JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物化学

تحضير الصفائح من العينات البيولوجية الزجاجية باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح ثنائي الحزمة للتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد

Published: August 05, 2021
doi:
10.3791/62350
, , , ,
1Centre for Ultrastructural Imaging,New Hunt’s House, Guy’s Campus, King’s College London, 2Department of Biological Science,Birkbeck College, University of London, 3Electron Bio-Imaging Centre,Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus, 4SLAC National Accelerator Laboratory,Stanford University

Summary

استخدام طحن الحزم الأيونية المركزة لإنتاج صفائح زجاجية على الشبكة من العينات البيولوجية المجمدة للتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد.

Abstract

يظهر هنا بروتوكول لتحضير الصفيحات البردية من الشبكات المجمدة من كريات الدم الحمراء البشرية المصابة بالمتصورة المنجلية ، والتي يمكن تكييفها بسهولة مع عينات بيولوجية أخرى. المبادئ الأساسية لإعداد العينات والطحن وعرض الصفائح مشتركة بين جميع الأدوات ويمكن اتباع البروتوكول كدليل عام لإعداد الصفيحة البردية على الشبكة للمجهر الإلكتروني بالتبريد (cryoEM) والتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد (cryoET). يتم تجميد شبكات المجهر الإلكتروني التي تدعم الخلايا في الإيثان السائل المبرد بالنيتروجين باستخدام مجمد غطس يدوي أو آلي ، ثم يتم فحصها على مجهر ضوئي مجهز بمرحلة التبريد. يتم نقل الشبكات المجمدة إلى مجهر إلكتروني ماسح بالتبريد مزود بحزمة أيونية مركزة (cryoFIB-SEM). يتم طلاء الشبكات بشكل روتيني قبل الطحن ، مما يساعد على تشتت تراكم الشحنة أثناء الطحن. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام طبقة دوارة e-beam لتطبيق طبقة من الكربون والبلاتين على الشبكات ، والتي يمكن التحكم في سمكها الدقيق بدقة أكبر. بمجرد دخول cryoFIB-SEM ، يتم تطبيق طلاء إضافي لمركب البلاتين العضوي على سطح الشبكة عبر نظام حقن الغاز (GIS). تحمي هذه الطبقة الحافة الأمامية للصفائح أثناء طحنها ، والتي تعتبر سلامتها أمرا بالغ الأهمية لتحقيق صفائح رقيقة بشكل موحد. يتم تحديد المناطق ذات الأهمية عبر SEM ويتم الطحن بطريقة تدريجية ، مما يقلل من تيار الحزمة الأيونية عندما تصل الصفيحة إلى شفافية الإلكترون ، من أجل تجنب توليد الحرارة الزائدة. ثم يتم نقل شبكة ذات صفائح متعددة إلى مجهر إلكتروني نافذ (TEM) في ظل ظروف مبردة لاكتساب سلسلة الميل. يعد سير العمل القوي والخالي من التلوث لإعداد الصفيحة خطوة أساسية لتقنيات المصب ، بما في ذلك cryoEM الخلوي ، و cryoET ، ومتوسط التصوير المقطعي الفرعي. ويحظى تطوير هذه التقنيات، لا سيما لرفع العينات المجمدة ذات الضغط العالي وطحنها، بأولوية عالية في هذا المجال.

Introduction

يمكن فقط تصوير المحتويات الخلوية للعينات البيولوجية <500 نانومتر بشكل فعال عن طريق المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) في درجات حرارة مبردة ، مما يحد من نطاق العينات للفيروسات وبدائيات النوى والكائنات الحية البسيطة أحادية الخلية والمناطق الرقيقة من الخلايا حقيقية النواةالأكبر 1. يتيح الطحن بالحزمة الأيونية المركزة على الشبكة (FIB) ترقق العينات البيولوجية المجمدة السميكة إلى صفائح شفافة للإلكترون عند درجات حرارة مبردة (< -150 درجة مئوية). ثم يتم نقل الصفائح الناتجة إلى TEM للتصور وجمع البيانات المقطعية ، مما يتيح إعادة بناء ثلاثية الأبعاد عالية الدقة للميزات الخلوية والجزيئية داخل الخلايا (للمراجعات ، انظر Rigort et al. ، 20122 ، Oikonomou et al. ، 20163 ، و Wagner et al. ، 20204).

ظهر طحن FIB من مجال علوم المواد ، حيث يتم تخفيف العينات بشكل روتيني لإعدادها لتحليل المصب5. يتم تنفيذه في مجهر إلكتروني ماسح (SEM) ، والذي يحتوي على عمودين بصريين: بصريات المجهر الإلكتروني الماسح التقليدي وعمود ثان يحتوي على بصريات قادرة على توليد والتحكم بدقة في شعاع أيوني مركز (FIB) – يسمى FIB-SEM. يسمح ذلك باستئصال منطقة معينة من العينة بواسطة الأيونات الناتجة عن مصدر الغاليوم ، وإزالة المواد الزائدة وترك الصفيحة6. تسترشد عملية الطحن بتصوير SEM لتضاريس العينة ، والذي يستخدم لتحديد المناطق ذات الأهمية ومراقبة تقدم الطحن. بالنسبة للتطبيقات البيولوجية ، يكون الإعداد الأساسي هو نفسه إلى حد كبير ، ولكن يتم الطحن في درجات حرارة مبردة. وقد تطلب ذلك تكييف FIB-SEMs القياسية للحصول على مراحل تبريد بالتبريد تحافظ على درجات حرارة ثابتة ومعدلات تلوث سطحية منخفضة ، بالإضافة إلى غرف معادلة الضغط لتسهيل نقل العينات دون انحراف أو تلوث. كما تم تعديل مكوكات العينات للسماح بتركيب مجموعة من الناقلات المختلفة داخل cryoFIB-SEM ، بما في ذلك شبكات TEM والعوالق والشعيرات الدموية. كانت عدة مجموعات رئيسية من الباحثين مركزية في تطوير هذه الأساليب والتقدم التكنولوجي المستمر في هذا المجال7،8،9،10،11،12. أصبحت الحلول التجارية متاحة الآن على نطاق أوسع للطحن البيولوجي FIB في درجة حرارة مبردة وأصبح طحن الصفائح على الشبكة أكثر روتينية ، بالنظر إلى عينة محسنة.

يمكن استخدام مجموعة من تقنيات درجة حرارة الغرفة وتقنيات cryoEM لتصور المعلومات الخلوية عبر جميع مستويات الحياة ، من الكائنات الحية متعددة الخلايا بأكملها بدقة متواضعة إلى فهم سياق العمليات المعقدة على المستوى الخلوي وبمزيد من التفصيل ، إلى تحديد in situ الهياكل الجزيئية13,14,15,16,17,18,19. تشمل تقنيات درجة حرارة الغرفة الكلاسيكية تقسيم الخلايا والأنسجة الثابتة والملطخة والراتنجية المدمجة بواسطة بضع الميكروبات لتحليل التشكل الخلوي بواسطة TEM (للمراجعة ، انظر Studer et al. ، 200820). تم تطوير تقنيات بديلة لاستغلال تشتت الإلكترون الثانوي بواسطة SEM لتصوير سطح كتل الخلايا المحفوظة ، قبل إزالة المواد تدريجيا إما بسكين (تصوير وجه الكتلة التسلسلية) أو حزمة أيونية مركزة21,22,23. كما تم تنفيذ هذه التقنية بنجاح في درجات الحرارة المبردة (يشار إليها باسم التصوير بحجم التبريد) باستخدام cryoFIB-SEM على كتل زجاجية غير ملوثة من الخلايا أو الأنسجة24. بدلا من ذلك ، يمكن طحن الصفائح السميكة (~ 15 ميكرومتر) ودراستها بواسطة تصوير العلوم والتكنولوجيا والهندسة والرياضيات25. باستخدام هذه التقنيات ، يمكن تصوير كتل كاملة تحتوي على العديد من الخلايا لجمع المعلومات السكانية أو يمكن تصوير عضو / كائن حي كامل وإعادة بنائه في 3D. ومع ذلك ، للوصول إلى المعلومات الجزيئية عالية الدقة من الخلايا ، يجب حفظ العينات في حالة شبه أصلية ومجمدة ، وبالتالي ، يجب تحضيرها في ظل ظروف مبردة. الفحص المجهري الإلكتروني بالتبريد للأقسام الزجاجية (CEMOVIS) هو تقنية يتم من خلالها تقسيم كتل المواد البيولوجية المجمدة عالية الضغط تحت ظروف مبردة باستخدام ميكروتوم فائق. ينتج عن ذلك شرائط من مقاطع التبريد (بسمك 40-100 نانومتر)26، والتي يتم توصيلها بشبكة EM ويتم تصويرها في TEM. ومع ذلك ، فإن التفاعل الجسدي للسكين مع العينة الزجاجية يسبب التشقق والضغط الذي يمكن أن يشوه بشدة البنية الخلوية27,28,29,30. المقاطع السميكة أكثر عرضة لهذه القطع الأثرية ، مما يجعل من غير العملي استخدام أقسام أكثر سمكا من ~ 70 نانومتر26. هذا القيد يقيد إلى حد كبير عرض 3D للبنية البيولوجية في التصوير المقطعي. لا يواجه طحن FIB في درجات حرارة مبردة هذه المشاكل ، ولكن له قطع أثرية خاصة به ناتجة عن معدلات الطحن التفاضلية عبر أجزاء من العينة ، مما يؤدي إلى سماكة متغيرة داخل الصفيحة – تسمى الستارة. يتم تخفيف هذه المشكلة عن طريق تطبيق طبقة من البلاتين العضوي يتم تطبيقها عبر نظام حقن الغاز (GIS) ، والذي يحمي الحافة الأمامية للصفيحة أثناء الطحن31. يتم تحديد الحد الأعلى لسمك العينة لطحن FIB على الشبكة من خلال القدرة على الغطس تجميد العينة مع إبقائها زجاجية32، على الرغم من إدخال تقنيات الرفع بالتبريد وناقلات العينات المكيفة للعينات البيولوجية ، يمكن أيضا استخدام طحن FIB لمعالجة العينات المجمدة عالية الضغط31,33,34,35. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن أن تكون العينات المجمدة الغاطسة رقيقة جدا حيث يجب أن يكون هناك ما يكفي من المواد البيولوجية لتوليد صفيحة ذات حجم معقول توفر مساحة سطح كافية لجمع سلسلة الميل عند التكبير المطلوب. يمكن تخفيف هذه المشكلة عن طريق طحن كتل من الخلايا الأصغر ، مثل البكتيريا أو الخميرة. عادة ما تملي سماكة الصفيحة النهائية (~ 100-300 نانومتر) من خلال سلامة العينة واستراتيجية الطحن. تعتبر الصفائح الرقيقة أفضل للعمل الهيكلي عالي الدقة ، مثل متوسط التصوير المقطعي الفرعي ، لكن الصفائح السميكة تحتوي على أحجام خلوية أكبر بكثير مما يمكن تحقيقه بواسطة CEMOVIS ، مما يوفر سياقا خلويا أكثر في عينة قريبة من المحفوظة أصلا. يمكن أيضا استخدام طحن FIB لرقيق بلورات البروتين المجمدة لدراسات حيود الإلكترون36.

يستحق طحن الخلايا الزجاجية FIB الوقت والجهد لتنفيذه إذا كان السؤال العلمي يتطلب تفاصيل جزيئية عالية الدقة للعينات شبه الأصلية في الموقع. مع إمكانية الوصول إلى المزيد من المرافق للإنتاج الروتيني للصفائح ، غالبا ما تكون خطوة تحديد المعدل هي تحسين العينة قبل الطحن ، حيث يجب أخذ الوقت للتأكد من أن العينة زجاجية وسمك مناسب لإنتاج صفائح قوية ورقيقة بشكل موحد. الموصوف هنا هو تحسين العينة لخلايا الدم الحمراء البشرية المجمدة التي تطحن FIB المصابة بطفيليات المتصورة المنجلية ، العامل المسبب للملاريا ، ولكن يمكن تكييف هذا النهج مع أي عينة معينة.

Protocol

تم الحصول على الدم البشري من متبرعين مجهولي الهوية من خلال خدمة الدم وزرع الدم الوطنية في المملكة المتحدة ويستخدم في غضون 2 أسابيع من الاستلام. لا يلزم الحصول على موافقة أخلاقية لاستخدامه. 1. تحضير وتجميد خلايا الدم الحمراء المصابة بالمتصورة المنجلية عزل الفصاميات الناضجة عن طريق الطرد المركزي (1580 × جم) على وسط تدرج كثافة متساوي التوتر بنسبة 70٪ (v / v) (للاطلاع على الإجراءات القياسية لكيفية زراعة مراحل الدم اللاجنسية ل 3D7 Plasmodium falciparum في كريات الدم الحمراء البشرية ، انظر Blackman M.J. ، 199537). ثبت أغشية الدم الرقيقة المجففة بالهواء على شريحة زجاجية تحتوي على ميثانول 100٪ للتحقق من التجانس المورفولوجي للفصام قبل تلطيخها بصبغة Giemsa بنسبة 10٪ في محلول فوسفات 6.7 mM ، درجة الحموضة 7.1.ملاحظة: لإثراء التحضير للشيزونات المتوقفة عند نقاط خروج محددة ، يمكن مزامنة الفصاميات بشكل أكبر مع مثبطات المركب 2 و E64 (انظر النتائج التمثيلية والشكل 1 للحصول على شرح لتأثير هذه المثبطات).تنبيه: المتصورة المنجلية هي أحد مسببات الأمراض البشرية ويجب التعامل معها فقط في منشأة احتواء مناسبة وفقا لإرشادات الصحة والسلامة المحلية. أجهزة طرد مركزي برفق (240 × جم) لتكويرها وإعادة تعليقها في حجم 2x من حبيبات الخلية لوسائط RPMI ، مما ينتج عنه تعليق هيماتوكريت بنسبة 50٪. على جهاز التجميد اليدوي ، قم بتطبيق 2.5 ميكرولتر من schizonts على جانب الكربون من تفريغ التوهج (استخدم إعدادات وحدة تفريغ التوهج 60 ثانية ، 30 مللي أمبير في الهواء ، ومعالجة جانب الكربون من الشبكة فقط) شبكة نحاسية 200 مع فيلم كربون هولي 2/4 وصمة عار ل ~ 20 ثانية من الجزء الخلفي من الشبكة باستخدام ورق ترشيح من الدرجة 1 بحافة ممزقة. الغطس في الإيثان السائل المبرد بالنيتروجين ونقل الشبكات إلى التخزين (انظر جدول المواد للمعدات المستخدمة في هذه الدراسة).ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة مؤقتا هنا ، ويمكن تخزين الشبكات تحت النيتروجين السائل إلى أجل غير مسمى.تنبيه: النيتروجين السائل هو مادة خانقة ويسبب قضمة الصقيع. تعامل بحذر في بيئة مناسبة مع مراقبة الأكسجين.تنبيه: الإيثان السائل يسبب حروقا شديدة وقابل للاشتعال. استخدم في غطاء الدخان بعيدا عن مصادر الاشتعال.ملاحظة: لم تعد الغطس المجمدة قابلة للحياة. تم تحديد ذلك من خلال احتضان دم الإنسان بعدة شبكات ذهبية من شيزونتات الغطس المجمدة المذابة بالهواء وعدم ملاحظة أي نمو للطفيلي بعد عدة أيام ، مقارنة بالضوابط غير المجمدة. وبالتالي ، فإن شبكات schizonts المجمدة آمنة للتعامل معها خارج مرافق الاحتواء باستخدام إجراءات السلامة وإزالة التلوث العادية (القفازات ، تعقيم السطح / الأداة بإيثانول >70٪ والتخلص من الشبكات في >70٪ إيثانول). شبكات الشاشة باستخدام مرحلة التبريد للمجهر الضوئي ، مع إيلاء اهتمام خاص لتدرج الجليد عبر الشبكة. في المناطق الرقيقة من الجليد ، تحقق من مربعات الشبكة الفردية لتغطية الخلية.ملاحظة: يجب أن تكون أفضل المربعات بسمك خلية واحدة في وسط مربع الشبكة (الشكل 2). هذا يضمن إمكانية طحن الصفيحة عبر وسط المربع دون الاصطدام بالجليد السميك عند الحواف مقابل قضبان الشبكة. يمكن إيقاف التجربة مؤقتا هنا ، ويمكن تخزين الشبكات تحت النيتروجين السائل إلى أجل غير مسمى. إذا كانت الخلايا تحمل علامة فلورية ، فيمكن أيضا فحص الشبكات بواسطة cryoCLEM لتحديد مواقع X / Y ذات الأهمية ، والتي يمكن ربطها بمواقع الشبكة في cryoFIB-SEM للطحن المباشر. 2. طحن FIB على الشبكة للخلايا المجمدة الغاطسة ضع علامة على الجزء الأمامي من جنوط autogrid الخاصة ب cryoFIB بقلم تحديد أسود لا يمحى للإشارة إلى مركز القسم المقطوع والجانب الآخر من الحافة (الشكل 3). قم بإعداد محطة القطع وشبكات القصاصات في جانب الكربون الحلقات المحدد لأسفل. قم بتحميل الشبكات في مكوك cryoFIB-SEM (عادة شبكتان ، اعتمادا على المكوك) من جانب الكربون لأعلى وقم بتطبيق طبقة رش بلاتينية في جو من الأرجون (5 × 10-2 ملي بار) (5 مللي أمبير لمدة 60 ثانية – السماكة متغيرة) أو طبقة دوارة من الكربون / البلاتين e-beam (~ 4 نانومتر سمك) على سطح الخلايا.ملاحظة: يساعد كلا النوعين من الطلاءات على تشتت الشحنة أثناء التصوير بالتسويق عبر محرك البحث. تتمثل فائدة الطلاء الدوار e-beam في أنه يمكن تحديد السماكة الدقيقة للطلاء. قم بتحميل المكوك في cryoFIB-SEM وقم بتقييم توزيع الخلايا على كل شبكة بواسطة SEM عند 5 كيلو فولت (13 pA أو 25 pA). ألق نظرة عامة على التكبير المنخفض (~ 100x) لإلقاء نظرة على التدرجات الجليدية عبر الشبكة. بعد ذلك ، التقط صورا عالية التكبير (~ 5000x) لإلقاء نظرة على مربعات الشبكة الفردية وتحديد مناطق الشبكة ذات الميزات الخلوية المرئية والتلوث السطحي المنخفض للمطحنة. ضع طبقة >2 ميكرومتر من البلاتين العضوي على سطح كل شبكة باستخدام نظام حقن الغاز (GIS). للقيام بذلك ، أدخل إبرة GIS في الغرفة أعلى الشبكة وقم بتسخين مصدر البلاتين العضوي إلى درجة حرارة محددة لفترة محددة (على سبيل المثال ، ~ 27 درجة مئوية لمدة 3-10 ثوان) لإنتاج تدفق بخار.ملاحظة: يجب تحسين زاوية التطبيق ودرجة الحرارة وتوقيت طبقة البلاتين العضوي عبر إبرة GIS لزيادة الطلاء المتساوي. سيعتمد هذا على cryoFIB-SEM المحدد المستخدم (انظر النتائج التمثيلية لمزيد من التوضيح). قم بإمالة العينة بحيث يكون مستوى الشبكة ~ 10 درجة من زاوية سقوط الحزمة الأيونية وحرك مركز مربع الشبكة المناسب ليتم رؤيته في كل من صور SEM و FIB. قم بمسح الشبكة باستخدام الحزمة الأيونية عند التيار المنخفض (اسميا 1.5 pA ، 30 kV) وانتقل إلى تكبير عالي بما يكفي (~ 7000x) لتصور الخلايا في مركز مربع الشبكة. ضع العينة في بؤرة التركيز عند تيار الطحن الأول (300 pA) وصحح الاستجماتيزم. اضبط السطوع والتباين ، ثم حدد نمطين مستطيلين للطحن ، أحدهما أعلى والآخر أسفل منطقة محمية بسمك 3 ميكرومتر ، مركزها هو الموقع المطلوب للصفيحة النهائية.ملاحظة: يعتمد العرض المختار للأنماط على تضاريس طبقة الخلية المحيطة وحجم الخلية. 7-20 ميكرومتر هو عرض مناسب للشيزونتات ، لكن الصفائح الأوسع تستغرق وقتا أطول للطحن. يعتمد الارتفاع المختار للأنماط لخطوة الطحن الأولى على سمك العينة ، بدءا من حوالي 6 ميكرومتر ؛ قد يحتاج هذا إلى التعديل أثناء الطحن. يتم الطحن بشكل اتجاهي من الحواف العلوية والسفلية الخارجية للأنماط باتجاه وجه الصفيحة. يمكن القيام بذلك بالتوازي ، حيث يتم طحن كلا النمطين بشكل متزامن أو متسلسل ، أولا إزالة المواد من أعلى الصفيحة ثم من الأسفل. ابدأ الطحن عند التيار الأول ؛ مراقبة التقدم المباشر في عرض الحزمة الأيونية وبشكل متقطع بواسطة SEM (5 كيلو فولت أو 13 أو 25 pA). تأكد من أن الحزمة الأيونية قد اخترقت العينة أعلى وأسفل المنطقة المحمية. إذا لم يكن كذلك ، فقم بزيادة ارتفاع الأنماط المستطيلة لإزالة المزيد من المواد. توقف عندما يكون السطح أعلى وأسفل الصفيحة أملسا تماما في عرض الحزمة الأيونية.ملاحظة: اخترق الشعاع الأيوني العينة أعلى وأسفل المنطقة المحمية عندما لا يحتوي الجزء الداخلي من الأنماط المستطيلة على أي ميزات في المستوى البؤري. قد تكون بعض الميزات، مثل أشرطة الشبكة، مرئية خارج نطاق التركيز في الخلفية. التغيير إلى تيار الطحن التالي (100 pA) ؛ التركيز وضبط السطوع / التباين. قم بتقليل المسافة بين النموذجين المستطيلين إلى 1.5 ميكرومتر وتقليل ارتفاع النموذج لتغطية المادة غير المطحونة فقط. ابدأ الطحن عند التيار الجديد حتى يصبح السطح أعلى وأسفل الصفيحة أملسا تماما. كرر هذه العملية تدريجيا حتى يتم الوصول إلى سمك 0.3 ميكرومتر ، مما يقلل من تيار الحزمة الأيونية في كل مرة وفقا لمخطط الطحن في الجدول 1. قم بطحن عدة صفائح (تعتمد الكمية على سمك العينة والوقت المتاح) على إحدى الشبكتين أو كليهما بسمك 0.3 ميكرومتر ، وسجل موضع X / Y / Z لكل صفيحة واحتفظ ~ 1-2 ساعة في نهاية الجلسة لتلميع الصفائح إلى سمكها النهائي (60-200 نانومتر). خذ نظرة عامة على SEM منخفضة التكبير للشبكة بأكملها وخطط لمسار تلميع يبدأ من الصفائح في مقدمة الشبكة (أقرب إلى مصدر الحزمة الأيونية) إلى الصفائح في الجزء الخلفي من الشبكة (الأبعد عن مصدر الحزمة الأيونية) (الشكل 5).ملاحظة: هذا يقلل من إعادة ترسب المواد المستأصلة مرة أخرى على سطح الصفائح المصقولة. قلل المسافة بين النمطين المستطيلين إلى 100-200 نانومتر وابدأ خطوة التلميع النهائية عند تيار شعاع أيوني يبلغ 30 pA. راقب التقدم بواسطة SEM عند 2-3 كيلو فولت (13 pA ، المسكن = 300 n ، 3072 × 2048 ، ~ 2 ثانية لإطار كامل) وتوقف عن التلميع عندما يتم فقد التباين في الصفيحة بواسطة SEM أو عندما يبدأ معطف البلاتين العضوي للصفائح نفسها في فقدان سلامتها. قبل إزالة الشبكات ، احصل على صورة SEM منخفضة التكبير للشبكة بأكملها واحفظ صورا لكل صفيحة. استخدمها للتحقق من الشبكة لاحقا في TEM. أوقف التجربة مؤقتا هنا وقم بتخزين الشبكات باستخدام الصفائح تحت النيتروجين السائل – تعامل معها بعناية.ملاحظة: يمكن طلاء الشبكات برفق عند إزالتها من cryoFIB-SEM ، مما قد يساعد في الحد من الانجراف والشحن في TEM عند التكبير العالي ، ولكن يجب القيام بذلك بحذر لأن الكثير من طلاء الرش يمكن أن يحجب المحتويات البيولوجية داخل الصفائح. من الممكن فحص الصفائح بحثا عن التألق في هذه المرحلة ؛ ومع ذلك ، فإن الحصول على إشارة كافية يعتمد على وفرة البروتين المسمى داخل سمك الصفيحة. يجب توخي الحذر الشديد في التعامل مع الشبكات للحد من الأضرار التي لحقت الصفائح ومنع تلوث السطح. 3. اقتناء سلسلة الإمالة ونظرة عامة على معالجة البيانات قم بتحميل الشبكات في TEM ، مع محاذاة اتجاه الطحن بشكل عمودي على محور إمالة المرحلة.ملاحظة: تتم محاذاة الشبكات بالعين باستخدام العلامات الموجودة على حافة الشبكة التلقائية. هامش الخطأ ~ 10 درجة مقبول ، وإلا فإن جدران الخندق على جانبي الصفيحة قد تحجب الصفيحة أثناء إمالة الشبكة. الحصول على خريطة منخفضة التكبير (~ 150x) للشبكة بأكملها وتحديد موقع الصفائح ؛ بعد ذلك ، احصل على خريطة تكبير متوسطة (~ 1500x ، اعتمادا على حجم الصفيحة) لكل صفيحة وحدد مناطق الاهتمام. قم بإمالة الشبكة مسبقا بمقدار ±10 درجات لجعل مستوى الصفيحة (وليس الشبكة) عموديا على المحور البصريملاحظة: يمكن تحديد اتجاه الإمالة المسبقة من خلال موضع الحافة الأمامية للصفائح (تبحث عن الطبقة اليسرى فوق البلاتين العضوي) في خرائط التكبير المنخفضة والمتوسطة. بالنسبة ل TEM المستخدم هنا ، تتطلب الشبكات إمالة مسبقة + 10 درجات إذا كانت الحواف الأمامية للصفائح تشير إلى أعلى في الخرائط وتتطلب إمالة مسبقة -10 درجة إذا كانت تشير إلى أسفل. قد تختلف كل شبكة بسبب كيفية التقاطها وإدخالها في أداة التحميل التلقائي. احصل على سلسلة الميل المتماثلللجرعة 38 (على سبيل المثال ، -54 درجة إلى + 54 درجة مع زيادة قدرها 3-5 درجة) بحجم بكسل يسمح بكل من مجال الرؤية والدقة المطلوبة لمنطقة الاهتمام. استخدم نطاقا من قيم إلغاء التركيز البؤري بين -2 و -5 ميكرومتر. اجمع الأفلام التي تحتوي على 3-10 إطارات في كل زيادة ولهذا ، اضبط هذه المعلمات اعتمادا على حجم البكسل لتجميع جرعة إجمالية تبلغ ~ 150 e- / Å2 (ل 300 كيلو فولت TEM).ملاحظة: يجب تجنب التشققات في الصفيحة لأن هذه المناطق قد تنجرف. يجب أيضا تجنب تلوث السطح لأنه قد يحجب منطقة الاهتمام أو منطقة التركيز عند الميل العالي. قم بتصحيح الأفلام باستخدام برنامج مثل MotionCor239. قم بتطبيق مرشح ترجيح الجرعة على الصور المصححة (e-/image المتراكمة)40 وقم بتقدير إلغاء تركيز كل صورة باستخدام برنامج مثلCTFFIND4 41. استخدم المحاذاة غير الإيمانية (تتبع التصحيح) في برنامج مثل etomo (IMOD) 42 لحساب المحاذاة والعلاقة الزاوية للصور في سلسلة الإمالة. أدخل معلومات المحاذاة والتدوير ، جنبا إلى جنب مع قيم إلغاء التركيز في برنامج يمكنه تطبيق تصحيح CTF ثلاثي الأبعاد ، على سبيل المثال ، NovaCTF43. احسب التصوير المقطعي المصحح للحصول على صور مقطعية ناتجة مع عوامل binning ذات الصلة بتحليل المصب. قم بتحليل عمليات إعادة البناء والاستعداد لأي معالجة نهائية ، على سبيل المثال ، التصفية أو التجزئة أو متوسط التصوير المقطعي الفرعي.

Representative Results

تحضير فصاميات المتصورة المنجلية لتجميد الغطستستخدم مثبطات المركب 2 و E64 لإيقاف الفصام في مراحل مختلفة من الخروج ، مما يولد مجموعة غنية من الفصام للدراسة اللاحقة. هذا مهم لأنه بدون تقنية ارتباط تكميلية ، فإن طحن أهداف أو أنواع خلايا فرعية محددة يمثل تحديا لأن العملية عمياء بشكل أساسي. المركب 2 هو مثبط بروتين كيناز يوقف الخروج قبل تمزق الفجوة الفراغية. يمكن مزامنة Schizonts على المركب 2 لمدة 4 ساعات ، ثم غسلها بوسائط خالية من المركب 2 لإزالة المانع ، وعند هذه النقطة سوف تنضج الفصاميات وتخرج بعد حوالي 30 دقيقة. بدلا من ذلك ، يمكن غسل المركب 2 من الفصام المتزامن إلى E64 ، وهو مثبط لإنزيم البروتياز السيستين واسع الطيف لا رجعة فيه ، ويتم تحضينه لمدة 1 ساعة تقريبا لإيقاف الخروج بعد نقطة تمزق الفجوة ، ولكن قبل تمزق الخلية المضيفة. يجب فحص مورفولوجيا وتجانس الفصاميات المعالجة بواسطة مسحات الدم الملطخة بجيمسا قبل تجميد الغطس (الشكل 1). يمكن تجميد Schizonts في أي من هذه الحالات باستخدام الطريقة الموضحة في هذا المنشور. الشكل 1: مورفولوجيا المركب 2 و E64 المتوقفة P. المنجلية schizonts بواسطة مسحات الدم الملطخة بجيمسا. (أ) في وجود المركب 2 ، تكون الفجوة الطفيلية (PV) معبأة بكثافة مع الميروزويتات (الدوائر الأرجوانية) مع مجموعة واحدة من بلورات الهيموزوين (دائرة بنية داكنة). الحدود بين PV والهيموجلوبين المحيط في خلايا الدم الحمراء المضيفة (hRBC) (الشريط الرمادي) محددة جيدا ، وكذلك غشاء hRBC. (ب) في وجود E64 ، يتمزق الغشاء الكهروضوئي وتنتشر الميروزويتات داخل hRBC. لا يزال كل شيزونت يحتوي على مجموعة واحدة من بلورات الهيموزوين. غشاء الخلية المضيفة متسرب ومنهار جزئيا ، وبالتالي ، لا يوجد هيموجلوبين مرئي داخل محيط الخلية ولا يمكن رؤية حدود غشاء hRBC بسهولة. شريط مقياس ، 5 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. تحسين تجميد الغطستمت تجربة مجموعة من الشبكات ذات أحجام الثقوب المختلفة أثناء تحسين ظروف النشاف لخلايا الدم الحمراء المصابة بالمتصورة المنجلية ، بما في ذلك 2/2 و 3/3 و 3.5 / 1 و 5/2 (مربع) من الكربون على شبكات الذهب والنحاس 200. توفر شبكات مكتشف النحاس الشبكية 200 مع فيلم كربون هولي 2/4 طبقة سميكة مناسبة من الخلايا لطحن الصفائح الزجاجية الطويلة. أدت الثقوب الأكبر أو الأصغر عموما إلى طبقات خلايا رقيقة جدا أو سميكة ، على التوالي (الشكل 2A-C). مع 2/4 كربون هولي ، يتم سحب الفصام من خلال ثقوب 2 ميكرومتر عن طريق تنشيف الشبكة من الخلف (الجانب غير الكربوني) ، مما يؤدي إلى خروج الخلايا أعلى وأسفل فيلم الكربون. ينتج عن امتداد الكربون البالغ 4 ميكرومتر بين الثقوب شريط من الكربون يمر عبر منتصف معظم الصفائح الناتجة ، مما يضيف قوة. شبكات الباحث هي الأنسب لأغراض الارتباط والغربلة44 ، ولكن يجب توخي الحذر للتأكد من أن الأرقام / الحروف في تصميم الشبكة ليست كبيرة جدا لأن هذا سيسد مناطق الطحن. يبلغ وقت النشاف على المكبس اليدوي حوالي 20 ثانية ، ولكن النقطة الدقيقة التي يجب عندها إيقاف النشاف تم الحكم عليها بالعين عندما توقفت قطرة السائل التي يتم سحبها من الشبكة عن الانتشار على ورق الترشيح. كانت هناك حاجة إلى حافة ممزقة لكسر التوتر السطحي للقطرة لبدء عملية النشاف. لم يتم استخدام الفريزر الغاطس الآلي في هذه الدراسة ، ولكن نقطة البداية المعقولة لهذه العينة هي استخدام نفس حجم الخلايا ونوع الشبكة المستخدمة في المكبس اليدوي ، مع التأكد من مسح الشبكات من الخلف في ظروف الرطوبة العالية (~ 70٪) ودرجة الحرارة المحيطة (~ 25 درجة مئوية). يجب تحسين أوقات وظروف النشاف للنظام الآلي المستخدم المحدد. تم فحص الشبكات المجمدة الغاطسة من P. falciparum schizonts بواسطة مجهر ضوئي مجهز بمرحلة التبريد بدلا من TEM ، لأن العينة لم تكن قابلة للانتقال إلى الإلكترونات. بالنسبة للعينات الرقيقة ، يمكن فحص الشبكات بواسطة TEM (أطلس الشبكة بالكامل عند تكبير ~ 150x) قبل نقل العينة إلى cryoFIB-SEM ، والذي قد يكون شرطا مسبقا للوصول إلى مرفق وطني. يجب إيلاء اهتمام خاص لتدرج سمك الجليد عبر الشبكة وأيضا داخل مربعات الشبكة الفردية. يجب أن تكون مربعات الشبكة الجيدة بسمك خلية واحدة أو تضرب فيلم الكربون في مركزها (الشكل 2C). هذا يتجنب الطحن في الجليد السميك ضد قضبان الشبكة حول حافة مربع الشبكة وسيضمن اختراق الحزمة الأيونية أعلى وأسفل طبقة الخلية ، مما ينتج عنه صفيحة حرة بدلا من إسفين. بمجرد تحسين ظروف النشاف والتجميد القابل للتكرار ، لم يعد الفحص ضروريا عادة قبل طحن FIB. الشكل 2. تحليل توزيع الخلايا على شبكات الغطس المجمدة P. falciparum schizonts بواسطة المجهر بالضوء البارد. (أ) مثال على سميك الجليد عبر مربع شبكي بواسطة الفحص المجهري بالضوء التبريدي، مما يحجب الخلايا وطبقة الكربون. شريط مقياس ، 10 ميكرومتر. (ب) مثال على حجم الثقب (شبكة نحاسية 300 شبكة مع فيلم كربون هولي مربع) كبير جدا بالنسبة للخلايا ، مما ينتج عنه طبقة رقيقة جدا من المواد البيولوجية محاطة بمناطق فارغة بدون جليد. تنتج مثل هذه الشبكات صفائح قصيرة جدا وغير مستقرة. شريط مقياس ، 10 ميكرومتر. (ج) مثال على التوزيع الجيد للخلايا على شبكة نحاسية ذات 200 شبكة مع فيلم كربون 2/4. تم علاج هذه الفصاميات بمثبطات E64. الخلايا الكبيرة (الصندوق الأحمر ، قطر ~ 5 ميكرومتر) ذات المحيط المحدد جيدا هي خلايا دم حمراء مصابة لا تزال تحتوي على غشاء فجوة سليم. مجموعات الخلايا الصغيرة (الصندوق الأزرق ، ~ 1 ميكرومتر) هي الميروزويتات الفردية الموجودة داخل خلية الدم الحمراء المضيفة المنهارة جزئيا. يحتوي كل schizont على بقعة سوداء في مركزه ، مما يشير إلى موضع بلورات الهيموزوين (انظر الشكل 1 للحصول على تفاصيل إضافية). ليس من السهل رؤية الفرق في مورفولوجيا الخلية مرة واحدة داخل cryoFIB-SEM. لذلك ، فإن الفحص المسبق بواسطة المجهر بالضوء البارد مفيد حتى يتم الوصول إلى ظروف النشاف القابلة للتكرار. تغطية الخلية حول حواف مربع الشبكة بجوار قضبان الشبكة (المناطق ذات الشرطات البيضاء) سميكة جدا بحيث لا يمكن طحنها. تعد المنطقة الرقيقة في وسط مربع الشبكة (المنطقة ذات الاندفاع الأصفر) مكانا مثاليا للطحن منه ، حيث تمتد الصفيحة إلى الطبقة المحيطة بالخلايا. شريط المقياس ، 6 ميكرومتر. (D) صورة لحافة شبكة تلقائية خاصة بالتبريد مع علامتين أسودتين ، واحدة داخل القسم المقطوع (قوس أسود) والأخرى المقابلة ، عند موضع الساعة 12 والساعة 6. يمثل السهم الأسود اتجاه الطحن. (ه) عندما يتم تحميل الشبكات في علبة التحميل الآلي ، يجب أن تكون العلامات متساوية البعد على جانبي ملاقط التحميل ، مما يؤدي إلى وضع الصفائح عموديا على محور ميل المرحلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. وضع علامات على جنوط autogrid الخاصة ب cryoFIB للتصوير المقطعيعادة ، يتم تثبيت الشبكات في جنوط autogrid قبل الطحن من أجل تسهيل المناولة وتوفير الصلابة ، مما يحمي الصفائح من التلف أثناء خطوات النقل اللاحقة. تم تصميم جنوط الشبكة التلقائية الخاصة ب CryoFIB بميزة القطع للمساعدة في الوصول إلى المزيد من وجه الشبكة أثناء الطحن. من المهم توجيه اتجاه الطحن بشكل عمودي على محور إمالة TEM بحيث يستمر اكتساب سلسلة الإمالة عن طريق تدوير الصفيحة على طولها. هذا يضمن أن الجدران العالية للخندق المحيط بالصفيحة لا تحجب المعلومات البيولوجية أثناء إمالة الشبكة. عادة ، يتم تمييز حافة autogrid للمساعدة في المحاذاة المرئية داخل مكوك cryoFIB-SEM ولاحقا عند تحميل TEM. بالنسبة لهذه العينات ، تم تطبيق علامتين عند موضع الساعة 12 والساعة 6 بعلامة لا تمحى (انظر جدول المواد) ، واحدة داخل وسط القسم المقطوع من حلقة المشبك والثانية المقابلة مباشرة (الشكل 2 د). عند التحميل في TEM (انظر جدول المواد) ، يجب أن تكون كلتا العلامتين مرئيتين على جانبي ملاقط التحميل ومحاذاة 90 درجة إلى حافة الملقط (الشكل 2E). وتجدر الإشارة إلى أن الشركة المصنعة توصي بمحاذاة الشبكات باستخدام النقاط المحفورة على جنوط autogrid ، حيث يمكن أن تتداخل بعض الأحبار القريبة من الحزمة الأيونية مع الطحن. يمكن فحص الشبكات المقطوعة بواسطة المجهر الضوئي باستخدام شريط كاسيت معدل لمرحلة التبريد ، والتي يمكن أن تكون مفيدة للتحقق من أن عملية القطع لم تدمر فيلم الكربون للشبكة. اعتمادا على عينة الكاسيت ، يمكن أيضا طحن الشبكات غير المقطوعة ، ولكن يجب توخي الحذر الشديد أثناء النقل من cryoFIB-SEM إلى TEM للحد من أي انحناء للشبكة لأن هذا سيؤدي إلى كسر الصفائح. يمكن تحميل الشبكات غير المقطوعة في TEM بواسطة حوامل التبريد ذات الدخول الجانبي ، ولكن هناك احتمال كبير أن تنكسر الصفائح إذا تم القص بعد الطحن. طلاء البلاتين العضوييتم تنفيذ طلاء البلاتين العضوي على إحدى الشبكتين أو كليهما بمجرد تحميلهما في cryoFIB-SEM. يتم إدخال إبرة نظام حقن الغاز (GIS) في الغرفة فوق العينة لتوجيه تدفق بخار البلاتين العضوي عبر سطح الشبكة من مصدر ساخن لفترة محددة. يتكثف البخار على الأسطح الباردة ويشكل طبقة صلبة (~ 2 ميكرومتر). تعتبر سلامة هذا المعطف أمرا بالغ الأهمية لتمكين طحن الصفائح الرقيقة بشكل موحد. عادة ما يتم تحديد شروط التطبيق المثلى لطبقة البلاتين العضوي مسبقا من قبل الشركة المصنعة للأداة ، ولكن قد لا تزال هناك حاجة إلى بعض التحسين. تقوم معظم الأنظمة إما بمحاذاة إبرة GIS بالقرب من اتجاه الطحن أو عموديا على اتجاه الطحن ، اعتمادا على هندسة المنافذ على الغرفة وحدود الدوران للمرحلة. يمكن تجربة إعدادات مختلفة عن طريق طلاء الشبكة ، وطحن منطقة صغيرة ، وإمالة المسرح ، وقياس سمك الطلاء بواسطة SEM. بالإضافة إلى إعداد cryoFIB-SEM نفسه ، يمكن أن يؤثر عدد من العوامل الأخرى على تطبيق طبقة البلاتين العضوي بما في ذلك 1) تضاريس العينة ، 2) تلوث السطح على الشبكة و 3) استنساخ تدفق البخار من إبرة GIS. نظرا لأن تدفق نظم المعلومات الجغرافية اتجاهي ، يمكن أن تتسبب التضاريس غير المستوية في أن تكون المناطق في ظل الخلايا أو تلوث السطح غير مطلية أو لها طبقة أرق. هذا يمكن أن يؤدي إلى انهيار طبقة البلاتين العضوي أثناء التلميع (الشكل 3). عند اختيار منطقة لطحنها ، من الضروري الانتباه إلى التضاريس المحيطة ، على سبيل المثال ، التلوث السطحي الكبير ، أو كتل الخلايا أو الكربون المكسور الذي يبرز من سطح الشبكة على بعد مربعين من الشبكة ، قد يمنع تدفق البخار ، مما يخلق ظلا من البلاتين العضوي الأرق الذي قد يضعف الصفيحة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أيضا تجنب جزيئات صغيرة جدا من التلوث السطحي بالقرب من الحافة الأمامية للصفيحة لأنها يمكن أن تنبثق أثناء الطحن ، تاركة رقعة ضعيفة من الثلج العاري قد تؤدي إلى حدوث ثقب في الصفيحة أثناء التلميع. أخيرا ، إذا بدأ الطحن وبدا معطف البلاتين العضوي غير مستقر ، فقم بتغطيته مرة أخرى لفترة أطول ، أو قم بالتبديل إلى شبكة احتياطية. الشكل 3: يعد طلاء البلاتين العضوي عالي الجودة أمرا بالغ الأهمية للحصول على صفائح رقيقة ومطحونة بالتساوي. (أ) صورة مجهرية للحافة الأمامية للصفيحة حيث تم تطبيق طلاء البلاتين العضوي (OP ، الأصفر) بشكل رقيق للغاية ، مما أدى إلى ثقب في الحافة الأمامية للصفيحة التي تطورت أثناء التلميع (الدائرة الخضراء) والطحن غير المتكافئ عبر العرض الكامل للصفيحة (الخطوط). تم قطع سطح البلاتين العضوي بواسطة الحزمة الأيونية ، مما أدى إلى رش مادة خلف الحافة الأمامية للطلاء (خط أصفر متقطع). (ب) تم تطبيق طبقة البلاتين العضوي (OP) بشكل أكثر سمكا ، مما أدى إلى صفيحة أكثر ترققا بشكل متساو. يتم الحفاظ على سلامة الغلاف عبر عرض الصفيحة بالكامل والواجهة بين طبقة البلاتين العضوي والمواد البيولوجية المزججة محددة جيدا (خط أصفر متقطع). يمكن رؤية طبقة الكربون تمر عبر الجزء الخلفي من الصفيحة (برتقالية). قضبان المقياس ، 1 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. تقييم جودة الشبكة في cryoFIB-SEM وعملية الطحنبمجرد نقل الشبكات إلى cryoFIB-SEM ، يمكن فحص سلامة فيلم الكربون وتوزيع الخلايا على الشبكات بواسطة SEM (الشكل 4A-C). يمكن التحقق من التدرجات الجليدية ومواضع قضبان الشبكة وموقع أرقام الشبكة على شبكات الباحث عن طريق SEM منخفض التكبير عند 30 كيلو فولت (الشكل 4 ب) ، ولكن يجب تقليل الجهد مرة أخرى إلى 5 كيلو فولت أثناء تحديد مواقع الطحن عند التكبير العالي ومراقبة عملية الطحن لزيادة التباين من تضاريس السطح. الشكل 4: تقييم جودة الشبكة وتحديد المناطق المراد طحنها في cryoFIB-SEM . (أ) نظرة عامة منخفضة التكبير لشبكة عند 5 كيلو فولت عبر SEM. يظهر القسم المقطوع من حافة autogrid في أسفل الصورة. شريط مقياس ، 0.5 مم. (B) نفس الشبكة عند 30 كيلو فولت بواسطة SEM ، تظهر مناطق من الجليد السميك (مربعات الشبكة الداكنة) والجليد الأرق (مربعات الشبكة الأخف وزنا). يظهر الجزء الداخلي المنطقة في المربع ، مع أسهم تشير إلى الترقيم على شبكة الباحث ، والتي تكون مرئية عند 30 كيلو فولت. شريط مقياس ، 0.5 مم. (C) نظرة عامة متوسطة التكبير لمربعين شبكيين لتقييم توزيع الخلايا على طبقة الكربون وموقع أشرطة الشبكة. شريط مقياس ، 50 ميكرومتر. (د) ترتيب أنماط الطحن للقطع الأول عند التكبير العالي (عرض الحزمة الأيونية عند 1.5 pA و 30 kV). المنطقة الحمراء (بسمك 3 ميكرومتر) محمية ، بينما سيتم استئصال المناطق الصفراء بواسطة الحزمة الأيونية. يشير الخط ذو الشرطة البيضاء إلى موضع الصفيحة النهائية. شريط مقياس ، 10 ميكرومتر. (ه) منظر عالي التكبير عند 3 كيلو فولت عبر SEM لصفيحة مصقولة بسمك 200 نانومتر (عرض 10 ميكرومتر × طول 15 ميكرومتر). يشير فقدان التباين داخل الصفيحة عند 3 كيلو فولت إلى أنه تم الوصول إلى سمك مناسب. الحافة الأمامية ذات اللون الأبيض الساطع هي الطبقة البلاتينية العضوية المتبقية التي يتم تطبيقها على الشبكة عبر نظام المعلومات الجغرافية قبل الطحن. شريط مقياس ، 5 ميكرومتر. (F) نفس الصفيحة من (E) ينظر إليها باستخدام الحزمة الأيونية عند 30 kV و 1.5 pA. الخط الأبيض الرفيع عبر المربع الأسود (السهم الأبيض) هو معطف البلاتين العضوي المتبقي على الحافة الأمامية للصفيحة. شريط مقياس ، 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. يتم اختيار المنطقة المراد طحنها عن طريق وضع زوج من الأنماط المستطيلة على جانبي منطقة محمية عند التكبير العالي (~ 7000x للفصام) في عرض الحزمة الأيونية (الشكل 4D). من الأهمية بمكان عدم ربط أي جزيئات من التلوث السطحي بالقرب من منطقة الطحن لأنها قد تحجب تطبيق طبقة البلاتين العضوي الواقية. من المهم أيضا أن تكون تضاريس المنطقة مناسبة لدعم جوانب الصفيحة بمجرد تحقيق سمكها النهائي. بالنسبة لشيزونتات الملاريا (حجم الخلية: ~ 5 ميكرومتر قطر × 2 ميكرومتر ، شكل قرص) يمكن طحن الصفائح التي يتراوح عرضها بين 7-20 ميكرومتر. إذا كانت طبقة الخلية سميكة بشكل مناسب ، فعادة ما ينتهي الأمر بالصفائح ~ 10-15 ميكرومتر في الطول ، وتلتقط خلايا متعددة أعلى وأسفل طبقة الكربون (الشكل 4E-F). يمكن توقع طحن 5-10 صفائح في جلسة 8 ساعات (6-7 ساعات من الطحن و 1-2 ساعة من التلميع). سيختلف هذا اعتمادا على سمك العينة وعرض الصفائح ، حيث تستغرق العينات السميكة والصفائح الأوسع وقتا أطول للطحن. حتى الشبكات التالفة يمكن طحنها لأنها لا تتطلب سوى عدد قليل من مربعات الشبكة الجيدة لتوليد مجموعة من الصفائح (الشكل 5 أ). بالإضافة إلى ذلك ، إذا كانت العينة أرق من المتوقع ، على سبيل المثال ، بسبب الإفراط في النشاف أو الاختلاف في الهيماتوكريت في المستنبتة ، يمكن طحن الصفائح الأقصر بسرعة نسبية. ومع ذلك ، فإن طولها الأقصر سيحد من المساحة المتاحة لجمع البيانات في TEM (الشكل 5B). الشكل 5: تحديد متى تم الوصول إلى سمك الصفيحة النهائي أثناء الطحن. (أ) نظرة عامة منخفضة التكبير لشبكة بواسطة SEM عند 5 كيلو فولت تظهر تلف الكربون أثناء القص. احتوت المناطق غير المتضررة على عينة رقيقة جدا بسبب الإفراط في النشاف. ومع ذلك ، كان لا يزال من الممكن طحن ست صفائح على هذه الشبكة (المنطقة داخل المخطط الأبيض المتقطع) في جلسة ليوم كامل على cryoFIBSEM. شريط مقياس ، 0.5 مم. (B) صفيحة قصيرة (~ 10 ميكرومتر عرض × 3 ميكرومتر طويلة ، لا تشمل طبقة البلاتين العضوي) منتجة من هذه الشبكة (SEM عند 3 كيلو فولت) ، والتي لا تزال توفر منطقتين يمكن من خلالهما جمع سلسلة الميل. شريط مقياس ، 25 ميكرومتر. (C) سلسلة من صور SEM (3 كيلو فولت) للصفيحة أثناء خطوة التلميع النهائية توضح كيفية فقدان التباين في الصفيحة أثناء تخفيفها (تتحرك من اليسار إلى اليمين). الخط الأسود الداكن عبر منتصف الصفيحة في جميع الصور هو شريط من فيلم الكربون من الشبكة. تزججت الخلايا الموجودة أمام هذه المنطقة فوق طبقة الكربون، وتزججت الخلايا الموجودة خلف هذه المنطقة أسفل طبقة الكربون. تم إيقاف الطحن عندما كان معطف البلاتين العضوي على الجانب الأيسر من الحافة الأمامية للصفيحة على وشك فقدان السلامة الهيكلية. كانت نقطة التوقف هذه قبل أن تصل الصفيحة بأكملها إلى سمك متساو ، ولهذا السبب لا تزال هناك بعض المواد عالية التباين في الجزء الخلفي من الصفيحة. (د) مثال على مسار تلميع يعتمد على الصفيحات المطحونة على الشبكة الموضحة في (أ). يجب أن يبدأ مسار التلميع عند الصفائح بالقرب من مصدر FIB ، مبتعدا عن مصدر FIB للحد من إعادة ترسب المواد المطحونة على سطح الصفائح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. أثناء التلميع ، سيعتمد السمك النهائي للصفيحة على بنية العينة في المنطقة التي يتم طحنها ، وسلامة طبقة البلاتين العضوي ، والوقت المتاح. من الناحية المثالية ، يجب تخفيف العينة حتى يتم فقد التباين عبر سطح الصفيحة بالكامل بواسطة SEM عند 3 كيلو فولت ، مما يشير إلى أنها شفافة بشكل متساو وبسمك حوالي 150-200 نانومتر (الشكل 5C). ومع ذلك ، قد يكون من الضروري التوقف عن الطحن قبل هذه النقطة إذا طورت طبقة البلاتين العضوي ثقبا أو بدأت الصفيحة في الانحناء. في هذه الحالة ، قد تظل الصفيحة رقيقة بدرجة كافية في المقدمة وتظل مفيدة للتصوير المقطعي. على العكس من ذلك ، من الممكن تجاوز مرحلة فقدان التباين إذا بدت الصفيحة مستقرة ، مما يجعلها أرق عن طريق تحريك أنماط الطحن بالقرب من بعضها البعض (~ 100 نانومتر أو أقل). سيعتمد هذا على السماكة إذا لزم الأمر لسير عمل المصب. مطلوب صورة SEM منخفضة التكبير لتخطيط مسار التلميع ، بدءا من مصدر الحزمة الأيونية والعمل بعيدا (الشكل 5D). يعد اتجاه مسار التلميع مهما لمنع إعادة ترسب المواد المستأصلة على الصفيحة التي تم الانتهاء منها بالفعل. جمع ومعالجة بيانات سلسلة الإمالةبمجرد التحميل في TEM ، سيحدد مونتاج الشبكة الكاملة منخفض التكبير (~ 150x) مواضع الصفائح ، والتي يمكن ربطها بصورة SEM منخفضة التكبير التي تم التقاطها في نهاية الطحن. بالنسبة للشيزونتات المجمدة الغاطسة ، فإن معظم الشبكة ليست شفافة للإلكترونات ، لذلك تظهر مواضع الصفيحة على شكل شقوق بيضاء على خلفية سوداء (الشكل 6 أ). يجب ملاحظة زاوية الصفائح فيما يتعلق بمحور الميل للمجهر ، حيث أن أكثر من ~ 10 درجة بعيدا عن العمودي يمكن أن يجعل اكتساب سلسلة الميل أمرا صعبا. سيعطي مونتاج التكبير المتوسط (~ 1500x) في موقع كل صفيحة نظرة عامة على المحتوى البيولوجي ويتحقق من تلف النقل أو الجليد البلوري أو التلوث السطحي المفرط (الشكل 6B-D). يجب أيضا التحقق من ذلك عند الإمالة العالية للتأكد من عدم وجود تلوث سطحي يحجب منطقة الاستحواذ أو التركيز. لن يعتمد اختيار منطقة الاستحواذ على السمات البيولوجية فحسب ، بل يعتمد أيضا على السلامة الهيكلية للجليد في المنطقة المحيطة ، على سبيل المثال ، تجنب الشقوق ، حيث ستنجرف هذه المناطق ، أو المناطق ذات الستائر المفرطة ، حيث سيكون للصفيحة سمك متغير. قبل الحصول على سلسلة إمالة ، يتم تطبيق إمالة مسبقة ±10 درجات على الشبكة لجعل مستوى الصفائح (وليس الشبكة) عموديا على المحور البصري. يمكن تحديد اتجاه الإمالة المسبقة من خلال موضع الحافة الأمامية للصفائح (تبحث عن الطبقة اليسرى فوق البلاتين العضوي) في مونتاج التكبير المتوسط. بالنسبة ل TEM المستخدم هنا (300 كيلو فولت Titan Krios) ، إذا كانت الحواف الأمامية للصفائح تشير إلى أعلى في الخريطة ، فإن هذا يتطلب إمالة مسبقة + 10 درجات وإذا كانت تشير إلى أسفل ، فإن هذا يتطلب إمالة مسبقة -10 درجة. قد تكون كل شبكة مختلفة بسبب الاتجاه الذي تم التقاطها فيه في الملقط وإدخالها في أداة التحميل التلقائي (القسم المقطوع المواجه لليسار أو اليمين ، ينتج دوران 180 درجة). الاعتبار الأخير هو حجم البكسل. بشكل روتيني ، يتم جمع سلسلة الميل حول 2.5-7 Å / بكسل ، مع مراعاة حجم الميزة ذات الاهتمام ، والدقة المستهدفة للبيانات المقطعية الناتجة ومساحة سطح الصفيحة ، مما قد يحد من حجم منطقة الاستحواذ. من الممكن استخدام حجم بكسل أصغر للحصول على معلومات عالية الدقة وأصغر حجم استخدمناه بنجاح في هذه العينات هو 1.4 Å / pixel (البيانات غير معروضة). سيكون الانجراف أكثر وضوحا عند حجم بكسل أصغر وهو مناسب فقط للصفائح الرقيقة (<100 نانومتر) حيث يكون تعظيم الدقة ذا أهمية في الدراسة. الشكل 6: اختيار مناطق الاهتمام التي يمكن الوصول إليها والتي يمكن الحصول منها على سلسلة الإمالة (A) قسم من خريطة TEM منخفضة التكبير يظهر منطقة تحتوي على صفائح ، تظهر على شكل ست شقوق بيضاء على خلفية سوداء (أسهم حمراء). المربعات البيضاء عبارة عن فيلم كربوني مكسور. (ب) خريطة متوسطة التكبير لصفيحة تالفة ومنحرفة. عند الحافة الأمامية للصفيحة (FE) ، انفصل معطف البلاتين العضوي (1). هناك رقعة واضحة من الجليد البلوري في وسط الصفيحة (2). فشل شعاع الأيونات في اختراق الحافة الخلفية للصفيحة (BE) لأن الجليد سميك جدا بجوار قضبان الشبكة. جزء صغير فقط من الصفيحة خال من الجليد المحيط في BE (3) ، مما يخلق إسفين. تسبب السمك أيضا في قطع الأرفف فوق الصفيحة (4) ، والتي من المرجح أن تحجب رؤية الخلايا عند الإمالة العالية في TEM. (ج) مونتاج متوسط التكبير لصفيحة كاملة معروضة في TEM. المشاكل أو المناطق النموذجية التي يجب تجنبها عند جمع سلسلة الميل من الصفائح هي المناطق: مغطاة بالتلوث السطحي (SC) ، مغطاة بطبقة البلاتين العضوي (OP ، أصفر) ، بالقرب من الشقوق (CR والسهام السوداء) ، مع ستارة بسبب تغيرات الكثافة في المواد البيولوجية (CU والمنطقة داخل الأقواس الزرقاء) ، والمناطق التي أضعفتها الفواصل في طبقة البلاتين العضوي (الدائرة الخضراء). المناطق الوحيدة التي يمكن الوصول إليها لاكتساب سلسلة الإمالة هي المناطق الموجودة داخل الصندوقين المتقطعين باللون الأسود (المسمى 1 و 2). يجب فحص العرض عند الإمالة العالية للتأكد من أن تلوث السطح لا يحجب منطقة الاهتمام أو منطقة التركيز. (د) مونتاج متوسط التكبير لصفيحة أنظف بكثير ، ولكن لا يزال بها تشققات (CR) ناتجة عن ترقق طبقة البلاتين العضوي (الدائرة الخضراء) أثناء التلميع. هنا ، يتم تمييز المنطقة محل الاهتمام من خلال نوع الخلية الذي لوحظ داخل الصفيحة ، والتي في هذه الحالة هي الميروزوا الفردية ، الموضوعة خلف طبقة الكربون (البرتقالية) باتجاه الجزء الخلفي من الصفيحة (صندوق أسود متقطع). قضبان مقياس ، 3 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 7: الحصول على بيانات cryo-ET من الصفيحة المطحونة FIB. أ: صورة مجهرية لمنطقة من الصفيحة تحتوي على خلية دم حمراء غزتها مؤخرا المتصورة المنجلية ميروزويت. في (ب) الصورة نفسها مشروحة لتوضيح حدود خلية الدم الحمراء (الحمراء)، وعدد من الحويصلات الخلوية مزدوجة الجدران (أرجواني وأزرق للأغشية الداخلية والخارجية، على التوالي) والميروزويت (أخضر) محاط بغشاء ثان مشتق من الخلية المضيفة (أصفر). يظهر الصندوق الأسود المنطقة التي تم فيها الحصول على سلسلة إمالة. شريط المقياس ، 500 نانومتر. (ج) ما معدله 20 شريحة مركزية معروضة في المستوى XY من تصوير مقطعي مثبت 8x (2.4 Å / بكسل) تم الحصول عليه في الطرف القمي للميروزويت وفي (د) شرحه التوضيحي ، يوضح الغشاءين المحيطين بالخلية (الأخضر والأصفر) وأربعة أغشية مكدسة في قمة الميروزويت (الأزرق) المرتبطة بميزة كثيفة الإلكترون على شكل فطر (أرجواني). يشير السهم الأحمر إلى تقاطع مداخن الغشاء في القمة والميزة على شكل فطر (كما هو موضح في الجزء F ، i). يشير السهم الأسود إلى حدث اندماج بين غشاء بلازما الميروزويت وإحدى الحويصلات متعددة الطبقات داخل الطفيلي (كما هو موضح في الجزء F ، ii). يظهر غشاء خلايا الدم الحمراء المضيفة (أحمر)، ويوضح الخط المتقطع الأسود موضع المقطع العرضي الموضح في المستوى XZ، الموضح في (ه). المعالم الموجودة في المقطع العرضي (E) ملونة وموسومة كما في الجزء (D) ، مع أسهم ملونة تشير إلى الأغشية. يشير السهم الأسود إلى موضع طبقة الرش المطبقة على الصفيحة بعد الطحن وسمك الصفيحة المشار إليها. للأجزاء (C-E) ، شريط المقياس ، 500 نانومتر. (F) عرض أكثر تفصيلا للسمات المشار إليها برؤوس الأسهم الحمراء والسوداء في الجزء (C) ، مع إظهار التعريف في الطبقات الثنائية الدهنية لكومة الغشاء في قمة الميروزويت (i) وحدث الانصهار بين الحويصلة متعددة الطبقات مع غشاء بلازما الميروزويت. شريط مقياس ، 75 نانومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. ينصب التركيز الأساسي للعمل على تشريح مسار خروج الميروزويت في P. falciparum ولكن بالنظر إلى أن عدد الخلايا المستخدمة في الدراسة لا يمكن أبدا أن يكون متجانسا تماما ، فقد لوحظت في كثير من الأحيان مراحل أخرى من تطور الخلايا داخل الصفائح. المثال الموضح هنا (الشكل 7) يحتوي على خلايا دم حمراء تم غزوها مؤخرا بواسطة P. falciparum طفيلي (ميروزويت). كان سمك الصفيحة المستخدمة 240 نانومتر وكانت الشبكة مغلفة قليلا بالبلاتين في جو من الأرجون قبل إدخالها في TEM ، مما أدى إلى تباين أقل قليلا مما هو متوقع عادة. يمكن تتبع غشاء خلايا الدم الحمراء بالكامل المحيط بالخلية. داخل خلايا الدم الحمراء كانت هناك ثلاثة هياكل مغلقة محاطة بالغشاء ، حويصلاتان ، كل منهما محاط بغشاء مزدوج وميزة على شكل مصباح كهربائي (1.2 ميكرومتر × 0.9 ميكرومتر في أوسع أجزائه) ، وهو ما يتوافق مع كونه ميروزويت (الشكل 7 أ-B). يبدو أن محتويات الحويصلات متشابهة على عكس محتويات خلايا الدم الحمراء ، مما يشير إلى أن هذه الحويصلات قد تحتوي على الهيموجلوبين. لوحظ وجود حويصلات داخل خلايا الدم الحمراء المضيفة بعد الغزو سابقا45. يعتقد أنها تنشأ من إفراز الدهون وعوامل الفوعة الأخرى من عضيات إفرازية تسمى rhoptries في الميروزويت ، والتي تفرز في الخلية الحمراء المضيفة أثناء الغزو. يحيط بالميروزويت غشاءان مرتبطان ارتباطا وثيقا ، يفترض أن يكون الجزء الداخلي منه هو غشاء البلازما الأصلي للميروزويت ، والذي لا يوجد عليه طبقة سطحية مرئية ، ويجب أن يستمد الجزء الخارجي من غشاء الخلية الحمراء المضيف الذي يغلف الميروزويت أثناء غزوه. يحتوي سيتوبلازم الميروزويت على العديد من الحويصلات متعددة الطبقات وميزة كثيفة على شكل فطر إلكتروني مجاورة لكومة من الأغشية في القمة. تظهر سلسلة الإمالة المكتسبة فوق هذه المنطقة (2.4 Å / pixel) أنها تحتوي على كومة من أربعة أغشية ، والتي يبدو أنها متصلة بميزة على شكل فطر (الشكل 7 ج-E). اللافت للنظر أن هذا التشكل يختلف تماما عن الترتيب الطبيعي للعضيات والهياكل الخلوية في النهاية القمية للميروزويت الناضج. ولتقييم ذلك، تم الحصول على سلسلة إمالة مقارنة (2.74 Å/pixel) على الطرف القمي على ميروزويت ناضج من شيزونت تمت معالجته ب E64 قبل التجميد والطحن (الشكل 8). وهذا يوضح أن الطرف القمي للميروزويت يحتوي على عضيتين إفرازيتين بارزتين على شكل مضرب تسمى rhoptries تقع داخل مجموعة من ثلاث حلقات قطبية عند الطرف القمي للخلية ومحاطة بعدد من العضيات الإفرازية الأصغر تسمى micronemes. ترتبط الحلقة القطبية الداخلية بهيكل غشاء مزدوج يقوم عليه غشاء بلازما الميروزويت ، يسمى مجمع الغشاء الداخلي ، والذي يحتوي على بروتينات حركية تدفع الغزو. لقد ثبت أنه أثناء الغزو يتم تصريف محتويات العضيات الإفرازية على سطح الميروزويت وفي خلايا الدم الحمراء المضيفة ، مما يسهل ارتباط الميروزويتات بالخلايا الحمراء المضيفة وبدء المركب الحركي الذي يدفع الغزو45. تظهر البيانات هنا أنه بعد الغزو ، لا يحتوي الميروزويت على هياكل يمكن ملاحظتها تشبه rhoptries أو micronemes أو الحلقات القطبية ، مما يشير إلى أن مورفولوجيا النهاية القمية للميروزويت تتغير بشكل كبير. تم عرض اندماج الروبترات قبل الغزو سابقا بواسطة TEM لأقسام درجة حرارة الغرفة الثابتة46، وهو ما يتفق مع إنتاج الميزة على شكل فطر التي نلاحظها في حالة الميروزويت بعد الغزو. لم يتم ملاحظة أكوام الأغشية المتصلة بهذه الميزة من قبل ، وبما أنه لا يوجد ما يشير إلى وجود IMC في الميروزويت الذي تم غزوه حديثا ، فإننا نفترض أن مداخن الغشاء قد تكون بقايا آلية IMC المتبقية بعد اكتمال الغزو ، ولكن هذا لا يزال يتعين تأكيده. الشكل 8: النهاية القمية للميروزويتات الناضجة بواسطة cryo-ET للصفائح المطحونة FIB و TEM للمقاطع البلاستيكية. (أ) ما معدله 20 شريحة مركزية من تصوير مقطعي محوسب 8x (2.74 Å / بكسل) من صفيحة بسمك 230 نانومتر تظهر التشكل النموذجي للنهاية القمية لميروزويت ناضج. تمت معالجة الفصام ب E64 قبل تجميد الغطس ، وبالتالي تمزق الغشاء الكهروضوئي وتم احتواء الميروزويتات داخل الخلية الحمراء المضيفة. (B) يظهر نفس الشيء كما في (A) ، ولكن مع التعليقات التوضيحية للإشارة إلى غشاء خلايا الدم الحمراء المضيف (RCM ، أحمر) ، غشاء بلازما الميروزويت (أخضر) ، مركب الغشاء الداخلي (IMC ، أرجواني) ، حلقات قطبية (PR ، أسود) ، micronemes (M ، أصفر) ، rhoptries (R ، رمادي) ، والغلاف النووي (NE ، أزرق). يشار إلى الميروزويت المجاور ، وهو خارج الطائرة في هذه المنطقة من التصوير المقطعي المقطعي بواسطة مثلث أخضر. شريط مقياس ، 200 نانومتر. (ج) تتوافق السمات الخلوية التي لاحظها cryoET مع تلك الموجودة في TEM للشيزونتات المحفوظة في أقسام بلاستيكية. يشار إلى ميزات خلوية مماثلة في ميروزويت ناضج من شيزونت تم معالجته بالمركب 2 ، مما أدى إلى توقف الخروج قبل تمزق الغشاء الكهروضوئي. شريط المقياس ، 500 نانومتر. (د) رسم تخطيطي مشروح لميروزويت يوضح السمات الخلوية في الأجزاء (A-C). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. سمك المنطقة المحمية بين أنماط الطحن المستطيلة (ميكرومتر) تيار شعاع الأيونات الاسمي (pA) عند 30 كيلو فولت 3 300 1.5 100 0.75 50 0.3 30 0.2 – 0.06 (تلميع نهائي) 30* الجدول 1: استراتيجية الطحن لإنتاج صفائح رقيقة. يتم إجراء الطحن التدريجي عن طريق تقليل تيار الحزمة الأيونية المقابلة لسمك المنطقة المحمية. هذا يحد من تسخين العينة ، ويمنع الانحراف. * يجب إجراء التلميع بالتوازي لتطبيق الحرارة بالتساوي على الصفائح من كلا الجانبين ، مما يقلل من خطر الانحناء أو الانحناء عند وصولها إلى سمكها النهائي. يمكن القيام بخطوات أخرى بالتتابع ، حيث يتم طحن النمط فوق الصفيحة ثم أسفل الصفيحة ، قبل الانتقال إلى تيار الحزمة التالي. يجب إجراء مسح للشبكة لتحديد مواقع الطحن عند تيار شعاع 1.5 pA لتقليل تسخين العينة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

Discussion

في حين أن الطحن بالتبريد أصبح أكثر روتينية ، فإن إعداد العينات المثلى للطحن لم يحدث ؛ لذلك ، تحدث معظم الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول قبل أن تصل العينة إلى cryoFIB-SEM. يلزم تحسين العينة عن طريق جولات متعددة من تحضير الخلية ، وتجميد الغطس ، والفحص بواسطة المجهر الضوئي والإلكتروني لإنتاج أفضل عينة ممكنة قبل محاولة الطحن. إن الحصول على أفضل عينة ممكنة لا يزيد من فرص النجاح فحسب ، بل يحسن أيضا استخدام المعدات. لهذا السبب ، تتطلب معظم المرافق الوطنية دليلا على أنه تم إجراء تحسين كاف قبل منح الوقت على أجهزتها. بمجرد دخول cryoFIB-SEM ، يعد تعظيم فعالية طبقة البلاتين العضوي أمرا بالغ الأهمية من أجل إنتاج صفائح رقيقة بشكل موحد. أخيرا ، يعد الصبر والتعامل الجيد مع العينات مهارة أساسية من المستخدم ، الذي سيطلب منه الجلوس لعدة أيام لإنتاج ثم نقل الشبكات التي تحتوي على صفائح حساسة. قد يتغير هذا مع إدخال استراتيجيات الطحن الآلي47,48 ، ولكن حتى الآن ، لا تزال عملية الطحن بأكملها يدوية إلى حد كبير في معظم المرافق.

بينما ركز العمل فقط على P. falciparum schizonts ، يمكن تعديل الطريقة المعروضة هنا بسهولة لتحسين إعداد الشبكة والطحن لأنواع الخلايا الأخرى. العوامل المهمة التي يجب مراعاتها هي كثافة الخلايا التي يتم تطبيقها على الشبكة ، ونوع الشبكة (النحاس سام لبعض الخلايا) ، وحجم وتباعد الثقوب في فيلم الكربون ، ووقت النشاف ، وطريقة النشاف (أحادي / مزدوج الجوانب ، يدوي ، أو آلي). بالإضافة إلى ذلك ، إذا كانت الخلايا تزرع على الشبكات (عادة شبكات ذهبية مع فيلم كربوني هولي) ، يمكن التحقق من التقاء المجهر الضوئي قبل النشاف والتجميد. تعتمد استراتيجية الطحن على كيفية ترسيب الخلايا على الشبكة. بالنسبة لخلايا الدم الحمراء المصابة بالملاريا ، فإن الشبكة مغلفة بشكل أساسي بطبقة غير منقطعة من الخلايا ، أكثر سمكا في بعض المناطق وأرق في مناطق أخرى. يتم الطحن في نقاط متعددة في منطقة واحدة على طول هذا التدرج حيث يولد سمك الجليد صفائح ذات حجم مناسب للتصوير المقطعي. يعمل هذا الأسلوب بشكل جيد مع الخلايا الأصغر حيث يمكنك إنتاج صفائح تحتوي على شريحة عبر خلايا متعددة. بالنسبة للخلايا الأكبر حجما أو كتل الخلايا ، قد تكون الحالة هي أن خلية واحدة أو كتلة خلوية قد تنتج صفيحة واحدة.

تظل معالجة الشبكة ونقل العينات أحد التحديات الرئيسية لسير العمل هذا. يمكن أن تضيع الصفائح بسبب الكسور أو الشقوق ، والستائر المصنوعات اليدوية التي تحجب البيولوجيا ، والتلوث السطحي المفرط ، فضلا عن مشاكل توجيه الشبكة داخل TEM ، مما يتطلب خطوة معالجة إضافية لإعادة وضع الشبكة. تختلف درجة الخسائر من يوم لآخر ومن شبكة إلى أخرى ، ولكن يتم تحسينها من خلال الممارسة وتجربة التعامل مع مرور الوقت. في هذه الدراسة ، وجد أنه يمكن إعادة توجيه الشبكات بعناية في أداة التحميل الآلي عدة مرات دون تدمير الصفائح وهذا في بعض الأحيان له فائدة في غسل الجليد السطحي. القيد الرئيسي الآخر لسير العمل هذا هو الوقت المستغرق لإنتاج الصفائح. نظرا لأن الإنتاج بطيء ، فمن الأهمية بمكان الحصول على عينة محسنة بشكل صحيح ، مما يجعل الطحن فعالا قدر الإمكان.

تم مؤخرا إدخال عدد من التعديلات على طحن FIB للعينات البيولوجية الزجاجية. مغير قواعد اللعبة هو تنفيذ أدوات الرفع المبردة بالتبريد داخل غرفة cryoFIB-SEM التي تتيح طحن كتل أكبر من المواد من العينات المجمدة عالية الضغط. يمكن ربط الكتل بقضيب معدني أو التقاطها في قابض ونقلها إلى موضع عينة ثان ، يحتوي على شبكة EM معدلة خصيصا. يمكن بعد ذلك طلاء الكتل بالبلاتين العضوي وطحنها لتوليد الصفائح. تعني القدرة على طحن الصفائح من المواد المجمدة عالية الضغط أنه يمكن معالجة خلايا وأنسجة أكبر بكثير ، وتستهدف على وجه التحديد المناطق بواسطة المجهر الفلوري المترابط12. تشمل التعديلات الحديثة الأخرى على طريقة طحن FIB تقليل القطع الأثرية الستائرية عن طريق الطحن المسبق للعينة16 ، وتثبيت الموائع الدقيقةبالتبريد 49 والتنميط المجهري الضوئي لشبكات المجهر الإلكتروني لتحسين توزيع الخلايا50. أيضا ، ثبت أن طحن فجوات التمدد الجزئي على جانبي الصفيحة يمكن أن يخفف من الضغط بواسطة العينة المحيطة عندما تصل إلى نحافتها النهائية51. قد يكون هذا مفيدا بشكل خاص عند طحن طبقات الخلايا المستمرة ، مثل العينة في هذه الدراسة ، حيث يظهر انحناء الصفائح أحيانا أثناء خطوة التلميع النهائية.

من المحتمل أن يكون مستقبل المجهر الإلكتروني هو تحديد الهياكل الجزيئية في الموقع عن طريق متوسط التصوير المقطعي الفرعي ، ويعد طحن FIB أداة مهمة من شأنها تسهيل إنتاج العينات البيولوجية الزجاجية لهذه الأنواع من سير العمل. في حين أن طحن FIB لا يزال في مهده للتطبيقات البيولوجية ، فإن تطوير الأساليب يحدث بوتيرة سريعة بفضل العمل الشاق للباحثين ، سواء الأكاديمية أو في المرافق الوطنية ، بالإضافة إلى الاستثمار التجاري في تطوير تقنية cryoFIB-SEM لدعم البحث.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم تمويل هذا البحث كليا أو جزئيا من قبل Wellcome Trust (212916 / Z / 18 / Z). لغرض الوصول المفتوح ، قام المؤلف بتطبيق ترخيص حقوق الطبع والنشر العام CC BY على أي نسخة مخطوطة مقبولة من المؤلف تنشأ عن هذا التقديم.

تم تمويل هذا المشروع الذي تم تطوير هذه الطريقة من أجله من خلال منحة مجلس البحوث الطبية MR / P010288 / 1 الممنوحة لهيلين آر سيبيل ورولاند أ. فليك ومايكل جيه بلاكمان. نمت ثقافات P. falciparum في معهد فرانسيس كريك ، بدعم من أعضاء مجموعة مايكل جيه بلاكمان. يود المؤلفون أن يشكروا الدكتور سير يينغ (ميشيل) تان على تقديم صور الفصام المعالج بالمركب 2 و E64 في مسحات الدم الرقيقة. تم إنتاج معظم الصفائح بدعم من الموظفين في eBIC ونحن ممتنون للوصول إلى Scios مزدوج الحزمة cryoFIB-SEM في اقتراح البحث NT21004. يقر المؤلفون أيضا بدعم برنامج زمالة صناعة الجمعية الملكية (INF \ R2 \ 202061) في مواصلة تطوير تقنية طحن FIB داخل CUI. يود المؤلفون أيضا أن يشكروا هيلين ر. سيبيل على المناقشات المفيدة فيما يتعلق بورقة الأساليب هذه والإشراف على المشروع.

Materials

c-clips Thermo Fisher Scientific 1036171
Clipping station Thermo Fisher Scientific n/a Direct quote from Thermo
Clipping station Sub-angstrom CSA-01
Compound 2 n/a n/a Synthesised by Dr Simon A. Osborne, LifeArc
Cryo-FIB specific autogrid rims Thermo Fisher Scientific 1205101
E64 Sigma E3132
Emitech K100X glow discharge unit Quorum n/a
Gibco RPMI 1640 media Thermo Fisher Scientific 12633012 Formulation used for culturing is custom made (REF 041-91762 A) and includes Albumax, glutamine, HEPES and hypoxanthine supplements
Giemsa Stain VWR International 350864X
Glass slides Thermo Fisher Scientific 11562203
Grid boxes Sub-angstrom PB For clipped grids
Grid boxes Thermo Fisher Scientific n/a For clipped grids – direct quote from Thermo Fisher Scientific
Grid boxes Agar Scientific AGG3727
Home-made manual plunge freezing rig n/a n/a With an insulated ethane pot (high-density foam) and liquid nitrogen bath (polystyrene) on a bench top in a containment facility.
Human blood n/a n/a UK National Blood and Transplant service
JEOL 4700F Z JSM with a Leica VCT500 stage cooling system JEOL n/a FIB-SEM
Leica EM ACE600 with a VCT500 cryostage Leica n/a sputter coater
Leica EM ACE900 Leica n/a e-beam rotary coater. In a humidity controlled room.
Linkam cryo-stage for light microscope Linkam Model No. CMS196 Cassettes for clipped and un-clipped grids. In a humidity controlled room.
Methanol Sigma 179957
Nikon Eclipse E200 light microscope Nikon n/a with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.
Percoll VWR International 17-0891-01 Solution for percoll cushion is 35 ml 10x PBS, 150 ml RPMI 1640 media and 315 ml Percoll
Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM Finder grids Quantifoil N1-C17nCuH2-01 100 pack
Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM grids Quantifoil N1-C17nCu20-01 100 pack
Quorum PP3010 prep-chamber Quorum n/a sputter coater
Scios dual beam equipped with a Quorum PP3010 transfer stage. FEI n/a FIB-SEM
Staedtler Lumocolor fine black permanent marker pen Viking Direct ND538522
TFS Titan Krios 300 kV TEM Thermo Fisher Scientific n/a TEM equipped with a K2 or K3 camera.
Whatmann grade 1 filter paper Sigma WHA1001150
Zeiss Axio Scope A1 light microscope Zeiss n/a with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baumeister, W. From proteomic inventory to architecture. FEBS Letters. 579 (4), 933-937 (2005).
  2. Rigort, A., Villa, E., Bäuerlein, F. J. B., Engel, B. D., Plitzko, J. M. Integrative approaches for cellular cryo-electron tomography: Correlative imaging and focused ion beam micromachining. Methods in Cell Biology. 111, 259-281 (2012).
  3. Oikonomou, C. M., Chang, Y. W., Jensen, G. J. A new view into prokaryotic cell biology from electron cryotomography. Nature Reviews Microbiology. 14, 205-220 (2016).
  4. Wagner, F. R., et al. Preparing samples from whole cells using focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Nature Protocols. 15 (6), 2041-2070 (2020).
  5. Giannuzzi, L. A., Stevie, F. A. A review of focused ion beam milling techniques for TEM specimen preparation. Micron. 30 (3), 197-204 (1999).
  6. Narayan, K., Subramaniam, S. Focused ion beams in biology. Nature Methods. 12 (11), 1021-1031 (2015).
  7. Rigort, A., et al. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. Proceedings of the National Acadamy of Science of the United States of America. 109 (12), 4449-4454 (2012).
  8. Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy. Nature Methods. 4 (3), 215-217 (2007).
  9. Villa, E., Schaffer, M., Plitzko, J. M., Baumeister, W. Opening windows into the cell: Focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Current Opinion in Structural Biology. 23 (5), 771-777 (2013).
  10. Wang, K., Strunk, K., Zhao, G., Gray, J. L., Zhang, P. 3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 180 (2), 318-326 (2015).
  11. de Winter, D. A. M., et al. In-situ integrity control of frozen-hydrated, vitreous lamellas prepared by the cryo-focused ion beam-scanning electron microscope. Journal of Structural Biology. 183 (1), 11-18 (2013).
  12. Schaffer, M., et al. A cryo-FIB lift-out technique enables molecular-resolution cryo-ET within native Caenorhabditis elegans tissue. Nature Methods. 16 (8), 757-762 (2019).
  13. Mahamid, J., et al. Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery. Science. 351 (6276), 969-972 (2016).
  14. Albert, S., et al. Proteasomes tether to two distinct sites at the nuclear pore complex. Proceedings of the National Acadamy of Science of the United States of America. 114 (52), 13726-13731 (2017).
  15. Guo, Q., et al. In situ structure of neuronal C9orf72 poly-GA aggregates reveals proteasome recruitment. Cell. 172 (4), 696-705 (2018).
  16. Schaffer, M., et al. Optimized cryo-focused ion beam sample preparation aimed at in situ structural studies of membrane proteins. Journal of Structural Biology. 197 (2), 73-82 (2017).
  17. Szwedziak, P., Wang, Q., Bharat, T. A. M., Tsim, M., Löwe, J. Architecture of the ring formed by the tubulin homologue FtsZ in bacterial cell division. eLife. 3, 04601 (2014).
  18. Carlson, L. A., et al. Cryo electron tomography of native HIV-1 budding sites. PLOS Pathogens. 6 (11), 1001173 (2010).
  19. Klein, S., et al. SARS-CoV-2 structure and replication characterized by in situ cryo-electron tomography. Nature Communications. 11 (1), 5885 (2020).
  20. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: Bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130 (5), 877-889 (2008).
  21. Schertel, A., et al. Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens. Journal of Structural Biology. 184 (2), 355-360 (2013).
  22. Murphy, G. E., et al. Correlative 3D imaging of whole mammalian cells with light and electron microscopy. Journal of Structural Biology. 176 (3), 268-278 (2012).
  23. Heymann, J. A. W., et al. Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope. Journal of Structural Biology. 155 (1), 63-73 (2012).
  24. Spehner, D., et al. Cryo-FIB-SEM as a promising tool for localizing proteins in 3D. Journal of Structural Biology. 211 (1), 107528 (2020).
  25. Kamino, T., Yaguchi, T., Ohnishi, T., Ishitani, T., Osumi, M. Application of a FIB-STEM system for 3D observation of a resin-embedded yeast cell. Journal of Electron Microscopy. 53 (5), 563-566 (2004).
  26. Han, H., Zuber, B., Dubochet, J. Compression and crevasses in vitreous sections under different cutting conditions. Journal of Microscopy. 230, 167-171 (2008).
  27. Matias, V. R. F., Al-amoudi, A., Dubochet, J., Beveridge, T. J. Cryo-transmission electron microscopy of frozen-hydrated sections of Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 185 (20), 6112-6118 (2003).
  28. Al-Amoudi, A., Studer, D., Dubochet, J. Cutting artefacts and cutting process in vitreous sections for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 150 (1), 109-121 (2005).
  29. Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. The EMBO Journal. 23 (18), 3583-3588 (2004).
  30. Bouchet-Marquis, C., Dubochet, J., Fakan, S. Cryoelectron microscopy of vitrified sections: A new challenge for the analysis of functional nuclear architecture. Histochemistry and Cell Biology. 125 (1-2), 43-51 (2006).
  31. Hayles, M. F., et al. The making of frozen-hydrated, vitreous lamellas from cells for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 172 (2), 180-190 (2010).
  32. Dubochet, J., Adrian, M., Chang, J. -. J., Lepault, J., McDowall, A. W. Cryoelectron microscopy of vitrified specimens. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. , 114-131 (1987).
  33. Hsieh, C., Schmelzer, T., Kishchenko, G., Wagenknecht, T., Marko, M. Practical workflow for cryo focused-ion-beam milling of tissues and cells for cryo-TEM tomography. Journal of Structural Biology. 185 (1), 32-41 (2014).
  34. Harapin, J., et al. Structural analysis of multicellular organisms with cryo-electron tomography. Nature Methods. 12 (7), 634-636 (2015).
  35. Rubino, S., et al. A site-specific focused-ion-beam lift-out method for cryo Transmission Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 180 (3), 572-576 (2012).
  36. Duyvesteyn, H. M. E., et al. Machining protein microcrystals for structure determination by electron diffraction. Proceedings of the National Acadamy of Science of the United States of America. 115 (38), 9569-9573 (2018).
  37. Blackman, M. J. Purification of Plasmodium falciparum merozoites for analysis of the processing of merozoite surface protein-1. Microbes as Tools for Cell Biology. 45, 213-220 (1995).
  38. Hagen, W. J. H., Wan, W., Briggs, J. A. G. Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging. Journal of Structural Biology. 197 (2), 191-198 (2017).
  39. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2 – anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  40. Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980 (2015).
  41. Rohou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).
  42. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  43. Turoňová, B., Schur, F. K. M., Wan, W., Briggs, J. A. G. Efficient 3D-CTF correction for cryo-electron tomography using NovaCTF improves subtomogram averaging resolution to 3.4 Å. Journal of Structural Biology. 199 (3), 187-195 (2017).
  44. Arnold, J., et al. Site-specific cryo-focused ion beam sample preparation guided by 3d correlative microscopy. Biophysical Journal. 110 (4), 860-869 (2016).
  45. Riglar, D. T., et al. Super-resolution dissection of coordinated events during malaria parasite invasion of the human erythrocyte. Cell Host & Microbe. 9 (1), 9-20 (2011).
  46. Hanssen, E., et al. Electron tomography of Plasmodium falciparum merozoites reveals core cellular events that underpin erythrocyte invasion. Cellular Microbiology. 15 (9), 1457-1472 (2013).
  47. Buckley, G., et al. Automated cryo-lamella preparation for high-throughput in-situ structural biology. Journal of Structural Biology. 210 (2), 107488 (2020).
  48. Zachs, T., et al. Fully automated, sequential focused ion beam milling for cryo-electron tomography. eLife. 9, 52286 (2020).
  49. Fuest, M., et al. In situ microfluidic cryofixation for cryo focused ion beam milling and cryo electron tomography. Scientific Reports. 9 (1), 19133 (2019).
  50. Toro-Nahuelpan, M., et al. Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies. Nature Methods. 17 (1), 50-54 (2020).
  51. Wolff, G., et al. Mind the gap: Micro-expansion joints drastically decrease the bending of FIB-milled cryo-lamellae. Journal of Structural Biology. 208 (3), 107389 (2019).

Tags

Vitreous LamellaeCryo-electron TomographyPlasmodium FalciparumRed Blood CellsMalariaProtein ComplexesCryo-FIB-SEMOrganoplatinum CoatingIon Beam Milling

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bisson, C., Hecksel, C. W., Gilchrist, J. B., Carbajal, M. A., Fleck, R. A. Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography. J. Vis. Exp. (174), e62350, doi:10.3791/62350 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image