פרוטוקול הכנה והעברה לדוגמה לקריסטלוגרפיה באורך גל ארוך בוואקום בקו קרן I23 במקור אור יהלום
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להכנת מדגם קריוגני והעברת גבישים לתוך תחנת הקצה ואקום על קו קרן I23 במקור אור יהלום, לניסויים קריסטלוגרפיה באורך גל ארוך רנטגן מקרומולקולרי.
Abstract
קריסטלוגרפיה מקרומולקולרית באורך גל ארוך (MX) מנצלת את תכונות הפיזור החריגות של יסודות, כגון גופרית, זרחן, אשלגן, כלור או סידן, שלעתים קרובות נמצאים באופן טבעי במקרומולקולות. זה מאפשר פתרון מבנה ישיר של חלבונים וחומצות גרעין באמצעות פאזה ניסיונית ללא צורך בתיוג נוסף. כדי לחסל את ספיגת האוויר המשמעותית של צילומי רנטגן במשטר אורך גל זה, ניסויים אלה מבוצעים בסביבת ואקום. Beamline I23 במקור אור יהלום, בריטניה, הוא מכשיר סינכרוטרון הראשון מסוגו, תוכנן ואופטימיזציה לניסויי MX בטווח אורך הגל הארוך לכיוון 5 Å.
כדי לאפשר זאת, כלי ואקום גדול מקיף את כל רכיבי תחנת הקצה של סביבת המדגם. הצורך לשמור על דגימות בטמפרטורות קריוגניות במהלך אחסון ואיסוף נתונים בריק דורש שימוש בבעלי מדגם מוליך תרמית. זה מאפשר הסרת חום יעילה כדי להבטיח קירור מדגם כ 50 K. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את ההליכים המשמשים להכנת מדגם והעברת דגימות לוואקום בקו הקרן I23. הבטחת אחידות בפרקטיקות ובשיטות שכבר נקבעו בקהילת הקריסטלוגרפיה המקרומולקולרית, ניתן לבצע קירור מדגם לטמפרטורת החנקן הנוזלי בכל הגדרת מעבדה המצוידת בכלי MX סטנדרטיים.
אחסון קריוגני והובלה של דגימות דורשים רק ציוד זמין מסחרית סטנדרטית. ציוד מיוחד נדרש להעברת גבישים מקוררים קריוגנית מחנקן נוזלי לתחנת הקצה של ואקום. כלי טיפול בדגימות בהתאמה אישית ומערכת העברה קריוגנית ייעודית (CTS) פותחו בבית. נתוני עקיפה שנאספו על דגימות שהוכנו באמצעות פרוטוקול זה מראים סטטיסטיקות מיזוג מצוינות, המציינות כי איכות הדגימות אינה משתנה במהלך ההליך. זה פותח הזדמנויות ייחודיות עבור MX בוואקום בטווח אורך גל מעבר לקורות סינכרוטרון סטנדרטיות.
Introduction
עקיפה ארוכת-גל של קרני רנטגן משמשת לרתום את תכונות הפיזור החריגות של אטומי אור ספציפיים הנמצאים במקור במקרומולקולות. זה עוזר לפתור את בעיית השלב הקריסטלוגרפי ולאשר באופן חד משמעי את זהותם ומיקומם של אלמנטים כאלה בתוך מקרומולקולות. בעוד בימים הראשונים של קריסטלוגרפיה מקרומולקולרית, מבני דה נובו נפתרו על ידי תחליף איזומורפי מרובים1, עם הופעתם של קרני רנטגן טונה ב סינכרוטרון, phasing ניסיוני המבוסס על אורך גל רב גל ואורך גל יחיד (SAD) טכניקות עקיפה חריגה הפכו לשיטות הדומיננטיות2 . שתי השיטות הסתמכו היסטורית על האיתות איזומורפי או חריג ממתכות כבדות, אשר צריך להיות הציג באופן מלאכותי לתוך הגבישים על ידי התגבשות משותפת או טבילת קריסטל3. גישת הניסוי והטעייה והתוצאה הבלתי צפויה יכולות להפוך את הניסויים האלה לגוזלים זמן מתסכלים. השילוב של סלנו-מתיונין במהלך ביטוי חלבון4 היא דרך אלגנטית מאוד להתגבר על מגבלות אלה ולנצל עקיפה חריגה באורכי גל קצרים, אם כי זה יכול להיות מאתגר מאוד במערכות ביטוי חלבון אוקריוטי.
MX באורך גל ארוך מושך מאוד לקביעת מבנה על ידי ניסויי SAD מקוריים5,6 בשל הנוחות של שימוש בגבישים ישירות מניסוי התגבשות מוצלח ללא טיפול נוסף. בנוסף, גישה לשולי הקליטה של אלמנטים בעלי חשיבות ביולוגית גבוהה, כגון סידן, אשלגן, כלור, גופרית וזרחן, פותחת את ההזדמנות לזהות ישירות את מיקומם של אלמנטים אלה במקרומולקולות7,8,9,10. ברזולוציה בינונית ונמוכה, הקצאת אלמנטים המבוססת על צפיפות אלקטרונים 2Fo-Fc וסביבה כימית יכולה להיות קשה, במיוחד עבור אלמנטים עם מספר דומה של אלקטרונים או יונים קשורים חלש עם תפוסות חלקיות. ניתן לפתור את העמימות הזו על ידי איסוף נתונים מתחת ומעבר לקצה הקליטה של אלמנט העניין והפרשנות של ההבדל החריג בשלבי הדגם המתקבלים Fourier Maps11,12. איתור עמדות אטום גופרית במפות אלה יכול גם לסייע בבניית מודלים למפות צפיפות אלקטרונים ברזולוציה נמוכה13. קצות הספיגה של יסודות אור אלה נצפים באורכי גל בין λ = 3 ו- 6 Å (ראו איור 1, למעלה). טווח אורך גל זה היה הרבה מעבר ליכולות של כל קו קרן MX סינכרוטרון, ופעולה יעילה בטווח זה דורשת התגברות על מספר אתגרים טכניים, כמפורט להלן.
Beamline I23 במקור אור יהלום, בריטניה, הוא מכשיר ייחודי, שתוכנן במיוחד כדי להקל על ניסויי MX באורך גל ארוך, טונה בטווח אורך גל בין λ = 1.13 ו 5.9 Å (טווח אנרגיה בין E = 2.1 ו 11 keV). על ידי הפעלה בסביבה של ואקום גבוה14, ספיגת האוויר ופיזור מסולקים, וכתוצאה מכך משפרים את היעילות של ניסויי עקיפה ואת יחס האות לרעש. תחנת קצה גדולה של ואקום מקיפה את כל הרכיבים של סביבת המדגם, כולל גלאי פילטוס 12M חצי גלילי, גוניומטר רב-צירי, מערכות הצפייה והאיסוף המקוונות, וכן ציוד מותאם אישית להעברת דגימה ואחסון (איור 2). כל ציוד עבר אופטימיזציה כדי להבטיח שניתן יהיה לאסוף את נתוני אורך הגל הארוך באיכות הטובה ביותר. גלאי פילטוס 12M המעוקל יכול לאסוף לזוויות עקיפה של 2θ = ±100°, וכתוצאה מכך נתוני עקיפה ברזולוציה גבוהה מספיק אפילו באורכי הגל הארוכים ביותר (איור 1, למטה). 120 מודולי הגלאי נבחרו במיוחד עבור תאימות אנרגיה נמוכה וכיול עבור מצב רווח אולטרה גבוה נוסף סופקו.
סף הגלאי הנמוך ביותר האפשרי הוא 1.8 keV, מה שמוביל להגברת השפעות הפינה והקצה עבור אנרגיות נמוכות מ-3.6 keV ופגיעה באיכות הנתונים באורכי הגל הארוכים ביותר, במיוחד עבור גבישי פסיפס נמוכים, ניתן לראות. יש לקחת בחשבון את האפקט הזה בשילוב עם הירידה ביעילות הקוונטית של הגלאי15 בעת תכנון ניסוי. הגוניומטר הרב-צירי מאפשר ארגון מחדש של גבישים כדי לאפשר אסטרטגיות איסוף נתונים הממקסמות את האיכות והעוצמה של האות החריג, כמו גם את השלמות של הנתונים החריגים שנאספו. ספיגת הדגימה היא גורם מגביל לניסויים, במיוחד באורכי הגל הארוכים ביותר. תיקוני ספיגה, כפי המיושמים בחבילות תוכנה לעיבוד MX הנפוצות16,17, פועלים היטב לאורכי גל סביב 3 Å. אורכי גל ארוכים יותר ידרשו תיקוני ספיגה אנליטיים המבוססים על שחזורים טומוגרפיים18 או אבלציה בלייזר כדי להסיר חומר שאינו מתפזר ולחתוך את הגבישים לצורות מוגדרות היטב19. זה האחרון גם יסייע בהפחתת הגודל של גבישים גדולים יותר כמו ניסויי עקיפה קרני רנטגן באורכי גל ארוכים יותר יעילים יותר עבור גבישים קטנים יותר14. האתגר של שמירה על דגימות בטמפרטורות קריוגניות במהלך איסוף נתונים מטופל על ידי קירור מוליך, כמו באמצעות התקני זרם גז קר בזרימה פתוחה אינו תואם לסביבת ואקום. לפיכך, חומרים מוליכים תרמית, כגון נחושת, נדרשים לחיבור המדגם לקריוקולר שפופרת דופק. הפינים הסטנדרטיים של SPINE מפלדת אל-חלד המשמשים בכל MX, כמו גם כל תושבות מדגם זמינות מסחרית אחרות, אינן מתאימות ל-MX באורך גל ארוך ואקום בגלל מוליכות תרמית ירודה שלהן.
מחזיקי הדגימה (SHs) עבור MX בוואקום חייבים להיות חלק חיוני מהמסלול התרמי להסרת חום (איור 3A). ככזה, הם מורכבים גוף נחושת מוליך תרמית וסיכה וכוללים שני מאפיינים חשובים: בסיס מגנט חזק כדי להבטיח קישור תרמי נאות לראש הגוניומטר הקר, והר מדגם, עשוי פולימיד, כדי למזער את ספיגת קרני הרנטגן ופיזור20. נעשו מאמצים להבטיח שחוויית המשתמש של קצירת קריסטלים וקירור הבזקים כמעט זהה לזו הקשורה לנוהלי MX סטנדרטיים. מכיוון ש-I23 SHs הייעודיים אינם תואמים ישירות לקורות קרן סינכרוטרון אחרות, מתאם נירוסטה משמש לתאימות עם המטות המגנטיים קוצרי הגבישים וממשקי הגוניומטר הקיימים בקורות קרן MX אחרות (איור 3B). המתאם חשוב גם לשימוש במתקני האוטומציה על קרני יהלום MX אחרים, המבוססים על ראשי אחיזה רובוטיים מסוג ALS21 ופריסות בסיס בסגנון unipuck22, אם וריאציה מדגם דורשת הקרנה מוקדמת מהירה לבחירה של גבישי הדיפרטור הטובים ביותר. ניתן לפרק את פרוטוקול ההכנה והטעינה לדוגמה לשני שלבים:
שלב 1: קצירת גבישים והקפאת הבזק המבוצעים על ידי משתמשים במעבדות שלהם
לאחר הערכת התאמת הפרויקט לאיסוף נתוני I23, מחזיקי מדגם עם לולאות התואמות את גדלי הגביש (שהורכבו מראש עם מתאמים) נשלחים למעבדות משתמשים לקצירת קריסטלים. כדי למנוע נזק, אין להפריד בין SHs ומתאמים ויש להשתמש בהם כיחידה אחת לצורך דיג גבישים עם לולאות בגודל המתאים באמצעות שרביטים מגנטיים סטנדרטיים לקצירת גבישים. כמקובל ב- MX, משימה זו מתבצעת באופן ידני תחת המיקרוסקופ, וגבישים מקוררים מיד בדוואר קצף עם חנקן נוזלי23. בשל חוסר התאמה של כוחות מגנטיים, SHs אינם תואמים כרגע עם unipucks. האחסון והמשלוח מתממשים באמצעות מסרקים (ראו טבלת החומרים), הזמינים למשתמשים על פי בקשה, יחד עם תוספות השולח היבש התואמות (איור 3C). דיסקיות אלה חולקות את אותה צלחת בסיס עם unipucks בשימוש נרחב ולאפשר הקרנה מוקדמת מהירה של דגימות בקורות MX יהלום אחרות. השאלת ציוד זה למשתמשים היא כרגע ההסדר הטוב ביותר, עד שבעלי המדגם בהתאמה אישית יהיו זמינים מסחרית. הובלה לקו הקרן דורשת את השולחים היבשים הסטנדרטיים המשמשים בקהילת MX.
שלב 2: העברת דגימות מקוררות קריו לתחנת הקצה של הוואקום
ברגע שהדגימות מגיעות לקו הקרן, הן מוכנות להעברה לתחנת הקצה של הוואקום. זה כרוך בהסרת SHs מ combipucks והפרדה ממתאמים. החדרת דגימות ביולוגיות לוואקום מתבצעת באופן שגרתי בתחום מיקרוסקופיית הקריו-אלקטרונים. חלק מהמושגים המבוססים היטב הותאמו להעברת מדגם I23. בקיצור, SHs מועברים תחת חנקן נוזלי על בלוקי העברה (איור 3D). בלוקים אלה יש מוליכות תרמית מעולה ומסה תרמית משמעותית, מניעת הגבישים מלהגיע לטמפרטורת מעבר זכוכית כאשר בוואקום. עד ארבעה בלוקים, עם קיבולת של ארבע דגימות כל אחד, נטענים תחת חנקן נוזלי לתוך דיסקית בלוק (איור 3H), המשמשת להעברת דגימות למערכת ההעברה הקריוגנית (CTS) או לאחסון במחדלי חנקן נוזליים בין ניסויים.
מערכת ההעברה הקריוגנית שפותחה ב-Diamond Light Source מורכבת משני תתי-מכלולים, תחנת הדגימה והמעבורת (איור 4A). תחנת הדגימה מורכבת מאמבט חנקן נוזלי לאחסון זמני של גבישי חלבון ויש לה תכונות ספציפיות כדי להבטיח בטיחות ולאפשר חוויה ידידותית למשתמש (איור 5). ה- CTS נשלט על-ידי בקר לוגי הניתן לתכנות באמצעות ממשק מסך מגע ידידותי למשתמש. בתחנה לדוגמה יש דיודות פולטות אור שנבנו להדמיה טובה יותר ומערכת של תנורי חימום הנשלטים בלולאה קרובה כדי להפוך את הייבוש של אמבט החנקן הנוזלי לאוטומטי לאחר העברת הדגימות. יש לו גם מגוון חיישנים כדי להבטיח בטיחות ותפקוד יעיל של המערכת. תחנת הדגימה כוללת חומרה מותאמת אישית כדי לספק ממשק חשמלי אמין לאינטראקציה עם המעבורת לפעולות, כגון שאיבת ואקום גס להעברת דגימה, כמו גם ניטור של רמות החנקן הנוזלי והטמפרטורה בתוך המעבורת.
המעבורת (איור 6) היא מכשיר נייד המשמש לאיסוף בלוק העברה מאמבטיית החנקן הנוזלי Sample Station ולהעברתו בתוך סביבת קריוגנית ואקום לתחנת הקצה. הוא כולל חנקן נוזלי dewar כדי לשמור על הדגימות קר במהלך ההעברה, ניטור רמת הנוזלים dewar, ומגוון של חיישנים לפעולה ובטיחות המשתמש. זרוע ההעברה מצוידת בכונן מגנטי וכוללת חריצים במכונה כדי להנחות את המשתמשים בטעינה ופריקה בטוחה של בלוקי העברה לתחנת הקצה. ההעברה מהמעבורת לכלי הוואקום מתבצעת באמצעות מנעל אוויר. מנעל האוויר הוא ממשק עבור המעבורת בתחנת הקצה המשמשת לפינוי המרחב הבין-מרחבי בין המעבורת לתחנת הקצה, לפני פתיחת שסתומי ואקום המעבורת ותחנות הקצה. רצפי השאיבה והאוורור הם אוטומטיים לחלוטין וניתן להפעילם באמצעות מסך מגע גדול עם ממשק ידידותי למשתמש (איור 4C). הפרוטוקול הנוכחי משמש להעברת גביש תאומטין לתחנת הקצה ואקום לאיסוף נתונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול הנוכחי פותח כדי לעמוד בדרישות הכנת המדגם לניסויי MX ארוכי גל בוואקום בקו הקרן I23. זה היה בשימוש על קו הקרן בשנה האחרונה ותרם להשלמה מוצלחת של פרויקטים מרובים. כפי שעולה מהתוצאות המוצגות כאן, הפרוטוקול מאפשר העברה בטוחה ואמינה של דגימות לתחנת הקצה של הוואקום תוך שמירה על איכות העקיפה שלהן. זהו היבט חשוב לפעולת קו הקרן והוא ילווה בהכשרת משתמשים פנים אל פנים על ידי צוות beamline. חלק מהצעדים ראויים להדגשה כקריטיים להשלמתו המוצלחת והבטוחה של ההליך: העברת דגימות מבסיסי combipuck לבלוקים מדגם דורש דיוק ותשומת לב כדי למנוע דגימות מזיקות (ראה שלב 2.1.4); ניטור רמת החנקן הנוזלי בכל השלבים חשוב כדי למנוע דגימות להיחשף לאוויר או להיות במגע קרוב לחלקים שאינם מקוררים כראוי (2.1.3 ו 2.2.2); המתנה עד לסיום רצף Close (2.2.14), לפני הסרת המעבורת מתחנת הקצה (2.2.15), כדי למנוע השפלה של ואקום תחנת הקצה.
תפיסת הפרוטוקול החלה יחד עם מאמץ הנדסי שמטרתו פיתוח ציוד ייעודי להעברת גבישי חלבון לסביבת הוואקום. המוצרים הסופיים של פרויקט זה היו CTS וכלי הטיפול לדוגמה המשויכים שתוארו לעיל. ה- CTS מהווה שיפור משמעותי על קודמו, Leica EM VCT10014, ומסיר מגבלות מרובות, כגון היעדר מיגון מדגם וסביבת ואקום במהלך ההעברה, הצטברות קרח בתוך אמבט החנקן הנוזלי והיעדר ממשק משתמש אינטואיטיבי ותכונות בטיחות. מאפיינים נוספים של ה-CTS שמשפרים את חוויית המשתמש הם ניטור טמפרטורה ורמת חנקן נוזלי בתוך תחנת המעבורת והדגימה, אמבט בעל קיבולת גדולה יותר המאכלס ארבעה בלוקים בו זמנית, ולא אחד, ומנגנון בהדרכה עצמית לפעולת המעבורת. ה- CTS משולב באופן מלא במערכת בקרת קו הקרן עם ממשק מסך מגע ידידותי למשתמש ובטיחות ואקום ומכאני משופרת בעת התממשקות עם תחנת הקצה.
Beamline I23 הוא מכשיר סינכרוטרון MX באורך גל ארוך הראשון מסוגו, וככזה, החדרת גבישי חלבון לסביבה עתירת ואקום ואחסון שלהם בטמפרטורות קריוגניות, דרשה מאמצים ניכרים. שיפורים בכלי ההכנה לדוגמה ובפרוטוקול, כמו גם המאמצים לייעל תהליכים, הם מתמשכים. כחלק מתמיכת המשתמשים, צוות Beamline זמין תמיד כדי לסייע בפתרון בעיות. דוגמה לתרחיש אחד כזה תהיה בעיות שפוגעות בשלמות מערכת הוואקום, מה שמוביל לקשיים בהצמדה או הסרה של המעבורת אל / מ- CTS או מנעל האוויר של תחנת הקצה. רמות שונות של בדיקות מבוצעות על בסיס שבועי ויומיומי, והכשרת משתמשים תכסה בדיקות נוספות כדי למנוע כשלים פוטנציאליים, כמו בדיקה חזותית של טבעות O בממשקים שהמעבורת מתחברת אליהם. בעוד שסביבת הוואקום פותחת את ההזדמנות לבצע ניסויי עקיפה בטווח אורך גל שאינו נגיש בקורות אחרות, שלב ההעברה הנוסף מפחית את תפוקת הדגימה הכוללת.
ההעברה הידנית עם ארבע דגימות בלבד לכל בלוק העברה ועד חמישה בלוקים בתוך כלי הוואקום מגבילה את הקיבולת הכוללת ל -20 דגימות. לפיכך, עבור פרויקטים עם מדגם גדול כדי לדגום שונות, דגימות צריך להיות מוקרן מראש על beamlines תפוקה גבוהה יהלום, ולאחר מכן רק את הדגימות המבטיחות ביותר צריך להיות מועבר לניסוי אורך גל ארוך אופטימיזציה לאחר מכן. בעוד שמחזיקי המדגם ובלוקי ההעברה אינם משתנים מההקדמה הראשונית שלהם לפני מספר שנים, כלי הטיפול המוצגים כאן הם כל ההתפתחויות החדשות. מחזיקי הדגימה הייעודיים של I23 אינם ניתנים לשינוי בשל תפקידם בקונספט הקירור של קו הקרן. ככזה, העיצוב של כלי הטיפול בדגימות נועד ליצור קשר בין סוג חדש זה של מחזיק וכלים מסחריים סטנדרטיים הזמינים מסחרית שקהילת המשתמשים של MX אימצה במשך זמן רב, כגון combipucks, שרביט קצירת קריסטלים, ומערכת הובלת השולח היבש. העיצוב שלהם כלל התייעצות משמעותית עם קהילת המשתמשים ונדרש מספר איטרציות כדי להשלים. הציוד, הכלים והפרוטוקול המוצגים כאן מייצגים מערכת פשוטה וחזקה להעברת דגימות משתמשים לניסויים בקו הקרן I23 במקור אור יהלום. מכשיר זה לקריסטלוגרפיה מקרומולקולרית באורך גל ארוך פותח הזדמנויות חדשות לביולוגיה מבנית.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לאדם טיילור, אדם פרסקוט, קן ג’ונס, ארווינדר פלאהה וקווין וילקינסון על תמיכתם בפיתוח מערכת העברת הדגמים הקריוגנית (CTS). עבודה זו מומנה על ידי iNEXT-Discovery (גרנט 871037) במימון תוכנית Horizon 2020 של הנציבות האירופית.
Materials
| 12M detector | Dectris, Switzerland | single-photon-counting X-ray detector | |
| CombiPuck | MiTeGen | SKU: M-CBP-P1 | Cryopucks used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples |
| Crystal-harvesting magnetic wand | Molecular Dimensions | MD7-411 | Used for harvesting crystal |
| Dry Shipper (CX100) | Molecular Dimensions | MD7-21 | Used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples |
| Dry shipper insert (CombiPuck Transport Cane) | MiTeGen | SKU: M-CBP-PTC1 | Used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples |
| Kapton polyimide | sample mount made of Kapton polyimide | ||
| Perpsex lid | acrylic lid with built-in rotation key | ||
| Thaumatin powder | Sigma-Aldrich | T7638 | Used for production of thaumatin crystals by vapour diffusion |
References
- Green, D. W., Ingram, V. M., Perutz, M. F. The structure of haemoglobin – IV. Sign determination by the isomorphous replacement method. Proceedings of the Royal Society of London. Series A. Mathematical and Physical Sciences. 225 (1162), 287 (1954).
- Hendrickson, W. A. Anomalous diffraction in crystallographic phase evaluation. Quarterly Reviews of Biophysics. 47 (1), 49-93 (2014).
- Pike, A. C., Garman, E. F., Krojer, T., von Delft, F., Carpenter, E. P. An overview of heavy-atom derivatization of protein crystals. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (3), 303-318 (2016).
- Hendrickson, W. A., Horton, J. R., LeMaster, D. M. Selenomethionyl proteins produced for analysis by multiwavelength anomalous diffraction (MAD): A vehicle for direct determination of three-dimensional structure. The EMBO Journal. 9 (5), 1665-1672 (1990).
- Liu, Q., Hendrickson, W. A., Wlodawer, A., Dauter, Z., Jaskolski, M. Contemporary use of anomalous diffraction in biomolecular structure analysis. Protein Crystallography. Methods in Molecular Biology. 1607, 377-399 (2017).
- Rose, J. P., Wang, B. C., Weiss, M. S. Native SAD is maturing. IUCrJ. 2 (4), 431-440 (2015).
- Rozov, A. Importance of potassium ions for ribosome structure and function revealed by long-wavelength X-ray diffraction. Nature Communications. 10 (1), 2519 (2019).
- Rocchio, S., et al. Identifying dynamic, partially occupied residues using anomalous scattering. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75 (12), 1084-1095 (2019).
- Langan, P. S., et al. Anomalous X-ray diffraction studies of ion transport in K+ channels. Nature Communications. 9 (1), 4540 (2018).
- Lolicato, M., et al. K2p channel C-type gating involves asymmetric selectivity filter order-disorder transitions. Science Advances. 6 (44), (2020).
- Thorn, A., Sheldrick, G. M. ANODE: anomalous and heavy-atom density calculation. Journal of Applied Crystallography. 44 (6), 1285-1287 (2011).
- Handing, K. B., Niedzialkowska, E., Shabalin, I. G., Kuhn, M. L., Zheng, H., Minor, W. Characterizing metal-binding sites in proteins with X-ray crystallography. Nature Protocols. 13 (5), 1062-1090 (2018).
- Jungnickel, K. E. J., Parker, J. L., Newstead, S. Structural basis for amino acid transport by the CAT family of SLC7 transporters. Nature Communications. 9 (1), 550 (2018).
- Wagner, A., Duman, R., Henderson, K., Mykhaylyk, V. In-vacuum long-wavelength macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (3), 430-439 (2016).
- Wernecke, J., Gollwitzer, C., Müller, P., Krumrey, M. Characterization of an in-vacuum PILATUS 1M detector. Journal of Synchrotron Radiation. 21 (3), 529-536 (2014).
- Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
- Winter, G., et al. DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (2), 85-97 (2018).
- Brockhauser, S., Di Michiel, M., Mcgeehan, J. E., Mccarthy, A. A., Ravelli, R. B. G. X-ray tomographic reconstruction of macromolecular samples. Journal of Applied Crystallography. 41 (6), 1057-1066 (2008).
- Kitano, H., et al. Processing of membrane protein crystal using ultraviolet laser irradiation. Journal of Bioscience and Bioengineering. 100 (1), 50-53 (2005).
- Mykhaylyk, V., Wagner, A. Towards long-wavelength protein crystallography: Keeping a protein crystal frozen in vacuum. Journal of Physics: Conference Series. 425 (1), 012010 (2013).
- Snell, G., et al. Automated sample mounting and alignment system for biological crystallography at a synchrotron source. Structure. 12 (4), 537-545 (2004).
- . The universal container project Available from: https://smb.slac.stanford.edu/robosync/Universal_Puck/ (2020)
- Teng, T. Y., et al. Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a freestanding thin-film. Journal of Applied Crystallography. 23, 387-391 (1990).
- Esposito, D., et al. Structural basis for the glycosyltransferase activity of the salmonella effector SseK3. Journal of Biological Chemistry. 293 (14), 5064-5078 (2018).
- O’Donnell, J. P., et al. The architecture of EMC reveals a path for membrane protein insertion. eLife. 9, 57887 (2020).
- Mishra, A. K., et al. Structure and characterization of crimean-congo hemorrhagic fever virus GP38. Journal of Virology. 94 (8), 02005-02019 (2020).
- Rudolf, A. F., et al. The morphogen sonic hedgehog inhibits its receptor patched by a pincer grasp mechanism. Nature Chemical Biology. 15 (10), 975-982 (2019).
- El Omari, K., et al. Pushing the limits of sulfur sad phasing: De novo structure solution of the n-terminal domain of the ectodomain of hcv e1. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 70 (8), 2197-2203 (2014).
- Winter, G. XIA2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction. Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).
- Cowtan, K. The Buccaneer software for automated model building. 1. Tracing protein chains. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 62 (9), 1002-1011 (2006).
- Skubak, P., Pannu, N. S. Automatic protein structure solution from weak X-ray data. Nature Communications. 4 (1), 2777 (2013).
