طريقة تمدد الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) و CAR-NK باستخدام خط الخلية B المعدل بالغشاء IL-21
Summary
هنا ، نقدم طريقة لتوسيع القاتل الطبيعي للدم المحيطي (PBNK) ، والخلايا القاتلة الطبيعية من أنسجة الكبد ، ومستقبلات المستضد الخيمري (CAR) – الخلايا القاتلة الطبيعية المشتقة من خلايا الدم الطرفية أحادية النواة (PBMCs) أو دم الحبل السري (CB). يوضح هذا البروتوكول توسع خلايا NK و CAR-NK باستخدام خلايا التغذية 221-mIL-21 بالإضافة إلى النقاء الأمثل لخلايا NK الموسعة.
Abstract
أصبح العلاج بالخلايا المناعية المعدلة لمستقبلات المستضد الخيمري (CAR) علاجا ناشئا للسرطانات والأمراض المعدية. يعد العلاج المناعي القائم على NK ، وخاصة خلية CAR-NK ، أحد أكثر التطورات الواعدة “الجاهزة” دون سمية شديدة تهدد الحياة. ومع ذلك ، فإن عنق الزجاجة لتطوير علاج CAR-NK الناجح هو تحقيق أعداد كافية من خلايا CAR-NK غير الشاملة وطويلة العمر “الجاهزة” من طرف ثالث. هنا ، قمنا بتطوير طريقة توسيع CAR-NK جديدة باستخدام خط الخلايا البائية المحول لفيروس Epstein-Barr (EBV) الذي يعبر عن شكل غشاء معدل وراثيا من interleukin-21 (IL-21). في هذا البروتوكول ، يتم توفير إجراءات خطوة بخطوة لتوسيع الخلايا القاتلة الطبيعية و CAR-NK من دم الحبل السري والدم المحيطي ، وكذلك أنسجة الأعضاء الصلبة. سيعزز هذا العمل بشكل كبير التطوير السريري للعلاج المناعي CAR-NK.
Introduction
الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) هي مجموعة فرعية مهمة من الخلايا الليمفاوية التي تعبر عن CD56 وتفتقر إلى التعبير عن علامة الخلايا التائية ، CD3 1,2. تصنف الخلايا القاتلة الطبيعية التقليدية على أنها خلايا مناعية فطرية مسؤولة عن المراقبة المناعية للخلايا المصابة بالفيروس والخلايا السرطانية. على عكس الخلايا التائية ، تتعرف الخلايا القاتلة الطبيعية على الخلايا المصابة أو الخبيثة باستخدام CD16 أو مستقبلات تنشيط أخرى ولا تتطلب تكوين مركب بين ببتيدات المستضد وجزيئات معقد التوافق النسيجي الرئيسي (MHC) من الفئة الأولى 3,4. أظهرت التحقيقات السريرية الحديثة باستخدام خلايا مستقبلات المستضد الخيمري (CAR) -NK لعلاج السرطانات المنتكسة أو المقاومة للحرارة CD19 (سرطان الغدد الليمفاوية اللاهودجكين أو سرطان الدم الليمفاوي المزمن [CLL]) مزايا السلامة البارزة لخلايا CAR-NK5. على سبيل المثال ، يرتبط تسريب خلية CAR-NK بالحد الأدنى أو الكسب غير المشروع مقابل مرض المضيف (GVHD) ، والسمية العصبية ، والسمية القلبية ، ومتلازمة إطلاق السيتوكين (CRS) 6،7،8،9،10. ومع ذلك ، أظهرت الطرق التقليدية لتوسيع الخلايا القاتلة الطبيعية البشرية أنماطا ظاهرية شاملة مع قتل قوي بين الأشقاء ونقص في التيلومير ، مما يمثل تحديا كبيرا في الحصول على عدد كاف من الخلايا القاتلة الطبيعية الوظيفية للعلاج المناعي بالتبني11.
للتغلب على هذه التحديات ، تم تطوير طريقة لتوسيع الخلايا القاتلة الطبيعية الأولية مباشرة من خلايا الدم الطرفية أحادية النواة غير المجزأة (PBMCs) أو دم الحبل السري (CB) باستخدام خط خلية 721.221 (المشار إليه فيما يلي ، 221) ، وهو خط خلايا بائية بائية بوية بشرية مع تعبير منخفض عن جزيئات MHC من الفئة الأولى3. أظهرت الدراسات السابقة أهمية IL-21 في توسع الخلايا القاتلة الطبيعية. لذلك ، تم تطوير IL-21 المرتبط بالغشاء المعدل وراثيا والذي يعبر عن نسخة من خط الخلية 721.221 (بدءا من الآن ، 221-mIL-21)11،12،13،14،15. أظهرت النتائج أن 221-mIL-21 الخلايا القاتلة الطبيعية الأولية الموسعة بالخلايا المغذية قد تم توسيعها إلى متوسط >40000 ضعف مع نقاء الخلايا القاتلة الطبيعية العالي المستمر لمدة 2-3 أسابيع تقريبا. يمكن العثور على معلومات إضافية بشأن تطبيق هذا البروتوكول في Yang et al.16.
يهدف هذا البروتوكول إلى إظهار الإجراء التدريجي للتوسع الجديد لخلايا PBNK و CBNK والخلايا المشتقة من الأنسجة NK و CAR-NK خارج الجسم الحي.
Protocol
Representative Results
Discussion
تستخدم معظم منتجات CAR-NK الحالية في التجارب السريرية خطوط الخلايا القاتلة الطبيعية 17 ، مثل NK-92 ، وهو خط خلوي معزول من مريض سرطان الغدد الليمفاوية اللاهودجكين18 ، NK-92MI ، IL-2 خط خلية NK-92 المستقل19 ، و NKL ، معزول عن مريض الخلايا الليمفاوية الحبيبية الكبيرة20 ، حيث أن خطوط الخلايا هذه تتكاثر بسهولة للمنتجات “الجاهزة”. ومع ذلك ، فإن خطوط الخلايا هذه ، على سبيل المثال ، خلايا NK-92 ، لها كفاءات سريرية هامشية وتوسع في الجسم الحي ، لأنها تتطلب تشعيعا قبل التسريب ، مما يحد من انتشارها وسميتها الخلوية في الجسم الحي21. بالنظر إلى هذه الأسباب ، يتم حاليا استكشاف استراتيجيات مختلفة لتوسيع الخلايا القاتلة الطبيعية الأولية من عدة مصادر ، بما في ذلك الدم المحيطي ، CB ، نخاع العظم (BM) ، الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (HSCs) ، الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) ، وأنسجة الورم21،22،23. على سبيل المثال ، يمكن توسيع الخلايا القاتلة الطبيعية خارج الجسم الحي باستخدام الإنترلوكينات بما في ذلك IL-15 و IL-18 و IL-21. خطوط الخلايا الليمفاوية مثل خلايا K562 أو خطوط الخلايا الليمفاوية المحولة لفيروس إبشتاين بار مثل 721.221 خلية ، تستخدم أيضا لتوسيع الخلايا القاتلة الطبيعية16. ومع ذلك ، فإن الاستراتيجيات المذكورة أعلاه غالبا ما تولد عددا غير كاف من الخلايا القاتلة الطبيعية لنقل العلاج المناعي CAR-NKبالتبني 22,24. للمساعدة في حل المشكلة ، تظهر الدراسة هنا بروتوكولا لتوسيع الخلايا القاتلة الطبيعية خارج الجسم الحي باستخدام خط خلية EBV المعدل وراثيا ، 221-mIL-21 خلايا مغذية.
تم تحسين منهجية التوسع باستخدام خلايا التغذية 221-mIL-21 الموضحة في هذا البروتوكول لتوسيع الخلايا القاتلة الطبيعية بمعدل توسع لا يقل عن 10 إلى 100 ضعف أعلى من خطوط خلايا سرطان الدم الأخرى ، بما في ذلك HL-60 و OCl-AML3 التعبير عن الغشاء IL-21 و K562 و K652-mIL21 معبرا عن OX40 ligand22،24،25. يتم تقييم تعبير CAR أيضا لمدة 2 أسابيع تقريبا خارج الجسم الحي. والأهم من ذلك ، يمكن تطبيق استراتيجية توسيع الخلايا المغذية 221-mIL-21 لتوسيع الخلايا القاتلة الطبيعية من مصادر مختلفة ، بما في ذلك PBMCs و CB والأعضاء الصلبة مثل الكبد ، دون خطوة تخصيب NK الأولية. على الرغم من أن نظام التغذية 221-mIL-21 لا يعتمد على المانحين مثل خطوط الخلايا المغذية المذكورة أعلاه ، إلا أنه ليس مستقلا تماما عن الجهات المانحة. في المتوسط ، يمكن لنظام التوسع 221-mIL-21 تحقيق 90٪ من نقاء الخلايا القاتلة الطبيعية مع ارتفاع عدد الخلايا القاتلة الطبيعية ، مع ما يقرب من <5٪ من تلوث الخلايا التائية في اليوم 14 بعد التوسع. لذلك ، للقضاء على احتمالات تلوث الخلايا التائية ، من الضروري عزل الخلايا القاتلة الطبيعية من العينات التي تم الحصول عليها قبل التوسع خارج الجسم الحي أو استخدام نظام اختيار CD3 + للقضاء على الخلايا التائية بعد التوسع خارج الجسم الحي.
أحد الانتقادات في استخدام نظام توسيع الخلايا القاتلة الطبيعية هو أن الخلايا المغذية ربما لم يتم القضاء عليها بالكامل بعد التوسع أو قبل نقل الدم ، مما قد ينطوي على مخاوف تنظيمية كبيرة ؛ لذلك ، فإن الاستئصال الكامل للخلايا المغذية قبل نقل الدم أمر بالغ الأهمية. ومع ذلك ، فإن التجارب السريرية الأخيرة ل CAR-NK التي تم فيها استخدام خلايا التغذية K562-mIL21-4-1BBL لتوسيع خلايا CBNK خارج الجسم الحي 24,25 لم تظهر أي مضاعفات مقلقة. علاوة على ذلك ، أظهرت بياناتنا الأولية انخفاضا تدريجيا في عدد السكان المشععين 221-mIL-21 مع تقدم التوسع (البيانات غير معروضة). ومع ذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات المكثفة لتنفيذ طريقة التوسع هذه في بيئة سريرية. بشكل جماعي ، يساعد نظام التوسع 221-mIL-21 في حل التحدي المتمثل في توسيع خلايا CAR-NK الأولية ، وبالتالي سيساهم بشكل كبير في الاستخدام الأوسع للعلاج المناعي القائم على الخلايا CAR-NK في المستقبل القريب.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر أعضاء مختبر ليو (الدكتور هسيانغ تشي تسنغ والدكتور شيونينغ وانغ والدكتور تشيه هسيونغ تشن) على تعليقاتهم على المخطوطات. نود أن نشكر الدكتور جيانبيترو دوتي على ناقلات SFG والدكتور إريك لونج على خلايا 721.221. تم دعم هذا العمل جزئيا من HL125018 (D. Liu) و AI124769 (D. Liu) و AI129594 (D. Liu) و AI130197 (D. Liu) و Rutgers-Health Advance Funding (برنامج NIH REACH) و U01HL150852 (R. Panettieri و S. Libutti و R. Pasqualini) و S10OD025182 (D. Liu) وتمويل بدء تشغيل كلية الطب بجامعة روتجرز – نيو جيرسي لمختبر D. Liu.
Materials
| 100 mm surface treated sterile tissue culture dishes | VWR | 10062-880 | For transfection |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | For transfection |
| 6-well G-REX plate | Wilson Wolf | 80240M | For NK cell expansion |
| AF647-conjugated AffiniPure F(ab')2 fragment goat anti-human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 109-606-088 | For flow cytometry |
| CAR construct in SFG vector | Generated in Dr. Dongfang Liu's lab | For transfection | |
| Collagenase IV | Sigma | C4-22-1G | For TILs isolation |
| Cryopreserve media Ingredient: Fetal Bovine Serum (FBS) |
Corning | 35-010-CV | 90% |
| Cryopreserve media Ingredient: Dimethyl sulfoxide (DMSO) |
Sigma | D2050 | 10% |
| D-10 media Ingredient: DMEM |
VWR | 45000-304 | |
| D-10 media Ingredient: Fetal Bovine Serum (FBS) |
Corning | 35-010-CV | 10% |
| D-10 media Ingredient: Penicillin Streptomycin |
VWR | 45000-652 | 1% |
| FastFlow & Low Binding Millipore Express PES Membrane | Millex | SLHPR33RB | For transduction |
| Genejuice transfection reagent | VWR | 80611-356 | For transfection |
| gentleMACS C-tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | For TILs isolation |
| gentleMACS Octo | Miltenyi Biotec | Quote | For TILs isolation |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS – w/o calcium or magnesium) | ThermoFisher | 14170120 | For TILs isolation |
| Human IL-15 | Peprotech | 200-15 | For NK cell expansion |
| Human IL-2 | Peprotech | 200-02 | For NK cell expansion |
| Irradiated 221-mIL21 feeder cells | Generated in Dr. Dongfang Liu's lab | Frozen in cryopreserve media | |
| Lymphocyte Separation Media | Corning | 25-072-CV | For TILs isolation |
| OPTI-MEM | ThermoFisher | 31895 | For transfection |
| PE anti-human CD3 clone HIT3a | Biolegend | 300308 | For flow cytometry |
| PE/Cy7 anti-human CD56 (NCAM) clone 5.1H11 | BioLegend | 362509 | For flow cytometry |
| Pegpam3 plasmid | Generated in Dr. Dongfang Liu's lab | For transfection | |
| Percoll | GE Healthcare | 17089101 | For TILs isolation |
| Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) | New York Blood Center | Isolated from plasma of healthy donors, frozen in cryopreserve media | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | For transduction |
| pRDF plasmid | Generated in Dr. Dongfang Liu's lab | For transfection | |
| R-10 media Ingredients: RPMI 1640 |
VWR | 45000-404 | |
| R-10 media Ingredient: L-glutamine |
VWR | 45000-304 | 1% |
| R-10 media Ingredient: Penicillin Streptomycin |
VWR | 45000-652 | 1% |
| R-10 media Ingredient: Fetal Bovine Serum (FBS) |
Corning | 35-010-CV | 10% |
| Retronectin | Generated in Dr. Dongfang Liu's lab | home-made | For transduction |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | For cell counting |
| Untreated 24-well plate | Fisher Scientific | 13-690-071 | For transduction |
References
- Van Acker, H. H., et al. CD56 in the immune system: More than a marker for cytotoxicity. Frontiers in Immunology. 8, 892 (2017).
- Caligiuri, M. A. Human natural killer cells. Blood. 112 (3), 461-469 (2008).
- Shimizu, Y., et al. Transfer and expression of three cloned human non-HLA-A,B,C class I major histocompatibility complex genes in mutant lymphoblastoid cells. Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 85 (1), 227-231 (1988).
- Wu, J., Lanier, L. L. Natural killer cells and cancer. Advances in Cancer Research. 90, 127-156 (2003).
- Liu, E., et al. Use of CAR-transduced natural killer cells in CD19-positive lymphoid tumors. The New England Journal of Medicine. 382 (6), 545-553 (2020).
- Alonso-Camino, V., et al. Efficacy and toxicity management of CAR-T-cell immunotherapy: a matter of responsiveness control or tumour-specificity. Biochemical Society Transactions. 44 (2), 406-411 (2016).
- Bonifant, C. L., Jackson, H. J., Brentjens, R. J., Curran, K. J. Toxicity and management in CAR T-cell therapy. Molecular Therapy Oncolytics. 3, 16011 (2016).
- Kalaitsidou, M., Kueberuwa, G., Schitt, A., Gilham, D. E. CAR T-cell therapy: toxicity and the relevance of preclinical models. Immunotherapy. 7 (5), 487-497 (2015).
- Gust, J., et al. Endothelial activation and blood-brain barrier disruption in neurotoxicity after adoptive immunotherapy with CD19 CAR-T cells. Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).
- Hay, K. A., et al. Kinetics and biomarkers of severe cytokine release syndrome after CD19 chimeric antigen receptor-modified T-cell therapy. Blood. 130 (21), 2295-2306 (2017).
- Zhang, Y., et al. In vivo kinetics of human natural killer cells: the effects of ageing and acute and chronic viral infection. Immunology. 121 (2), 258-265 (2007).
- Vidard, L., et al. CD137 (4-1BB) Engagement fine-tunes synergistic IL-15- and IL-21-driven nk cell proliferation. Journal of Immunology. 203 (3), 676-685 (2019).
- Venkatasubramanian, S., et al. IL-21-dependent expansion of memory-like NK cells enhances protective immune responses against Mycobacterium tuberculosis. Mucosal Immunology. 10 (4), 1031-1042 (2017).
- Ojo, E. O., et al. Membrane bound IL-21 based NK cell feeder cells drive robust expansion and metabolic activation of NK cells. Scientific Reports. 9 (1), 14916 (2019).
- Denman, C. J., et al. Membrane-bound IL-21 promotes sustained ex vivo proliferation of human natural killer cells. PLoS One. 7 (1), 30264 (2012).
- Yang, Y., et al. Superior expansion and cytotoxicity of human primary NK and CAR-NK cells from various sources via enriched metabolic pathways. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 18, 428-445 (2020).
- Liu, S., et al. NK cell-based cancer immunotherapy: from basic biology to clinical development. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 7 (2021).
- Gong, J. H., Maki, G., Klingemann, H. G. Characterization of a human cell-line (Nk-92) with phenotypical and functional-characteristics of activated natural-killer-cells. Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).
- Tam, Y. K., et al. Characterization of genetically altered, interleukin 2-independent natural killer cell lines suitable for adoptive cellular immunotherapy. Human Gene Therapy. 10 (8), 1359-1373 (1999).
- Robertson, M. J., et al. Characterization of a cell line, NKL, derived from an aggressive human natural killer cell leukemia. Experimental Hematology. 24 (3), 406-415 (1996).
- Hu, Y., Tian, Z. G., Zhang, C. Chimeric antigen receptor (CAR)-transduced natural killer cells in tumor immunotherapy. Acta Pharmacologica Sinica. 39 (2), 167-176 (2018).
- Tseng, H. C., et al. Efficacy of anti-CD147 chimeric antigen receptors targeting hepatocellular carcinoma. Nature Communications. 11 (1), 4810 (2020).
- Easom, N. J. W., et al. IL-15 overcomes hepatocellular carcinoma-induced NK cell dysfunction. Frontiers in Immunology. 9, 1009 (2018).
- Granzin, M., et al. Highly efficient IL-21 and feeder cell-driven ex vivo expansion of human NK cells with therapeutic activity in a xenograft mouse model of melanoma. Oncoimmunology. 5 (9), 1219007 (2016).
- Liu, E. L., et al. Cord blood derived natural killer cells engineered with a chimeric antigen receptor targeting CD19 and expressing IL-15 have long term persistence and exert potent anti-leukemia activity. Blood. 126 (23), (2015).
