膜結合型IL-21修飾B細胞株を用いたナチュラルキラー(NK)およびCAR-NK細胞増殖法

このプロトコルのヒト組織および血液関連の作業は、ラトガース大学治験審査委員会(IRB)のガイドラインに従います。 1.図1に示すように、肝臓組織からのNK細胞増殖(0日目)。 注:初期細胞数と生存率は、臓器摘出からの時間と初期組織サンプル量と強く相関しています。しかし、組織を30 mLのハンクスバランス塩溶液(HBSS)に入れ、氷上または冷蔵庫で4°Cで一晩保持した場合、NK細胞は24時間後まで高純度および生存率で増殖することができます。 無菌手術器具を使用して組織および切片からリンパ球を取得するために、生存可能な組織領域を特定します。 組織を30 mLのHBSS(カルシウムまたはマグネシウムなし)に入れ、分離の準備ができるまで氷上に保ちます。 バイオセーフティキャビネット内の滅菌かみそりの刃またははさみと鉗子を使用して、組織を<0.5cmの立方体にミンチします。 10x ストックをHBSSで希釈して、1x コラゲナーゼ IV 溶液 (1 mg/mL) を調製します (10x コラゲナーゼ IV: 10 mg/mL または ~200 U/mL)。 ミンチ組織片を組織解離管に入れます。チューブに4 g以下の組織を満たし、組織片を~10 mLの1xコラゲナーゼIVに浸します。注:DNase Iの使用は、NKの生存率と収量をわずかに低下させる可能性があるため、お勧めしません。使用する特定の組織解離管については、 材料表 を参照してください。 組織解離管を組織解離管に入れ、37°Cでブレンドして組織を完全にミンチします。注意: 肝臓組織の場合、これには30分以上かかる場合があります。より砕けやすい組織の場合、約15分で十分な場合があります。特定の組織解離剤チューブおよび使用される組織解離剤については、 材料表 を参照してください。 組織解離チューブを取り外し、5 mLシリンジのバックエンドを使用して40 μmナイロンセルストレーナーを通して粉砕します。溶離液を回収し、大きな未消化の断片を廃棄します。 溶離液を400 x g で室温で5分間スピンダウンします。上澄み液を吸引する。 細胞ペレットを30%ポリビニルピロリドン(PVP)コーティングシリカに再懸濁して、最終的なリンパ球画分を汚染する脂肪細胞を除去します。1x PVP被覆シリカを調製するには、10x PBS中のPVP被覆シリカの9:1希釈を使用します。注意: 使用される特定のPVPコーティングシリカについては、 材料表 を参照してください。 30%PVPコーティングシリカを調製するには、PVPコーティングシリカ1xをPBS / HBSSで希釈します。 セルペレットを400 x g で室温で5分間スピンダウンします。上澄み液を吸引する。 細胞ペレットを9 mLのR-10培地に再懸濁します。注:R-10メディアの構成については、 材料表 を参照してください。 細胞懸濁液を4 mLのFicollまたはリンパ球分離培地に注意深く重ねて、赤血球および多形核細胞からリンパ球を分離します。 加速とブレーキをオフまたは最低設定で室温で400 x g で23分間遠心分離することにより、層を分離します。上層から中層を注意深くデカントし、組織浸潤リンパ球を含む間期を採取します。 細胞を10 mLの培地ですすぎ、細胞計数、フローサイトメトリー、細胞の分注と凍結、または一次NK増殖プロトコルに進みます。 2. 図2に示すように、PBMC(またはCBまたは臓器組織)からの初代NK細胞増殖(0日目)。 凍結したPBMCと凍結したフィーダーセルを解凍し、37°Cの水浴中で照射した。 PBMCと100ガンマ線照射(Gy照射)221-mIL-21細胞を、10 mLのR-10培地で400 x g で5分間遠心分離して洗浄します。 フローサイトメトリー用にPBMCの1 x 106 細胞を保存します。注:初期のNK細胞の純度は、NK細胞の増殖率を計算する上で重要な要素です。 細胞を1 mLのR-10培地に再懸濁します。トリパンブルーを使用して細胞をカウントします。 PBMCの5x 10 6セルと100 Gy照射221-mIL-21セルの10 x 10 6セルを特別な6ウェルプレートで混合します(材料の表を参照)。 ヒトIL-2(200 U / mL)およびヒトIL-15(5 ng / mL)を添加した30 mLのR-10培地を追加します( 材料の表を参照)。 特殊な6ウェルプレートを5%CO2で37°Cでインキュベートします。 培地をヒトIL-2(200 U/mL)およびヒトIL-15(5 ng/mL)を添加したR-10培地に交換し、3〜4日ごとにNK細胞を維持します。注:培地交換のたびにさらに拡張できるように、ウェルあたり20 x 106 セル未満に維持してください。最良の生存率を得るには、各ウェルの合計細胞数が100 x 106 細胞を超えないようにしてください。 総細胞数、生存率を記録し、3〜4日毎にフローサイトメトリーを行い、NK細胞増殖率を算出した。 3. 図2に示すように、293T細胞の付着( 2日目)。 処理した100 mmプレートあたり1.8 x 106 293T細胞を11 mLのD-10培地で分割します。注意: D-10メディアの構成については、 材料表 を参照してください。 293T細胞を5%CO2で37°Cでインキュベートします。 4. レトロウイルストランスフェクション(3日目) 1.7 mLチューブ中で、470 μLの還元血清培地と30 μLのトランスフェクション試薬を混合します。注:使用する特定の還元血清培地およびトランスフェクション試薬については、 材料表 を参照してください。 別の1.7 mLチューブに、SFGベクター中の2.5 μgのpRDFプラスミド、3.75 μgのPegpam3プラスミド、および2.5 μgのCARコンストラクトを還元血清培地に加え、最終容量が500 μLになるようにします。 手順4.1と4.2の溶液を滴下して混合します。 チューブを室温で15分間インキュベートします。 ステップ4.4の混合物を1日目に293T細胞プレートに滴下して加えます。 プレートを5%CO2で37°Cで48〜72 時間インキュベートします。 5.レトロネクチンプレートコーティング(3日目) リン酸緩衝生理食塩水(PBS)でレトロネクチンタンパク質を最終濃度50〜100 μg / mLに希釈します。 500 μLの希釈レトロネクチンを未処理の24ウェルプレートの各ウェル(CARコンストラクトあたり5ウェル)に追加します。パラフィルムを使用してプレートを密封し、プレートを4°Cで一晩インキュベートします。 6.形質導入(4日目) レトロネクチンプレートを2103 x g で4°Cで30分間遠心分離します。 上澄み液を捨てる。 24ウェルプレートの各ウェルを1 mLのR-10培地でブロックします。 プレートを5%CO2 で37°Cで1時間インキュベートします。 レトロネクチンプレートがブロックされている間、遠心分離機を32°Cに予熱します。 トランスフェクトされた293T細胞を0.45 μmフィルターでろ過し、レトロウイルス上清を収集します。 ろ過したレトロウイルス上清2 mLを各ウェルに分注します。 24ウェルプレートを2103 x g で32°Cで2時間遠心分離します。 プレート遠心分離中に、0日目から増殖PBNK細胞を回収し、トリパンブルーを使用して細胞をカウントします。注:IL-2(200 U / mL)およびIL-15(5 ng / mL)を添加したR-10培地を追加して、PBNK細胞を引き続き増殖させます。 IL-2(200 U/mL)およびIL-15(5 ng/mL)を添加したR-10培地で、増殖したPBNK細胞を2.5 x 10 5-5 x 10 5細胞/mL(ウェルあたり0.5 x 10 6-1 x10 6細胞)に希釈します。注:総細胞数、生存率を記録し、5 x 105 増殖PBNK細胞はNK細胞増殖率を決定する上で重要であるため、フローサイトメトリー用に保存してください。 遠心分離後、各ウェルからレトロウイルス上清を部分的に吸引する。注:完全に吸引しないでください、すなわち、ウェルあたり約100μLのレトロウイルス上清を残すと、形質導入効率が低下します。 ステップ6.8から希釈した増殖PBNK細胞2mLを各ウェルに分注する。 プレートを600 x g で32°Cで10分間遠心分離します。 プレートを5%CO2 で37°Cで48〜72時間インキュベートします。注意: プレートをパラフィルムしないでください。 7. 図2に示すように、CAR-NK細胞収集(6日目または7日目)。 24ウェルプレートから細胞を静かに回収し、50 mLの遠沈管に移します。注:気泡を生成しないようにしてください, これは細胞の生存率の低下をもたらすので. チューブを400 x g で5分間遠心分離します。 ペレットを1 mLのR-10培地で再懸濁し、トリパンブルーを使用して細胞をカウントします。注:フローサイトメトリー用に5 x 105 細胞を保存して、形質導入効率を測定します。 再懸濁した細胞を、IL-2(200 U/mL)およびIL-15(5 ng/mL)を添加した30 mLのR-10培地を含む特別な6ウェルプレートに移します。 特殊な6ウェルプレートを5%CO2で37°Cでインキュベートします。 IL-2(200 U/mL)およびIL-15(5 ng/mL)を添加したR-10培地を交換して、3〜4日ごとにNK細胞を維持します。注:ウェルあたり20 x 106 セル未満に維持し、各変更でさらに拡張します。最良の生存率を得るには、各ウェルの合計細胞数が100 x 106 細胞を超えないようにしてください。 総細胞数、生存率を記録し、3〜4日毎にフローサイトメトリーを行い、NK細胞増殖率を算出した。 適切なインビトロまたはインビボアッセイに細胞を使用してください。注: ex vivo で増殖したPBNK細胞およびCAR-NK細胞は、37°Cのインキュベーターで約4週間培養できます。 フローサイトメトリーにより、7日目、11日目、14日目、18日目、および21日目のNK細胞数と純度を調べます。