使用膜结合IL-21修饰B细胞系的自然杀伤（NK）和CAR-NK细胞扩增方法

本协议中的人体组织和血液相关工作遵循罗格斯大学机构审查委员会（IRB）的指导方针 1.来自肝组织的NK细胞扩增（第0天），如图1所示。 注意：初始细胞数量和活力与器官切除后的时间和初始组织样本量密切相关。然而，如果将组织置于30mL的Hank平衡盐溶液（HBSS）中，并在冰上或4°C的冰箱中过夜，NK细胞仍然可以在高纯度和活力下扩增至24小时。 使用无菌手术设备确定活组织区域，从组织和切片中获取淋巴细胞。 将组织放入 30 mL HBSS（不含钙或镁）中并保持在冰上，直到准备好准备分离。 在生物安全柜内使用无菌剃须刀片或剪刀和镊子将组织切成 <0.5 厘米的立方体。 通过在 HBSS 中稀释 10 倍原液（10 x 胶原酶 IV：10 mg/mL 或 ~200 U/mL）制备 1x 胶原酶 IV 溶液 （1 mg/mL）。 将切碎的组织碎片放入组织解离管中。用不超过 4 g 的组织填充试管，并将组织碎片浸入 ~10 mL 的 1x 胶原酶 IV 中。注意：不建议使用DNase I，因为它可能会略微降低NK的活力和产量。请参阅 材料表 ，了解所使用的特定组织解离管。 将组织解离管放入组织解离器中，并在37°C下混合以彻底切碎组织。注意：对于肝组织，这可能需要30分钟以上。对于更易碎的组织，大约 15 分钟可能就足够了。请参阅 材料表 ，了解特定的组织解离管和所使用的组织解离剂。 取出组织解离管，并使用 5 mL 注射器的后端通过 40 μm 尼龙细胞过滤器研磨。收集淋洗液并丢弃大的未消化片段。 在室温下以400× g 旋转淋洗液5分钟。吸出上清液。 将细胞沉淀重悬于30%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）涂层的二氧化硅中，以去除脂肪细胞，否则脂肪细胞会污染最终淋巴细胞部分。要制备 1x PVP 涂层二氧化硅，请在 10x PBS 中使用 9：1 稀释的 PVP 涂层二氧化硅。注意：请参阅 材料表 ，了解所使用的特定 PVP 涂层二氧化硅。 要制备 30% PVP 涂层二氧化硅，请用 PBS/HBSS 稀释 1x PVP 涂层二氧化硅。 在室温下以400× g 旋转细胞沉淀5分钟。吸出上清液。 将细胞沉淀重悬于 9 mL 的 R-10 培养基中。注：有关 R-10 介质的组成，请参阅材料表 小心地将细胞悬液分层在 4 mL 的 Ficoll 或淋巴细胞分离培养基上，以将淋巴细胞与红细胞和多形核细胞分离。 通过在室温下以400 x g 离心23分钟来分离层，同时关闭加速和制动器或以最低设置。小心地倒出中上层并收获含有组织浸润淋巴细胞的间期。 用 10 mL 培养基冲洗细胞，然后进行细胞计数、流式细胞术、细胞等分和冷冻或原代 NK 扩增方案。 2.来自PBMC（或CB或器官组织）的原代NK细胞扩增（第0天），如图 2所示。 在37°C水浴中解冻冷冻的PBMC和冷冻的辐照饲养层细胞。 分别用 10 mL R-10 培养基以 400 x g 离心 5 分钟，洗涤 PBMC 和 100 伽马辐照（Gy 辐照）221-mIL-21 细胞。 保存 1 x 10 6 个PBMC 细胞用于流式细胞术。注意：初始NK细胞纯度是计算NK细胞扩增率的重要因素。 将细胞重悬于 1 mL 的 R-10 培养基中。使用台盼蓝计数细胞。 在特殊的6孔板中将5x 10 6细胞的PBMC与10 x 106细胞的100 Gy辐照221-mIL-21细胞混合（参见材料表）。 加入 30 mL 补充人 IL-2 （200 U/mL） 和人 IL-15 （5 ng/mL） 的 R-10 培养基（参见 材料表）。 将特殊的6孔板在37°C与5%CO2孵育。 用补充人IL-2（200U / mL）和人IL-15（5ng / mL）的R-10培养基替换培养基，以每3-4天维持一次NK细胞。注意：保持每孔小于20 x 106 个细胞，以便在每次更换培养基时进一步扩增。为获得最佳活力，请确保每个孔中的总细胞数不超过100 x 106 个细胞。 记录细胞总数，活力，每3-4天进行一次流式细胞术以计算NK细胞扩增率。 3.附着293T细胞（第2天），如图 2所示。 在每个处理的 100 mm 板中将 1.8 x 106 293T 细胞拆分在 11 mL D-10 培养基中。注：有关 D-10 介质的组成，请参阅材料表 在37°C下用5%CO2孵育293T细胞。 4. 逆转录病毒转染（第3天） 在 1.7 mL 管中，将 470 μL 还原血清培养基与 30 μL 转染试剂混合。注意：有关所使用的特定还原血清培养基和转染试剂，请参阅 材料表 。 在单独的 1.7 mL 管中，将 2.5 μg pRDF 质粒、3.75 μg Pegpam3 质粒和 2.5 μg CAR 构建体加入还原的血清培养基中，使最终体积为 500 μL。 滴加步骤4.1和4.2中的溶液。 将试管在室温下孵育15分钟。 在第1天以滴加方式将步骤4.4中的1mL混合物加入293T细胞板中。 将板在37°C下用5%CO2 孵育48-72小时。 5. 瑞连蛋白平板包衣（第3天） 用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 稀释 retronectin 蛋白至终浓度为 50-100 μg/mL。 将 500 μL 稀释的 retronectin 加入未处理的 24 孔板的每个孔中（每个 CAR 构建体 5 个孔）。使用封口膜密封板，并将板在4°C孵育过夜。 6. 转导（第4天） 在4°C下以2103× g 离心再生连蛋白板30分钟。 弃去上清液。 用 1 mL R-10 培养基封闭 24 孔板的每个孔。 将板在37°C与5%CO2 孵育1小时。 将离心机预热至32°C，同时封闭再生连蛋白板。 通过使用0.45μm过滤器过滤转染的293T细胞来收集逆转录病毒上清液。 将 2 mL 过滤后的逆转录病毒上清液等分到每个孔中。 将24孔板在32°C下以2103× g 离心2小时。 在板离心过程中，从第 0 天收集扩增的 PBNK 细胞并使用台盼蓝对细胞进行计数。注意：通过添加补充有IL-2（200 U / mL）和IL-15（5 ng / mL）的R-10培养基继续扩增PBNK细胞。 用补充有 IL-2 （200 U/mL） 和 IL-15 （5 ng/mL） 的 R-10 培养基稀释膨胀的 PBNK 细胞至 2.5 x 10 5-5 x 10 5 个细胞/mL（每孔0.5 x 106-1 x 10 6 个细胞）。注意：记录总细胞数，活力，并保存5 x 105 个扩增的PBNK细胞用于流式细胞术，因为这些值对于确定NK细胞扩增速率很重要。 离心后，从每个孔中部分吸出逆转录病毒上清液。注意：不要完全吸出，即每孔留下约100μL逆转录病毒上清液，因为这会降低转导效率。 将步骤6.8中稀释的PBNK细胞中的2 mL等分到每个孔中。 将板在32°C下以600× g 离心10分钟。 将板在37°C下用5%CO2 孵育48-72小时。注意：请勿对板进行封口膜处理。 7. CAR-NK细胞收集（第6天或第7天），如图 2所示。 轻轻收集 24 孔板中的细胞，并将细胞转移到 50 mL 离心管中注意：尽量不要产生气泡，因为这会导致细胞活力下降。 将试管以400× g 离心5分钟。 用 1 mL R-10 培养基重悬沉淀，并使用台盼蓝计数细胞。注意：保存5 x 105 个细胞用于流式细胞术以确定转导效率。 将重悬的细胞转移到含有 30 mL 补充有 IL-2 （200 U/mL） 和 IL-15 （5 ng/mL） 的 R-10 培养基的特殊 6 孔板中。 将特殊的6孔板在37°C与5%CO2孵育。 更换补充有 IL-2 （200 U/mL） 和 IL-15 （5 ng/mL） 的 R-10 培养基，以维持每 3 – 4 天一次的 NK 细胞。注意：保持每孔小于20 x 106 个细胞，以便在每次更改时进一步扩增。为获得最佳活力，请确保每个孔中的总细胞数不超过100 x 106 个细胞。 记录细胞总数、活力，每3-4天进行一次流式细胞术，以计算NK细胞扩增率。 使用细胞进行适当的 体外 或 体内 测定。注意： 离体 扩增的PBNK和CAR-NK细胞可以在37°C培养箱中培养约4周。 通过流式细胞术在第7天，第11天，第14天，第18天和第21天检查NK细胞数量和纯度。