Präparation von Lamellen aus glasartigen biologischen Proben mit einem Zweistrahl-Rasterelektronenmikroskop für die Kryo-Elektronentomographie

Vorbereitung von P. falciparum schizonts für das EinfrierenCompound-2- und E64-Inhibitoren werden verwendet, um Schizonten in verschiedenen Stadien des Ausstiegs aufzuhalten, wodurch eine angereicherte Population von Schizonten für nachfolgende Studien generiert wird. Dies ist wichtig, da ohne eine komplementäre korrelative Technik das Fräsen spezifischer subzellulärer Ziele oder Zelltypen eine Herausforderung darstellt, da der Prozess im Wesentlichen blind ist. Verbindung 2 ist ein Proteinkinase-Inhibitor, der den Austritt vor der Vakuolenruptur aufhält. Schizonten können 4 h lang mit Verbindung 2 synchronisiert und dann mit verbindungs-2-freien Medien gewaschen werden, um den Inhibitor zu entfernen, woraufhin die Schizonten reifen und nach ca. 30 Minuten austreten. Alternativ können Compound-2-synchronisierte Schizonten in E64, einen irreversiblen Breitspektrum-Cystein-Protease-Inhibitor, gespült und etwa 1 h lang inkubiert werden, um den Austritt nach dem Punkt der Vakuolenruptur, aber vor der Ruptur der Wirtszelle zu stoppen. Die Morphologie und Homogenität der behandelten Schizonten sollte vor dem Einfrieren durch Giemsa-gefärbte Blutausstriche überprüft werden (Abbildung 1). Schizonts können in beiden Zuständen mit der in dieser Publikation beschriebenen Methode eingefroren werden. Abbildung 1: Die Morphologie von Verbindung 2 und E64-gestallten P. falciparum schizonts durch Giemsa-gefärbte Blutausstriche. (A) In Gegenwart von Verbindung 2 ist die parasitophore Vakuole (PV) dicht gepackt mit Merozoiten (violette Kreise) mit einer einzigen Ansammlung von Hämozoinkristallen (dunkelbrauner Kreis). Die Grenze zwischen dem PV und dem umgebenden Hämoglobin in den roten Blutkörperchen des Wirts (hRBC) (graues Band) ist gut definiert, ebenso wie die hRBC-Membran. (B) In Gegenwart von E64 wird die PV-Membran gerissen und die Merozoiten verteilen sich innerhalb des hRBC. Jeder Schizont enthält immer noch eine einzelne Ansammlung von Hämozoinkristallen. Die Wirtszellmembran ist undicht und teilweise kollabiert, daher ist in der Zellperipherie kein Hämoglobin sichtbar und die Grenze der hRBC-Membran ist nicht leicht sichtbar. Maßstabsbalken, 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Optimierung des TauchfrostensWährend der Optimierung der Blotting-Bedingungen für P. falciparum-infizierte rote Blutkörperchen wurde eine Reihe von Gittern mit unterschiedlichen Lochgrößen getestet, darunter 2/2, 3/3, 3,5/1 und 5/2 (quadratischer) löchriger Kohlenstoff auf Gold- und Kupfergittern mit 200 Maschen. 200-Maschen-Kupfer-Suchergitter mit 2/4 löchrigem Kohlenstofffilm bieten eine entsprechend dicke Zellschicht zum Fräsen langer Glaskörperlamellen. Größere oder kleinere Löcher führten in der Regel zu zu dünnen bzw. zu dicken Zellschichten (Abbildung 2A-C). Bei 2/4 löchrigem Kohlenstoff werden Schizonten durch die 2-μm-Löcher gezogen, indem das Gitter von hinten (Nicht-Kohlenstoff-Seite) abgetupft wird, was dazu führt, dass Zellen über und unter dem Kohlenstofffilm herausragen. Die 4 μm lange Kohlenstoffstrecke zwischen den Löchern führt zu einem Kohlenstoffstreifen, der durch die Mitte der meisten der resultierenden Lamellen verläuft und die Festigkeit erhöht. Suchergitter eignen sich am besten für Korrelations- und Rasterzwecke44, aber es muss darauf geachtet werden, dass die Zahlen/Buchstaben im Netzdesign nicht zu groß sind, da dies Bereiche zum Fräsen blockiert. Die Löschzeit auf einem manuellen Kolben beträgt ungefähr 20 s, aber der genaue Punkt, an dem das Ablöschen gestoppt werden sollte, wurde mit dem Auge beurteilt, wenn sich der Flüssigkeitstropfen, der aus dem Gitter gezogen wurde, nicht mehr auf dem Filterpapier ausbreitete. Eine gerissene Kante war erforderlich, um die Oberflächenspannung des Tropfens zu brechen und den Blotting-Prozess zu starten. Ein automatisierter Gefrierschrank wurde in dieser Studie nicht verwendet, aber ein vernünftiger Ausgangspunkt für diese Probe wäre, das gleiche Volumen an Zellen und den gleichen Gittertyp wie für einen manuellen Kolben zu verwenden, wobei darauf zu achten ist, dass die Gitter bei hoher Luftfeuchtigkeit (~70 %) und Umgebungstemperatur (~25 °C) von hinten abgetupft werden. Die Blotting-Zeiten und -Bedingungen müssten für das jeweilige automatisierte System optimiert werden. Gefrorene Gitter von P. falciparum schizonts wurden nicht mit TEM, sondern mit einem Lichtmikroskop untersucht, das mit einem Kryotisch ausgestattet war, da die Probe nicht auf Elektronen übertragbar war. Bei dünneren Proben können die Gitter vor dem Probentransfer in das KryoFIB-REM mittels TEM (Gesamtgitteratlas bei ~150-facher Vergrößerung) gescreent werden, was eine Voraussetzung für den Zugang zu einer nationalen Einrichtung sein kann. Besonderes Augenmerk sollte auf den Gradienten der Eisdicke über das Gitter und auch innerhalb einzelner Gitterquadrate gelegt werden. Gute Gitterquadrate sollten eine Zelle dick sein oder den Kohlenstofffilm in ihrer Mitte treffen (Abbildung 2C). Dadurch wird vermieden, dass das dickere Eis gegen die Gitterstäbe am Rand des Gitterquadrats gefräst wird, und es wird sichergestellt, dass der Ionenstrahl ober- und unterhalb der Zellschicht durchbricht, wodurch eine freie Lamelle anstelle eines Keils entsteht. Sobald die reproduzierbaren Blotting- und Tauchfrostbedingungen optimiert sind, ist eine Siebung vor dem FIB-Fräsen in der Regel nicht mehr erforderlich. Abbildung 2. Analyse der Zellverteilung auf Gittern von tiefgefrorenen P. falciparum schizonts mittels Kryo-Lichtmikroskopie. (A) Ein Beispiel dafür, dass Eis in einem Gitterquadrat durch Kryolichtmikroskopie zu dick ist und die Zellen und den Kohlenstofffilm verdeckt. Maßstabsbalken, 10 μm. (B) Ein Beispiel dafür, dass die Lochgröße (300-Maschen-Kupfergitter mit 5/2 quadratisch löchrigem Kohlenstofffilm) zu groß für die Zellen ist, was zu einer sehr dünnen Schicht biologischen Materials führt, die von leeren Regionen ohne Eis umgeben ist. Solche Gitter erzeugen sehr kurze, instabile Lamellen. Maßstabsbalken, 10 μm. (C) Ein Beispiel für eine gute Zellverteilung auf einem 200-Mesh-Kupfergitter mit 2/4 löchrigem Kohlenstofffilm. Diese Schizonten wurden mit E64-Inhibitoren behandelt. Die großen Zellen (roter Kasten, ~5 μm Durchmesser) mit einer gut definierten Peripherie sind infizierte rote Blutkörperchen, die noch eine intakte Vakuolenmembran haben. Die Ansammlungen kleiner Zellen (blauer Kasten, ~1 μm) sind die einzelnen Merozoiten, die in einem teilweise kollabierten roten Blutkörperchen des Wirts enthalten sind. Jeder Schizont hat einen schwarzen Fleck in der Mitte, der die Position der Hämozoinkristalle anzeigt (siehe Abbildung 1 für weitere Details). Der Unterschied in der Zellmorphologie ist nicht so leicht zu erkennen, wenn man sich einmal im KryoFIB-REM befindet. Daher ist ein Vorscreening mittels Kryo-Lichtmikroskopie von Vorteil, bis reproduzierbare Blotting-Bedingungen erreicht sind. Die Zellenabdeckung an den Rändern des Rasterquadrats neben den Rasterbalken (weiß gestrichelte Bereiche) ist zu dick zum Fräsen. Der dünnere Bereich in der Mitte des Gitterquadrats (gelb gestrichelter Bereich) ist ein idealer Ort, um von dort aus zu fräsen, wodurch die Lamelle in die umgebende Zellschicht verlängert wird. Maßstabsbalken, 6 μm. (D) Abbildung eines KryoFIB-spezifischen Autogrid-Randes mit zwei schwarzen Markierungen, eine innerhalb des Cutaway-Abschnitts (schwarze Klammer) und die andere gegenüber, bei 12 Uhr und 6 Uhr. Der schwarze Pfeil stellt die Fräsrichtung dar. (E) Wenn die Gitter in die Autoloader-Kassette geladen werden, müssen die Markierungen auf beiden Seiten der Ladepinzette gleich weit voneinander entfernt sein, was dazu führt, dass die Lamellen senkrecht zur Neigungsachse des Tisches liegen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Markierung von KryoFIB-spezifischen Autogrid-Rändern für die TomographieIn der Regel werden die Gitter vor dem Fräsen in die Autogrid-Felgen geklipst, um die Handhabung zu erleichtern und die Steifigkeit zu erhöhen, die die Lamellen vor Beschädigungen während der nachfolgenden Transferschritte schützt. CryoFIB-spezifische Autogrid-Felgen wurden mit einer Cutaway-Funktion ausgestattet, um beim Fräsen einen größeren Zugang zur Gitterfläche zu ermöglichen. Es ist wichtig, die Fräsrichtung senkrecht zur Kippachse des TEM so auszurichten, dass die Erfassung der Neigungsreihe durch Drehen der Lamelle entlang ihrer Länge erfolgt. Dadurch wird sichergestellt, dass die hohen Wände des Grabens, der die Lamelle umgibt, die biologischen Informationen nicht verdecken, wenn das Gitter gekippt wird. In der Regel ist der Autogrid-Rand markiert, um die visuelle Ausrichtung innerhalb des CryoFIB-REM-Shuttles und später beim Laden des TEM zu erleichtern. Für diese Proben wurden zwei Markierungen bei 12 Uhr und 6 Uhr mit einer unauslöschlichen Markierung angebracht (siehe Materialtabelle), eine in der Mitte des Ausschnitts des Cliprings und die zweite direkt gegenüber (Abbildung 2D). Beim Laden in das TEM (siehe Materialtabelle) sollten beide Markierungen auf beiden Seiten der Ladepinzette sichtbar sein und 90° zum Rand der Pinzette ausgerichtet sein (Abbildung 2E). Es ist zu beachten, dass der Hersteller empfiehlt, die Raster anhand der eingravierten Punkte auf den Autogrid-Rändern auszurichten, da bestimmte Tinten in der Nähe des Ionenstrahls das Fräsen stören können. Beschnittene Gitter können lichtmikroskopisch mit einer modifizierten Kassette für einen Kryotisch gescreent werden, was von Vorteil sein kann, um zu überprüfen, ob der Clipping-Prozess den Kohlenstofffilm des Gitters nicht zerstört hat. Abhängig von der Probenkassette können auch ungeclippte Gitter gefräst werden, jedoch ist bei der Übertragung vom KryoFIB-REM auf das TEM große Vorsicht geboten, um eine Biegung des Gitters zu begrenzen, da dies zu einem Bruch der Lamellen führt. Nicht geclipste Gitter können mit Kryohaltern mit seitlichem Einstieg in das TEM geladen werden, aber es besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass die Lamellen brechen, wenn nach dem Fräsen geclippt wird. Organoplatin-BeschichtungDie Organoplatinbeschichtung erfolgt auf einem oder beiden Gittern, sobald diese in das cryoFIB-REM geladen wurden. Die Nadel des Gasinjektionssystems (GIS) wird in die Kammer über der Probe eingeführt, um einen Strom von Organoplatindampf von einer erhitzten Quelle für eine bestimmte Zeit über die Oberfläche des Gitters zu leiten. Der Dampf kondensiert auf kalten Oberflächen und bildet eine feste Schicht (~2 μm dick). Die Unversehrtheit dieser Beschichtung ist entscheidend, damit gleichmäßig dünne Lamellen gefräst werden können. Die optimalen Anwendungsbedingungen für die Organoplatinbeschichtung werden in der Regel vom Hersteller des Instruments vorgegeben, es können jedoch noch einige Optimierungen erforderlich sein. Die meisten Systeme richten die GIS-Nadel entweder nahe zur Fräsrichtung oder senkrecht zur Fräsrichtung aus, abhängig von der Geometrie der Anschlüsse in der Kammer und den Rotationsgrenzen des Tisches. Verschiedene Einstellungen können ausprobiert werden, indem das Gitter beschichtet, ein kleiner Bereich gefräst, der Tisch gekippt und die Dicke der Beschichtung mit REM gemessen wird. Neben dem Aufbau des CryoFIB-REM selbst können eine Reihe weiterer Faktoren die Anwendung der Organoplatinbeschichtung beeinflussen, darunter 1) die Topographie der Probe, 2) Oberflächenkontamination auf dem Gitter und 3) die Reproduzierbarkeit des Dampfstroms von der GIS-Nadel. Da die GIS-Strömung gerichtet ist, kann eine ungleichmäßige Topografie dazu führen, dass Regionen im Schatten von Zellen oder Oberflächenverunreinigungen unbeschichtet sind oder eine dünnere Beschichtung aufweisen. Dies kann beim Polieren zu einem Kollaps der Organoplatinschicht führen (Abbildung 3). Bei der Auswahl eines zu fräsenden Bereichs ist es notwendig, die umgebende Topografie zu berücksichtigen, z. B. große Oberflächenverunreinigungen, Zellklumpen oder gebrochener Kohlenstoff, die bis zu ein paar Gitterquadrate entfernt aus der Oberfläche des Gitters herausragen, können den Dampffluss blockieren und einen Schatten aus dünnerem Organoplatin erzeugen, der eine Lamelle schwächen kann. Darüber hinaus sollten auch sehr kleine Partikel von Oberflächenverunreinigungen in der Nähe der Vorderkante der Lamelle vermieden werden, da sie beim Fräsen abspringen und eine geschwächte Stelle auf blankem Eis hinterlassen können, die dazu führen kann, dass sich beim Polieren ein Loch in der Lamelle bildet. Wenn das Fräsen begonnen hat und die Organoplatinbeschichtung instabil aussieht, beschichten Sie sie erneut, länger, oder wechseln Sie sie auf ein Reservegitter. Abbildung 3: Eine qualitativ hochwertige Organoplatinbeschichtung ist entscheidend, um dünne, gleichmäßig gefräste Lamellen zu erhalten. (A) Eine Schliffaufnahme der Vorderkante einer Lamelle, bei der die Organoplatinbeschichtung (OP, gelb) zu dünn aufgetragen wurde, was zu einem Loch in der Vorderkante der Lamelle führt, das sich beim Polieren (grüner Kreis) und ungleichmäßigem Fräsen über die gesamte Breite der Lamelle (Schlieren) entwickelt hat. Die Organoplatinoberfläche wurde durch den Ionenstrahl abgeschert, was zu einem Materialspritzer hinter der Vorderkante der Beschichtung führte (gelb gestrichelte Linie). (B) Die Organoplatinschicht (OP) wurde dicker aufgetragen, was zu einer gleichmäßigeren Verdünnung der Lamelle führt. Die Unversehrtheit der Schicht bleibt über die gesamte Breite der Lamelle erhalten und die Grenzfläche zwischen der Organoplatinschicht und dem verglasten biologischen Material ist gut definiert (gelb gestrichelte Linie). Die Carbonschicht verläuft durch die Rückseite der Lamelle (orange). Maßstabsbalken, 1 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Beurteilung der Gitterqualität im cryoFIB-REM und des FräsprozessesSobald die Gitter auf das KryoFIB-REM übertragen wurden, kann die Integrität des Kohlenstofffilms und die Verteilung der Zellen auf den Gittern mit dem REM überprüft werden (Abbildung 4A-C). Eisgradienten, die Positionen von Gitterstäben und die Position von Gitternummern auf Suchergittern können durch REM mit geringer Vergrößerung bei 30 kV überprüft werden (Abbildung 4B), aber die Spannung sollte wieder auf 5 kV reduziert werden, während Fräspositionen mit hoher Vergrößerung lokalisiert und der Fräsprozess überwacht wird, um den Kontrast zur Oberflächentopographie zu erhöhen. Abbildung 4: Beurteilung der Netzqualität und Lokalisierung der zu fräsenden Bereiche im KryoFIB-REM . (A) Ein Überblick über ein Gitter bei 5 kV mit geringer Vergrößerung über das REM. Der Ausschnitt des Autogrid-Rands ist am unteren Rand des Bildes sichtbar. Maßstabsbalken, 0,5 mm. (B) Das gleiche Gitter bei 30 kV mittels REM, das Bereiche mit dickerem Eis (dunklere Gitterquadrate) und dünnerem Eis (hellere Gitterquadrate) zeigt. Der Einschub zeigt den Bereich im Kasten mit Pfeilen, die die Nummerierung auf dem Suchergitter anzeigen, die bei 30 kV sichtbar ist. Maßstabsbalken, 0,5 mm. (C) Eine Übersicht über zwei Gitterquadrate mit mittlerer Vergrößerung, die die Verteilung der Zellen auf dem Kohlenstofffilm und die Position der Gitterbalken bewertet. Maßstabsbalken, 50 μm. (D) Die Anordnung der Fräsmuster für den ersten Schnitt bei hoher Vergrößerung (Ionenstrahlansicht bei 1,5 pA und 30 kV). Der rote Bereich (3 μm dick) wird geschützt, während die gelben Bereiche durch den Ionenstrahl abgetragen werden. Die weiß gestrichelte Linie zeigt die Position der letzten Lamelle an. Maßstabsbalken, 10 μm. (E) Eine stark vergrößerte Ansicht bei 3 kV über das REM einer polierten 200 nm dicken Lamelle (10 μm breit x 15 μm lang). Der Kontrastverlust innerhalb der Lamelle bei 3 kV zeigt an, dass eine geeignete Dicke erreicht wurde. Die hochweiße Vorderkante ist die verbleibende Organoplatinschicht, die vor dem Fräsen über das GIS auf das Raster aufgebracht wird. Maßstabsbalken, 5 μm. (F) Die gleiche Lamelle aus (E) mit dem Ionenstrahl bei 30 kV und 1,5 pA. Die dünne weiße Linie quer über das schwarze Quadrat (weißer Pfeil) ist die verbleibende Organoplatinschicht am vorderen Rand der Lamelle. Maßstabsbalken, 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Ein zu fräsender Bereich wird ausgewählt, indem ein Paar rechteckiger Muster auf beiden Seiten eines geschützten Bereichs mit hoher Vergrößerung (~7.000x für Schizonten) in der Ionenstrahlansicht ausgelegt wird (Abbildung 4D). Es ist wichtig, dass sich keine Partikel der Oberflächenverunreinigung in der Nähe des Mahlbereichs anlagern, da diese das Auftragen der schützenden Organoplatinbeschichtung verdeckt haben könnten. Es ist auch wichtig, dass die Topografie der Region geeignet ist, die Seiten der Lamelle zu stützen, sobald ihre endgültige Dicke erreicht ist. Bei Malaria-Schizonten (Zellgröße: ~5 μm Durchmesser x 2 μm dick, scheibenförmig) können Lamellen zwischen 7-20 μm Breite gefräst werden. Wenn die Zellschicht entsprechend dick ist, werden die Lamellen in der Regel ~10-15 μm lang sein und mehrere Zellen über und unter der Kohlenstoffschicht einfangen (Abbildung 4E-F). Es ist zu erwarten, dass 5-10 Lamellen in einer 8-stündigen Sitzung gefräst werden (6-7 h Fräsen und 1-2 h Polieren). Dies hängt von der Dicke der Probe und der Breite der Lamellen ab, wobei das Fräsen dickerer Proben und breiterer Lamellen länger dauert. Selbst beschädigte Gitter können gefräst werden, da nur eine Handvoll guter Gitterquadrate benötigt werden, um einen Satz von Lamellen zu erzeugen (Abbildung 5A). Wenn die Probe dünner als erwartet ist, z. B. aufgrund von übermäßigem Blotting oder Variation des Hämatokritwerts der Kultur, können kürzere Lamellen relativ schnell gefräst werden. Ihre kürzere Länge schränkt jedoch den Bereich ein, der für die Datenerhebung im TEM zur Verfügung steht (Abbildung 5B). Abbildung 5: Feststellung, wann die endgültige Lamellendicke beim Fräsen erreicht ist. (A) Überblick über ein Gitter mit geringer Vergrößerung durch REM bei 5 kV, das eine Kohlenstoffschädigung während des Clippings zeigt. Die unbeschädigten Bereiche enthielten aufgrund von übermäßigem Blotting sehr dünne Proben; Es war jedoch immer noch möglich, sechs Lamellen auf diesem Gitter (der Bereich innerhalb des weiß gestrichelten Umrisses) in einer ganztägigen Sitzung auf dem cryoFIBSEM zu fräsen. Maßstabsbalken, 0,5 mm. (B) Eine kurze Lamelle (~10 μm breit x 3 μm lang, ohne Organoplatinschicht), die aus diesem Gitter (REM bei 3 kV) erzeugt wurde und immer noch zwei Bereiche bot, aus denen Kippreihen gesammelt werden konnten. Maßstabsbalken, 25 μm. (C) Eine Reihe von REM-Bildern (3 kV) einer Lamelle während des letzten Polierschritts, die zeigen, wie der Kontrast in der Lamelle verloren geht, wenn sie verdünnt wird (von links nach rechts). Die dunkelschwarze Linie in der Mitte der Lamelle ist in allen Bildern ein Streifen Kohlefilm aus dem Raster. Zellen vor dieser Region wurden oberhalb des Kohlenstofffilms und Zellen hinter dieser Region unterhalb des Kohlenstofffilms vitrifiziert. Das Fräsen wurde gestoppt, als die Organoplatinschicht auf der linken Seite der Vorderkante der Lamelle kurz davor war, die strukturelle Integrität zu verlieren. Dieser Haltepunkt war, bevor die gesamte Lamelle auf eine gleichmäßige Dicke gebracht wurde, weshalb sich im hinteren Teil der Lamelle noch etwas kontrastreicheres Material befindet. (D) Ein Beispiel für eine Polierstrecke auf der Grundlage der Lamellen, die auf dem in (A) gezeigten Gitter gefräst sind. Eine Polierroute sollte an den Lamellen beginnen, die näher an der FIB-Quelle liegen, und sich von der FIB-Quelle entfernen, um die erneute Ablagerung von gefrästem Material auf der Oberfläche der Lamellen zu begrenzen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Während des Polierens hängt die endgültige Dicke einer Lamelle von der Struktur der Probe im zu fräsenden Bereich, der Integrität der Organoplatinschicht und der verfügbaren Zeit ab. Idealerweise sollte die Probe verdünnt werden, bis der Kontrast über die gesamte Oberfläche der Lamelle durch REM bei 3 kV verloren geht, was darauf hindeutet, dass sie gleichmäßig elektronentransparent und etwa 150-200 nm dick ist (Abbildung 5C). Es kann jedoch erforderlich sein, das Fräsen vor diesem Zeitpunkt abzubrechen, wenn die Organoplatinschicht ein Loch entwickelt oder sich die Lamelle zu biegen beginnt. In diesem Fall kann die Lamelle vorne noch dünn genug sein und für die Tomographie nützlich bleiben. Umgekehrt ist es möglich, die Kontrastverluststufe zu verdünnen, wenn die Lamelle stabil aussieht, und sie noch dünner zu machen, indem die Fräsmuster näher zusammenrücken (~100 nm oder weniger). Dies hängt davon ab, welche Dicke für den nachgelagerten Workflow erforderlich ist. Ein REM-Bild mit geringer Vergrößerung ist erforderlich, um eine Polierroute zu planen, die näher an der Ionenstrahlquelle beginnt und sich abarbeitet (Abbildung 5D). Die Richtung des Polierweges ist wichtig, um eine erneute Ablagerung von abgetragenem Material auf bereits fertiggestellten Lamellen zu verhindern. Sammeln und Verarbeiten von Tilt-SeriendatenNach dem Laden in das TEM identifiziert eine Vollrastermontage mit geringer Vergrößerung (~150x) die Positionen der Lamellen, die mit dem am Ende des Fräsens aufgenommenen REM-Bild mit geringer Vergrößerung korreliert werden können. Bei eingefrorenen Schizonten ist der größte Teil des Gitters für Elektronen nicht transparent, so dass die Lamellenpositionen als weiße Kerben auf schwarzem Hintergrund erscheinen (Abbildung 6A). Der Winkel der Lamellen in Bezug auf die Neigungsachse des Mikroskops sollte beachtet werden, da mehr als ~10° von der Senkrechten entfernt die Erfassung von Neigungsreihen erschweren könnte. Eine Montage mit mittlerer Vergrößerung (~1.500x) an der Stelle jeder Lamelle gibt einen Überblick über den biologischen Gehalt und prüft auf Übertragungsschäden, kristallines Eis oder übermäßige Oberflächenkontamination (Abbildung 6B-D). Dies sollte auch bei hoher Neigung überprüft werden, um sicherzustellen, dass keine Oberflächenverunreinigungen den Aufnahme- oder Fokusbereich verdecken. Die Wahl einer Erfassungsregion hängt nicht nur von den biologischen Merkmalen ab, sondern auch von der strukturellen Integrität des Eises in der Umgebung, z. B. von der Vermeidung von Rissen, da diese Regionen driften, oder von Bereichen mit übermäßigem Vorhang, in denen eine Lamelle eine variable Dicke aufweist. Vor dem Erfassen einer Neigungsreihe wird eine Vorneigung von ±10° auf das Gitter angewendet, um die Ebene der Lamellen (nicht des Gitters) senkrecht zur optischen Achse zu machen. Die Richtung der Vorneigung kann durch die Position der Vorderkante der Lamellen (auf der Suche nach der übrig gebliebenen Organoplatinschicht) in der Montage mit mittlerer Vergrößerung bestimmt werden. Für das hier verwendete TEM (300 kV Titan Krios) erforderte eine Vorneigung von +10°, wenn die Vorderkanten der Lamellen in der Karte nach oben zeigten, und wenn sie nach unten zeigten, eine Vorneigung von -10°. Jedes Gitter kann aufgrund der Ausrichtung, in der es mit der Pinzette aufgenommen und in den Autoloader eingesetzt wurde, unterschiedlich sein (Schnittabschnitt nach links oder rechts, erzeugt eine 180°-Drehung). Eine letzte Überlegung ist die Pixelgröße. Routinemäßig werden Neigungsreihen um 2,5-7 Å/Pixel erfasst, wobei die Größe des interessierenden Merkmals, die Zielauflösung der resultierenden tomographischen Daten und die Oberfläche der Lamelle, die die Größe des Aufnahmebereichs begrenzen kann, berücksichtigt werden. Es ist möglich, eine kleinere Pixelgröße zu verwenden, um hochauflösende Informationen zu erhalten, und die kleinste, die wir bei diesen Beispielen erfolgreich verwendet haben, ist 1,4 Å/Pixel (Daten nicht gezeigt). Die Drift ist bei einer kleineren Pixelgröße deutlicher und eignet sich nur für dünne (<100 nm) Lamellen, bei denen die Maximierung der Auflösung in der Studie von Bedeutung ist. Abbildung 6: Auswahl zugänglicher Bereiche von Interesse, aus denen Neigungsreihen erfasst werden sollen (A) Ein Ausschnitt aus einer TEM-Karte mit geringer Vergrößerung, der einen Bereich mit Lamellen zeigt, die als sechs weiße Kerben auf schwarzem Hintergrund (rote Pfeile) erscheinen. Bei den weißen Quadraten handelt es sich um gebrochenen Kohlefilm. (B) Eine Karte einer beschädigten und entglasten Lamelle mit mittlerer Vergrößerung. An der Vorderkante der Lamelle (FE) ist die Organoplatinschicht abgebrochen (1). In der Mitte der Lamelle befindet sich ein klarer Fleck aus kristallinem Eis (2). Der Ionenstrahl ist an der hinteren Kante der Lamelle (BE) nicht durchgebrochen, weil das Eis neben den Gitterstäben zu dick ist. Nur ein kleiner Teil der Lamelle ist am BE (3) frei vom umgebenden Eis, wodurch ein Keil entsteht. Die Dicke hat auch dazu geführt, dass Regale über der Lamelle (4) durchtrennt wurden, was höchstwahrscheinlich die Sicht auf die Zellen bei hoher Neigung im TEM versperren wird. (C) Montage einer ganzen Lamelle mit mittlerer Vergrößerung im TEM. Typische Probleme oder Bereiche, die bei der Entnahme von Neigungsreihen von Lamellen vermieden werden sollten, sind Bereiche: mit Oberflächenverunreinigungen (SC), bedeckt durch die Organoplatinschicht (OP, gelb), in der Nähe von Rissen (CR und schwarze Pfeile), mit Vorhängen aufgrund von Dichteänderungen im biologischen Material (CU und Bereich innerhalb blauer Klammern) und Bereiche, die durch Brüche in der Organoplatinschicht geschwächt sind (grüner Kreis). Die einzigen Bereiche, die für die Erfassung von Tilt-Serien zugänglich sind, sind die Bereiche innerhalb der beiden schwarz gestrichelten Kästchen (mit 1 und 2 beschriftet). Die Ansicht muss bei starker Neigung überprüft werden, um sicherzustellen, dass Oberflächenverunreinigungen den interessierenden Bereich oder den Fokusbereich nicht verdecken. (D) Eine Montage mit mittlerer Vergrößerung einer viel saubereren Lamelle, die jedoch immer noch Risse (CR) aufweist, die durch das Ausdünnen der Organoplatinschicht (grüner Kreis) während des Polierens verursacht wurden. Hier wird die interessierende Region durch den innerhalb der Lamellen beobachteten Zelltyp hervorgehoben, in diesem Fall um die einzelnen Merozoiten, die hinter der Kohlenstoffschicht (orange) im hinteren Teil der Lamelle positioniert sind (schwarz gestrichelter Kasten). Maßstabsbalken, 3 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 7: Erfassung von Kryo-ET-Daten von FIB-gefrästen Lamellen. (A) Mikroskopische Aufnahme einer Region einer Lamelle, die ein rotes Blutkörperchen enthält, das kürzlich von einem P. falciparum-Merozoiten befallen wurde. In (B) ist das gleiche Bild mit Anmerkungen versehen, um die Grenze des roten Blutkörperchens (rot), eine Reihe doppelwandiger intrazellulärer Vesikel (violett und blau für die innere bzw. äußere Membran) und des Merozoiten (grün) zu zeigen, der von einer zweiten Membran umgeben ist, die von der Wirtszelle abgeleitet ist (gelb). Ein schwarzes Kästchen zeigt den Bereich, in dem eine Tilt-Serie erfasst wurde. Maßstabsleiste, 500 nm. (C) Ein Durchschnitt von 20 zentralen Schichten, die in der XY-Ebene aus einem 8x Binn-Tomogramm (2,4 Å/Pixel) betrachtet wurden, das am apikalen Ende des Merozoiten und in (D) seiner Annotation aufgenommen wurde und die beiden Membranen zeigt, die die Zelle umgeben (grün und gelb) und vier Membranen, die in der Spitze des Merozoiten (blau) gestapelt sind und mit einem elektronendichten, pilzförmigen Merkmal (lila) verbunden sind. Ein roter Pfeil zeigt die Verbindung der Membranstapel im Scheitelpunkt und das pilzförmige Merkmal (auch in Teil F, i dargestellt) an. Ein schwarzer Pfeil zeigt ein Fusionsereignis zwischen der Merozoiten-Plasmamembran und einem der mehrschichtigen Vesikel innerhalb des Parasiten an (auch in Teil F, ii dargestellt). Die Membran der roten Blutkörperchen des Wirts ist dargestellt (rot) und eine schwarz gestrichelte Linie zeigt die Position eines Querschnitts in der XZ-Ebene, dargestellt in (E). Die Merkmale im Querschnitt (E) sind wie in Teil (D) eingefärbt und beschriftet, wobei farbige Pfeile auf die Membranen zeigen. Ein schwarzer Pfeil zeigt die Position einer Sputterschicht an, die nach dem Fräsen auf die Lamelle aufgetragen wird, und die Dicke der Lamelle ist angegeben. Für Teile (C-E), Maßstabsbalken, 500 nm. (F) Eine detailliertere Ansicht der Merkmale, die durch die roten und schwarzen Pfeilspitzen in Teil (C) angedeutet sind, zeigt die Definition in den Lipiddoppelschichten des Membranstapels in der Spitze des Merozoiten (i) und das Fusionsereignis zwischen dem mehrschichtigen Vesikel und der Merozoiten-Plasmamembran. Maßstabsleiste, 75 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Das Hauptaugenmerk der Arbeit liegt auf der Analyse des Weges des Merozoitenaustritts in P. falciparum Da die in der Studie verwendete Zellpopulation jedoch nie vollständig homogen sein kann, wurden häufig andere Stadien der Zellentwicklung innerhalb der Lamellen beobachtet. Das hier gezeigte Beispiel (Abbildung 7) enthält ein rotes Blutkörperchen, das kürzlich von einem P. falciparum Parasit (Merozoite). Die verwendete Lamelle war 240 nm dick und das Gitter war vor dem Einsetzen in das TEM in einer Argonatmosphäre leicht mit Platin besprüht worden, was zu etwas weniger Kontrast führte, als normalerweise zu erwarten wäre. Die Membran der roten Blutkörperchen konnte in ihrer Gesamtheit um die Zelle herum verfolgt werden. Innerhalb der roten Blutkörperchen befanden sich drei geschlossene membrangebundene Strukturen, zwei Vesikel, die jeweils von einer Doppelmembran und einem glühbirnenförmigen Merkmal (1,2 μm x 0,9 μm an den breitesten Stellen) umgeben waren, was mit einem Merozoiten (Abbildung 7A-B). Der Inhalt der beiden Vesikel schien im Gegensatz zu dem Inhalt der roten Blutkörperchen ähnlich zu sein, was darauf hindeutet, dass diese Vesikel Hämoglobin enthalten könnten. Das Vorhandensein von Vesikeln innerhalb der roten Blutkörperchen des Wirts nach der Invasion wurde bereits früher beobachtet45. Es wird angenommen, dass sie durch die Sekretion von Lipiden und anderen Virulenzfaktoren aus sekretorischen Organellen, den Rhoptrien im Merozoiten, entstehen, die sich während der Invasion in die roten Blutkörperchen des Wirts entladen. Der Merozoite ist von zwei eng miteinander verbundenen Membranen umgeben, von denen die innerste vermutlich die native Plasmamembran des Merozoiten ist, auf der sich keine sichtbare Oberflächenschicht befindet, und die äußerste muss von der Membran der roten Blutkörperchen des Wirts stammen, die den Merozoiten umhüllt, wenn er eindringt. Das Zytoplasma des Merozoiten enthält viele mehrschichtige Vesikel und ein elektronendichtes, pilzförmiges Merkmal, das an einen Stapel von Membranen an der Spitze angrenzt. Eine Tilt-Serie, die über diesen Bereich (2,4 Å/Pixel) aufgenommen wurde, zeigt, dass er einen Stapel von vier Membranen enthält, die mit dem pilzförmigen Merkmal (Abbildung 7C-E). Auffallend ist, dass sich diese Morphologie deutlich von der normalen Anordnung von Organellen und Zellstrukturen am apikalen Ende eines reifen Merozoiten unterscheidet. Um dies zu beurteilen, wurde eine vergleichende Neigungsreihe (2,74 Å/Pixel) über das apikale Ende eines reifen Merozoiten von einem Schizonten erhalten, der vor dem Tauchfrosten und Mahlen mit E64 behandelt worden war (Abbildung 8). Dies zeigt, dass das apikale Ende eines Merozoiten zwei prominente keulenförmige sekretorische Organellen enthält, die Rhoptrien genannt werden, eingebettet in einen Satz von drei polaren Ringen an der apikalen Spitze der Zelle und umgeben von einer Reihe kleinerer sekretorischer Organellen, die Mikroneme genannt werden. Der innerste polare Ring ist an eine Doppelmembranstruktur gebunden, die der Merozoiten-Plasmamembran zugrunde liegt, dem sogenannten inneren Membrankomplex, der Motorproteine enthält, die die Invasion vorantreiben. Es wurde gezeigt, dass während der Invasion der Inhalt der sekretorischen Organellen auf die Merozoitenoberfläche und in die roten Blutkörperchen des Wirts abgegeben wird, was die Anheftung von Merozoiten an die roten Blutkörperchen des Wirts erleichtert und den motorischen Komplex initiiert, der die Invasion antreibt45. Die Daten hier zeigen, dass der Merozoite nach der Invasion keine beobachtbaren Strukturen enthält, die Rhoptrien, Mikronemen oder Polarringen ähneln, was darauf hindeutet, dass sich die Morphologie des apikalen Endes des Merozoiten dramatisch verändert. Die Verschmelzung von Rhoptrien vor der Invasion wurde bereits durch TEM von festen Abschnitten bei Raumtemperatur gezeigt46, was mit der Produktion des pilzförmigen Merkmals übereinstimmt, das wir in unserem Merozoiten nach der Invasion beobachten. Die Membranstapel, die mit diesem Merkmal verbunden sind, wurden bisher nicht beobachtet, und da es keinen Hinweis auf ein IMC im neu eingedrungenen Merozoiten gibt, vermuten wir, dass es sich bei den Membranstapeln um die Überreste der IMC-Maschinerie handeln könnte, die nach Abschluss der Invasion übrig geblieben sind, aber dies muss noch bestätigt werden. Abbildung 8: Das apikale Ende reifer Merozoiten mittels Kryo-ET einer FIB-gefrästen Lamelle und TEM von Kunststoffprofilen. (A) Durchschnittlich 20 zentrale Schichten aus einem 8x Binn-Tomogramm (2,74 Å/Pixel) aus einer 230 nm dicken Lamelle, die die typische Morphologie des apikalen Endes eines reifen Merozoiten zeigen. Die Schizonten wurden vor dem Einfrieren mit E64 behandelt, so dass die PV-Membran gerissen ist und die Merozoiten in den roten Blutkörperchen des Wirts enthalten sind. (B) zeigt das Gleiche wie in (A), jedoch mit Anmerkungen, die die Membran der roten Blutkörperchen des Wirts (RCM, rot), die Merozoiten-Plasmamembran (grün), den inneren Membrankomplex (IMC, lila), die polaren Ringe (PR, schwarz), Mikroneme (M, gelb), die Rhoptrien (R, grau) und die Kernhülle (NE, blau) angeben. Ein benachbarter Merozoite, der sich in diesem Bereich des Tomogramms außerhalb der Ebene befindet, ist durch ein grünes Dreieck gekennzeichnet. Maßstabsleiste, 200 nm. (C) Die zellulären Merkmale, die durch KryoET beobachtet wurden, stimmen mit denen von TEM von Schizonten überein, die in plastischen Schnitten konserviert wurden. Ähnliche zelluläre Merkmale werden in einem reifen Merozoiten aus einem Schizonten angezeigt, der mit Verbindung 2 behandelt wurde und den Austritt vor dem Bruch der PV-Membran verzögert. Maßstabsleiste, 500 nm. (D) Ein kommentiertes Schema eines Merozoiten, das die zellulären Merkmale in Teilen (A-C) zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Dicke des geschützten Bereichs zwischen den rechteckigen Fräsbildern (μm) Nominaler Ionenstrahlstrom (pA) bei 30 kV 3 300 1.5 100 0.75 50 0.3 30 0,2 – 0,06 (Endpolitur) 30* Tabelle 1: Frässtrategie zur Herstellung dünner Lamellen. Das schrittweise Fräsen erfolgt durch Reduzierung des Ionenstrahlstroms entsprechend der Dicke des geschützten Bereichs. Dadurch wird die Erwärmung der Probe begrenzt und eine Entglasung verhindert. *Das Polieren sollte parallel durchgeführt werden, um die Lamellen von beiden Seiten gleichmäßig zu erhitzen und das Risiko zu verringern, dass sie sich verbiegen oder verbiegen, wenn sie ihre endgültige Dicke erreichen. Andere Schritte können nacheinander ausgeführt werden, indem das Muster über der Lamelle und dann unter der Lamelle gefräst wird, bevor zum nächsten Strahlstrom übergegangen wird. Die Vermessung des Gitters zur Lokalisierung von Fräspositionen sollte mit einem Strahlstrom von 1,5 pA durchgeführt werden, um die Erwärmung der Probe zu minimieren. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.