멤브레인 결합-IL-21-변형 B 세포주를 이용한 자연살해(NK) 및 CAR-NK 세포 확장 방법

이 프로토콜의 인체 조직 및 혈액 관련 작업은 Rutgers University Institutional Review Board (IRB)의 지침을 따릅니다. 1. 도 1과 같이 간 조직으로부터의 NK 세포 확장(Day 0). 참고: 초기 세포 수와 생존력은 장기 제거 이후 시간 및 초기 조직 샘플 양과 밀접한 관련이 있습니다. 그러나 조직을 행크 밸런스드 소금 용액 (HBSS) 30mL에 넣고 얼음이나 냉장고에서 밤새 4 ° C로 보관하면 NK 세포는 최대 24 시간 후에도 고순도와 생존력으로 확장 될 수 있습니다. 멸균 수술 장비를 사용하여 조직 및 절편에서 림프구를 얻기 위해 생존 가능한 조직 영역을 식별합니다. HBSS 30mL(칼슘 또는 마그네슘 제외)에 조직을 넣고 격리를 준비할 준비가 될 때까지 얼음 위에 두십시오. 생물 안전 캐비닛 내부의 멸균 면도날 또는 가위와 집게를 사용하여 조직을 <0.5cm 입방체로 만듭니다. HBSS에서 10x 스톡을 희석하여 1x 콜라게나제 IV 용액(10mg/mL)을 준비합니다(10x 콜라게나제 IV: 10mg/mL 또는 ~200U/mL). 다진 조직 조각을 조직 해리 튜브에 넣습니다. 튜브에 4g 이하의 조직을 채우고 조직 조각을 ~10mL의 1x 콜라게나제 IV에 담그십시오.참고: DNase I을 사용하면 NK 생존력과 수율이 약간 감소할 수 있으므로 사용하지 않는 것이 좋습니다. 사용되는 특정 조직 해리 튜브에 대한 재료 표를 참조하십시오. 조직 해리기 튜브를 조직 해리기에 넣고 37°C에서 혼합하여 조직을 완전히 다집니다.알림: 간 조직의 경우 30분 이상 걸릴 수 있습니다. 더 부서지기 쉬운 조직의 경우 약 15분이면 충분할 수 있습니다. 특정 조직 해리기 튜브 및 사용된 조직 해리기에 대한 재료 표를 참조하십시오. 조직 해리기 튜브를 제거하고 5mL 주사기의 백엔드를 사용하여 40μm 나일론 세포 스트레이너를 통해 분쇄합니다. 용리액을 수집하고 소화되지 않은 큰 조각을 버립니다. 실온에서 5분 동안 400 x g 의 용리액을 회전시킵니다. 상청액을 흡인하십시오. 세포 펠릿을 30% 폴리비닐피롤리돈(PVP) 코팅 실리카에 재현탁하여 최종 림프구 분획을 오염시킬 지방 세포를 제거합니다.1x PVP 코팅 실리카를 제조하려면 10x PBS에서 PVP 코팅 실리카를 9:1 희석하여 사용하십시오.알림: 사용된 특정 PVP 코팅 실리카에 대한 재료 표를 참조하십시오. 30% PVP 코팅 실리카를 제조하려면 1x PVP 코팅 실리카를 PBS/HBSS로 희석합니다. 실온에서 5분 동안 400 x g 에서 셀 펠릿을 회전시킵니다. 상청액을 흡인하십시오. 9mL의 R-10 배지에 세포 펠릿을 재현탁합니다.참고 : R-10 매체의 구성에 대해서는 재료 표를 참조하십시오. 4mL의 Ficoll 또는 림프구 분리 배지에 세포 현탁액을 조심스럽게 층층화하여 적혈구 및 다형 핵 세포에서 림프구를 분리합니다. 가속 및 브레이크를 끈 상태에서 실온에서 23분 동안 400 x g 에서 23분 동안 원심분리하거나 가장 낮은 설정에서 층을 분리합니다. 조심스럽게 상부 – 중간 층을 따라 내고 조직 침윤 림프구를 포함하는 간기를 수확하십시오. 10mL의 배지로 세포를 헹구고 세포 계수, 유세포 분석, 세포의 분취 및 동결 또는 1차 NK 확장 프로토콜을 진행합니다. 2. 그림 2와 같이 PBMC(또는 CB 또는 장기 조직)로부터의 1차 NK 세포 확장(Day 0). 동결된 PBMC를 동결시키고, 조사된 지지세포를 37°C 수조에서 해동시킨다. PBMC 및 100 감마선 조사된(Gy-irradiated) 221-mIL-21 세포를 400 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 10 mL의 R-10 배지로 별도로 세척하였다. 유동 세포분석을 위한 PBMC의 1 x 106 세포를 저장하십시오.참고: 초기 NK 세포 순도는 NK 세포 확장률을 계산하는 데 중요한 요소입니다. 1mL의 R-10 배지에 세포를 재현탁합니다. 트리판 블루를 사용하여 세포를 세십시오. 특별한 6 웰 플레이트에 있는 100 Gy 조사된 221-mIL-21 세포의 10 x 10 6 세포와 PBMC의 5x 106 세포를 섞으십시오 (물자의 표를 보십시오). 인간 IL-2 (200 U / mL) 및 인간 IL-15 (5 ng / mL)가 보충 된 R-10 배지 30 mL를 추가합니다 ( 재료 표 참조). 특수 6-웰 플레이트를 37°C에서 5%CO2로 배양한다. 3-4일마다 NK 세포를 유지하기 위해 인간 IL-2(200U/mL) 및 인간 IL-15(5ng/mL)가 보충된 R-10 배지로 배지를 교체합니다.알림: 각 배지 교체 시 추가 확장을 위해 웰당 20 x 106 셀 미만으로 유지하십시오. 최상의 생존력을 위해, 각 웰의 총 세포 수가 100 x 106 세포를 초과하지 않도록하십시오. 총 세포 수, 생존율을 기록하고 3-4일 간격으로 유세포 분석을 수행하여 NK 세포 확장률을 계산하였다. 3. 그림 2와 같이 293T 세포의 부착(Day 2). 처리된 100mm 플레이트당 11mL의 D-10 배지에서 1.8 x 106 293T 세포를 분할합니다.참고: D-10 매체의 구성에 대해서는 재료 표를 참조하십시오. 293T 세포를 37°C에서 5%CO2로 배양한다. 4. 레트로바이러스 형질감염(3일차) 1.7mL 튜브에 470μL의 환원된 혈청 배지와 30μL의 형질주입 시약을 혼합합니다.참고: 사용된 특정 환원 혈청 배지 및 형질주입 시약에 대해서는 재료 표를 참조하십시오. 별도의 1.7mL 튜브에서 SFG 벡터의 pRDF 플라스미드 2.5μg, Pegpam3 플라스미드 3.75μg 및 CAR 구축물 2.5μg을 환원된 혈청 배지에 추가하여 최종 부피가 500μL가 되도록 합니다. 4.1단계와 4.2단계의 용액을 적가하여 혼합합니다. 튜브를 실온에서 15분 동안 배양합니다. 단계 4.4의 혼합물 1 mL를 1일째에 293T 세포 플레이트에 적가한다. 플레이트를 37°C에서 5% CO2로 48-72시간 동안 배양합니다. 5. 레트로넥틴 플레이트 코팅 (3일차) 레트로넥틴 단백질을 인산염 완충 식염수(PBS)로 최종 농도 50-100μg/mL로 희석합니다. 희석된 레트로넥틴 500μL를 미처리 24-웰 플레이트(CAR 구축물당 5웰)의 각 웰에 첨가한다. 파라필름을 사용하여 플레이트를 밀봉하고 플레이트를 4°C에서 밤새 인큐베이션한다. 6. 형질 도입 (4 일차) 레트로넥틴 플레이트를 2103 x g 에서 4°C에서 30분 동안 원심분리한다. 상청액을 폐기하십시오. 24웰 플레이트의 각 웰을 1mL의 R-10 배지로 차단합니다. 플레이트를 5%CO2 와 함께 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 레트로넥틴 플레이트가 차단되는 동안 원심분리기를 32°C로 예열합니다. 0.45 μm 필터를 사용하여 형질감염된 293T 세포를 여과하여 레트로바이러스 상청액을 수집한다. 여과된 레트로바이러스 상청액 2 mL를 각 웰에 분취한다. 24웰 플레이트를 2103 x g 에서 32°C에서 2시간 동안 원심분리합니다. 플레이트 원심분리 동안, 0일째부터 확장된 PBNK 세포를 수집하고 트리판 블루를 사용하여 세포를 계수한다.참고: IL-10(200U/mL) 및 IL-200(5ng/mL)가 보충된 R-15 배지를 추가하여 PBNK 세포를 계속 확장합니다. IL-2 (200 U/mL) 및 IL-15 (5 ng/mL)로 보충된 R-10 배지로 확장된 PBNK 세포를 2.5 x 10 5-5 x 10 5 세포/mL(0.5 x 10 6-1 x 10웰당6 세포)로 희석합니다.참고: 총 세포 수, 생존율을 기록하고, 유세포분석을 위해 5 x 105 개의 확장된 PBNK 세포를 저장하면 이러한 값이 NK 세포 확장 속도를 결정하는 데 중요하므로 유세포분석을 합니다. 원심분리 후, 각 웰로부터 레트로바이러스 상청액을 부분적으로 흡인한다.참고: 완전히 흡인하지 마십시오, 즉 우물당 약 100μL의 레트로바이러스 상청액을 남겨두면 형질도입 효율이 감소할 수 있습니다. 단계 6.8에서 희석된 확장된 PBNK 세포 2 mL를 각 웰에 분취한다. 플레이트를 600 x g에서 32°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 플레이트를 5% CO2와 함께 37°C에서 48-72시간 동안 인큐베이션한다.알림: 플레이트를 파라필름으로 필름하지 마십시오. 7. 그림 2와 같이 CAR-NK 세포 수집(6일 또는 7일차). 24웰 플레이트에서 세포를 부드럽게 수집하고 세포를 50mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.알림: 거품을 생성하면 세포 생존력이 감소하므로 거품을 생성하지 마십시오. 튜브를 400 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 1mL의 R-10 배지로 펠릿을 재현탁하고 Trypan Blue를 사용하여 세포를 계수합니다.참고: 형질도입 효율을 결정하기 위해 유세포분석을 위해 5 x 105 세포를 저장합니다. 재현탁된 세포를 IL-2(200U/mL) 및 IL-15(5ng/mL)가 보충된 R-10 배지 30mL가 들어 있는 특수 6웰 플레이트로 옮깁니다. 특수 6-웰 플레이트를 37°C에서 5%CO2로 배양한다. IL-2 (200 U / mL) 및 IL-15 (5 ng / mL)가 보충 된 R-10 배지를 교체하여 3-4 일마다 NK 세포를 유지하십시오.참고: 각 변경 시 추가 확장을 위해 웰당 20 x 106 셀 미만을 유지하십시오. 최상의 생존력을 위해, 각 웰의 총 세포 수가 100 x 106 세포를 초과하지 않도록하십시오. 총 세포 수, 생존율을 기록하고, 3-4일마다 유세포 분석을 수행하여 NK 세포 확장률을 계산하였다. 적절한 시험관 내 또는 생체내 분석을 위해 세포를 사용한다.참고: 생체외 확장 PBNK 및 CAR-NK 세포는 약 4주 동안 37°C 인큐베이터에서 배양될 수 있습니다. NK 세포수 및 순도를 유세포 분석기로 7일째, 11일째, 14일째, 18일째 및 21일째에 조사하였다.