다. 여기에 설명된 프로토콜은 틸트 시리즈 수집 전에 대상의 재조정을 위해 중간 및 고배율 가상 맵(각각 미리 보기 및 보기)을 모두 사용합니다. 이 절차는 정렬 정확도가 덜 중요할 때 중간 배율 보기를 사용하기 위해 쉽게 수정할 수 있으며, 예를 들어, 궁극적인 목표 정확도가 덜 우려되는 대형 구조물의 경우또는 각 획득점(24)의사용자의 수동 선택을 요구하는 극저온 그리드에 제대로 확산되지 않는 단일 입자 분석 샘플에대해, 25. 마지막으로 더미 시리얼EM 인스턴스의 오프라인 사용에 기반한 접근 방식은 현미경에서 사용자의 물리적 존재의 필요성을 최소화하여 원격 연결을 통해 획득 지점의 설정을 용이하게하여 시설의 운영 조직 측면에서 더 많은 유연성을 가능하게합니다.
cryoET에 대한 기술과 방법의 최근 발전은 자동화 된 데이터 수집 세션의 속도와 신뢰성을 크게 향상했습니다. 그러나 이 방법의 나머지 속도 제한 단계를 해결하기 위해서는 추가 개발이 필요합니다. 특히, 그리드 및 제곱 매핑의 초기 단계는 이제 세션 설정의 주요 병목 현상 중 하나가 되어 현미경 단계 의 움직임과 직접 전자 검출기에 의한 이미지 수집 속도를 높이기 위한 하드웨어 개선의 필요성을 생성하고 있습니다. 또한 대상 식별 프로세스를 완전히 자동화하기 위한 기계 학습 접근 방식의 개발은 사용자의 전문 지식에 의존하는 시간이 많이 소요되는 관심 지역 을 선택하는 사용자의 육안 검사가 필요하지 않습니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 구조 및 전산 생물학 단위와 독일 하이델베르크의 유럽 분자 생물학 연구소와 iNEXT-Discovery (프로젝트 번호 871037)의 전자 현미경 핵심 시설의 지원을 인정합니다. 우리는 시리얼EM 소프트웨어 패키지의 저자, 교수 데이비드 마스트로나데의 우수한 지원에 매우 감사드립니다. 우리는 또한 원고의 비판적 독서에 대한 허먼 펑에게 감사드립니다.
Materials
| Transmission Electron Microscope | Our protocol is only based on computational workflows. The user will only need acess to a TEM of any kind |
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