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医学

Induzione dell'ipotermia di breve durata nei ratti utilizzando modelli per studi che esaminano la rilevanza clinica e i meccanismi

Published: March 03, 2021
doi:
10.3791/62325
, , , , , , ,
1School of Biomedical Sciences and Pharmacy,University of Newcastle, 2Department of Neurology,John Hunter Hospital, Hunter New England Local Health District

Summary

Questo articolo descrive due metodi di induzione dell’ipotermia di breve durata su tutto il corpo nei ratti. Il primo, metodo a induzione rapida, impiega il raffreddamento attivo utilizzando ventole e spray etanolo per una rapida diminuzione della temperatura. Il secondo metodo è un metodo di raffreddamento graduale. Ciò si ottiene utilizzando la combinazione di anestesia isoflurano e la riduzione delle impostazioni di temperatura sul tappetino termico omeotermico. Ciò si traduce in una graduale diminuzione della temperatura corporea interna senza l’uso di dispositivi di raffreddamento esterni. 

Abstract

L’ipotermia terapeutica (TH) è una potente strategia neuroprotettiva che ha fornito solide prove per la neuroprotezione negli studi pre-clinici sui disturbi neurologici. Nonostante una forte evidenza pre-clinica, TH non ha mostrato efficacia negli studi clinici della maggior parte dei disturbi neurologici. Gli unici studi di successo che impiegavano ipotermia terapeutica erano correlati all’arresto cardiaco negli adulti e alla lesione ischemica ipossica nei neonati. Sono giustificate ulteriori indagini sui parametri del suo utilizzo e confronti tra studi pre-clinici e clinici. Questo articolo dimostra due metodi di induzione dell’ipotermia di breve durata. Il primo metodo consente una rapida induzione dell’ipotermia nei ratti utilizzando spray e ventilatori a base di etanolo. Questo metodo funziona raffreddando la pelle, che è stata meno comunemente usata negli studi clinici e può avere diversi effetti fisiologici. Il raffreddamento è molto più rapido con questa tecnica di quanto sia ottenibile nei pazienti umani a causa delle differenze nel rapporto superficie/volume. Insieme a questo, viene presentato anche un secondo metodo, che consente una velocità di raffreddamento clinicamente raggiungibile per l’ipotermia di breve durata. Questo metodo è facile da implementare, riproducibile e non richiede un raffreddamento attivo della pelle.

Introduction

TH è la pratica di raffreddare la temperatura corporea o cerebrale al fine di preservare la vitalità e la funzione dell’organo / sistema1,2. Il ruolo dell’ipotermia nella neuroprotezione è stato studiato e ha mostrato benefici in una serie di modelli pre-clinici di malattie neurologiche comel’ictus 3, l’emorragia subaracnoidea4e la lesione cerebrale traumatica5. In termini di applicazioni cliniche, TH ha dimostrato efficacia nei pazienti post-arresto cardiaco e nel danno ipossico-ischemico neonatale6.

L’induzione TH si ottiene utilizzando metodi di raffreddamento superficiale o endovascolare. La maggior parte degli studi pre-clinici sull’ipotermia esegue il raffreddamento superficiale applicando acqua o etanolo alla pelliccia dell’animale o utilizzando una coperta di raffreddamento per raggiungere la temperatura target1. Nell’uomo, il raffreddamento sistemico della superficie si ottiene utilizzando impacchi di ghiaccio e coperte di raffreddamento7,8. Un raffreddamento più rapido è stato dimostrato in pazienti che utilizzano metodi endovascolari, che accoppiano un’infusione di induzione di soluzione salina fredda attraverso un catetere endovenoso o intra-arterioso, con il posizionamento di un dispositivo di raffreddamento endovascolare all’interno della vena cava inferiore9,10. Ad esempio, una temperatura target moderata di 33 °C può essere raggiunta in 1,5 ore con raffreddamento endovascolare rispetto a 3-4 ore con raffreddamento superficiale neipazienti 11. L’approccio endovascolare è diventato anche più popolare negli ultimi anni perché è stato segnalato per ridurre alcuni degli effetti collaterali osservati nel raffreddamento sistemico della superficie, come brividi12,13. Lo studio clinico europeo multicentrico randomizzato di fase III sull’ipotermia per l’ictus ischemico (EUROHYP-1) ha utilizzato principalmente il raffreddamento superficiale14. I risultati recentemente pubblicati da questo studio hanno dimostrato che i brividi erano una complicazione importante e avrebbero potuto limitare la capacità di raggiungere la temperatura target10. La risposta da brividi è nota per essere principalmente guidata dalla temperatura della pelle. Alcuni sforzi sono stati fatti per sviluppare un metodo di raffreddamento endovascolaredei roditori 15, ma la natura altamente invasiva della tecnica rispetto a quella utilizzata nell’uomo, rischia di confondere qualsiasi risultato ottenuto da quel modello.

La temperatura è il modulatore chiave dei processi biologici nel corpo ed è strettamente regolata dall’omeostasi. Pertanto, qualsiasi manipolazione della temperatura corporea può avere rischi associati. La durata del raffreddamento è un fattore che può aver limitato il successo degli studi clinici sull’ipotermia. Questi studi utilizzano un metodo di raffreddamento di lunga durata, con molti che mantengono l’ipotermia da 24-72 h11. Questa durata prolungata rappresenta un rischio di infezione durante il protocollo di raffreddamento. La polmonite è la complicanza più comune da ipotermia, che colpisce tra il 40-50% dei pazienti che si sottopongono alla procedura13. Questo è in contrasto con ciò che si vede normalmente negli studi sugli animali di ipotermia in cui viene utilizzato un paradigma di breve durata (1-6 h)3. Il successo di questi studi pre-clinici sugli animali si tradurrà probabilmente nell’adattamento dell’ipotermia di breve durata per l’uso negli studi clinici. Di conseguenza, è necessario disporre di un modello animale di ipotermia di breve durata che assomigli ai tassi di raffreddamento dei futuri studi clinici. Ulteriori dettagli relativi ad altri parametri di temperatura e alla validità dell’ipotermia di breve durata sono stati discussi in diversi articoli di revisione1,16,17,18.

Qui è dimostrato un modello graduale di raffreddamento che è più clinicamente realizzabile rispetto agli attuali modelli sperimentali di ipotermia. Questo nuovo metodo ha un tasso di raffreddamento molto più lento e, pertanto, il tempo per raggiungere la temperatura è più vicino all’intervallo di quelli osservati negli studi clinici di ipotermia11. Evita anche il raffreddamento superficiale diretto, che ha effetti fisiologici specifici, e può, quindi, essere più paragonabile al raffreddamento endovascolare, che è stato il metodo di raffreddamento più comunemente usato negli studi clinici9,12. Questo modello consente di raffreddare gradualmente gli animali nell’arco di 2 ore, seguiti da un breve periodo di mantenimento alla temperatura target. Inoltre, viene anche dimostrato il metodo di ipotermia di breve durata a raffreddamento rapido19. Il metodo di raffreddamento rapido consente di raggiungere rapidamente la temperatura target dopo l’insorgenza dell’ipotermia. Mentre questo approccio non è clinicamente rilevante come il metodo di raffreddamento graduale, è utile per gli studi che mirano a esplorare i meccanismi della neuroprotezione dell’ipotermia per imitare potenzialmente i suoi potenti effetti neuroprotettivi farmacologicamente. Questo metodo ha anche potenziali applicazioni al di fuori delle neuroscienze e potrebbe essere adattato a qualsiasi numero di studi pre-clinici. Un altro vantaggio di entrambi i metodi rispetto ad altri approcci è che sono economici e non richiedono attrezzature specialistiche. Infine, questo protocollo dimostra anche l’impianto di datalogger di temperatura, poiché il riscaldamento post-operatorio e il monitoraggio degli stessi sono importanti per prevenire l’ipotermia post-operatoria involontaria, con il suo potenziale di confondere i risultati dello studio20.

Protocol

Tutte le procedure sperimentali erano conformi al Codice di condotta australiano per la cura e l’uso degli animali a fini scientifici e sono state approvate dal Comitato per la cura degli animali e l’etica dell’Università di Newcastle (A-2013-343 e A-2020-003). Oltre ai metodi di induzione dell’ipotermia descritti di seguito, i seguenti protocolli vengono eseguiti di routine in combinazione con l’ipotermia: cannolazione della linea femorale per monitorare la pressione sanguigna e la frequenza cardiaca21e ictus sperimentale22. 1. Impianto di datalogger NOTA: il dispositivo datalogger utilizzato in questo protocollo non era in grado di fornire una lettura in tempo reale della temperatura corporea. La lettura è possibile una volta che il datalogger è stato rimosso dall’animale e ricondotta al computer. Di conseguenza, la sonda di temperatura rettale viene utilizzata per fornire informazioni in tempo reale durante il processo di raffreddamento e riscaldamento. Inoltre, la sonda rettale è anche vitale per questo metodo perché il tappetino termico chirurgico su cui l’animale è posizionato durante la procedura è regolato dal sistema di sonda rettale. Il datalogger ha anche un prezioso scopo di fornire dati sulla temperatura in ratti svegli e in movimento libero ed è importante per garantire che la normale temperatura corporea venga mantenuta dopo il riscaldamento. Pertanto, entrambi i dispositivi di monitoraggio della temperatura sono importanti per questo protocollo. Anestetizzare ratto Wistar di 10-12 settimane con isoflurano (5% per induzione e 2-2,5% per manutenzione) in una miscela 50% N2 e 50% O2. Dopo l’induzione, posizionare il ratto in posizione prona su un tappetino termico chirurgico. Posiziona il topo in modo che il naso sia seduto nel cono del naso. Fissare il naso con nastro chirurgico per assicurarsi che non fuoriescevano gas. Radere la pelliccia dall’addome in basso a destra e iniettare il sito per via sottocutanea con un anestetico locale, Bupivacaina 0,2 ml, 0,05%. Applicare la soluzione antisettica sulla regione appena rasata. Utilizzando strumenti chirurgici sterilizzati, eseguire un’incisione longitudinale di 2 cm lungo la regione addominale destra, prossimale alla coscia destra. Fai l’incisione abbastanza profonda da esporre lo spazio alla piega ventrale della coscia. Usa eremoti e pinna per creare una “tasca” sotto la pelle abbastanza grande da contenere il dispositivo. Inserire il dispositivo di monitoraggio della temperatura datalogger nella tasca e chiudere il muscolo e la pelle utilizzando suture di seta 5-0. Il metodo sottocutaneo qui descritto è preferito al metodo intra-peritoneale in quanto è meno invasivo e consente un migliore recupero dopo la procedura. Assicurarsi che il datalogger e la sonda rettale siano calibrati in modo incrociato per il monitoraggio della temperatura (vedere Discussione). Assicurarsi che il datalogger non si appoggi al tappetino termico dell’animale dopo l’inserimento, in quanto ciò influenzerà le letture della temperatura. Figura 1: Impianto del dispositivo datalogger. (A) I pannelli da sinistra a destra mostrano un’incisione di circa 2 cm sul lato destro dell’addome inferiore del ratto. (B) Il datalogger di monitoraggio della temperatura è stato inserito per via sottocutanea nell’incisione tascabile. (C) L’incisione è stata chiusa con suture di nylon. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 2. Induzione dell’ipotermia attiva (veloce) per studi meccanicistici Impostare per l’ipotermia (vedere Figura 2). Posiziona due supporti di storta con morsetti su entrambi i lati del corpo del topo. Fissare una ventola da 60 mm 12 v/130 mA a ciascun supporto di storta assicurandosi che le ventole siano rivolte verso la parte bassa della schiena del ratto. La distanza tra il morsetto e il ratto è di circa 20 cm. La ventola utilizzata deve avere una velocità di 4.000 giri/min. Avere una lampada di calore animale pronta sul lato o su un terzo supporto di storta. Iniziare l’ipotermia regolando il tappetino termico animale alla temperatura target desiderata. In questo esempio, 32,5 °C è la temperatura target (3,75 sull’unità di controllo della temperatura). Accendere entrambe le ventole e applicare da tre a quattro spruzzi di etanolo al 70% (flacone spray in plastica standard) sulla parte bassa della schiena del ratto. Ruffle pelliccia animale durante la spruzzatura per un’induzione di raffreddamento più rapida.NOTA: L’etanolo viene utilizzato come soluzione preferita rispetto all’acqua perché ha un tasso di evaporazione più veloce e quindi si traduce in un’induzione più rapida dell’ipotermia. Fare attenzione a non saturare eccessivamente la pelliccia, poiché ciò può contribuire a superare la temperatura target.NOTA: le ventole accelereranno l’evaporazione dell’etanolo e il processo di raffreddamento. Consentire brevi intervalli tra le applicazioni di etanolo tenendo d’occhio la temperatura rettale del ratto. Cessare ogni ulteriore applicazione di etanolo una volta che la temperatura rettale raggiunge entro 1 °C dalla temperatura target. Spegnere entrambe le ventole una volta che la temperatura ha raggiunto entro 0,5 °C dalla temperatura target (33 °C in questo caso).NOTA: spegnere le ventole prima che venga raggiunta la temperatura target aiuta a evitare che il ratto si irrereddi eccessivamente oltre la temperatura richiesta. Lasciare scendere la temperatura a 32,5 °C. Se si verifica un raffreddamento eccessivo, utilizzare la lampada di calore animale per riscaldare leggermente l’animale fino al bersaglio. L’assistenza di un ventilatore può essere utilizzata per prevenire un ribaltamento del riscaldamento. Una volta raggiunta la temperatura target e stabilizzata, continuare a monitorare la temperatura. La temperatura di solito rimane molto stabile per il resto del periodo di ipotermia senza la necessità di spruzzare, utilizzare ventilatori o utilizzare la lampada di calore. Per riscaldare l’animale alla fine dell’ipotermia, regolare la temperatura del tappetino termico a 37 °C (6 sull’unità di controllo della temperatura utilizzata in questo esempio) e consentire all’animale di termoregolarsi per un periodo di 30 minuti.NOTA: le impostazioni di temperatura sulle unità di controllo della temperatura possono variare e può quindi essere necessario determinare le impostazioni per l’ipotermia target e la normotermia sui singoli dispositivi. 3. Induzione dell’ipotermia ad esordio graduale clinicamente ottenibile senza raffreddamento attivo della pelle Ottenere l’ipotermia riducendo la temperatura del tappetino termico omeotermico regolato dalla temperatura interna in piccoli incrementi alla temperatura target richiesta. Nell’esempio illustrato (Figura 3B), è stato utilizzato un incremento di 1 °C ogni 30 minuti. Raffreddare l’animale per raggiungere la temperatura desiderata nel periodo desiderato (2 ore nell’esempio descritto). Una volta raffreddato, mantenere al bersaglio per l’intervallo desiderato. Di solito, non è necessario alcun ulteriore intervento se vengono mantenuti sul tappetino termico omeotermico impostato per la temperatura target desiderata. Non è necessario alcun raffreddamento esterno con questo protocollo poiché l’anestesia impedisce la normale regolazione della temperatura corporea interna.NOTA: il fabbisogno di isoflurano diminuisce con l’ipotermia. Nella maggior parte degli animali, una concentrazione iniziale di isoflurano del 2% può essere ridotta con incrementi dello 0,1% ogni 20-30 minuti all’1,5% per mantenere stabile la frequenza respiratoria (>50 respiri / min), la frequenza cardiaca e la pressione sanguigna e preservare la soppressione delle risposte riflesse. Per riscaldare l’animale dopo l’ipotermia, regolare il tappetino termico per consentire all’animale di riscaldarsi nell’intervallo desiderato. Nell’esempio, il riscaldamento con una singola regolazione a 37 °C (6 sull’unità di controllo della temperatura FHC utilizzata nell’esempio) è stato ottenuto in un periodo di 30 minuti. Per studi a lungo termine che richiedono il recupero degli animali, tenere gli animali in una gabbia che viene posta metà su un tappetino termico per consentire all’animale di termoregolarsi ed evitare l’ipotermia post-operatoria involontaria. Il paracetamolo rettale (250 mg / kg) può essere somministrato per il recupero e il sollievo dal dolore notturno. Iniezioni saline sottocutanee (2 x 1,5 ml) possono anche essere somministrate per prevenire la disidratazione da anestesia e procedure chirurgiche.

Representative Results

La Figura 3A è una rappresentazione di come un ratto Wistar risponde all’ipotermia utilizzando l’approccio di raffreddamento rapido. L’induzione dell’ipotermia si ottiene con l’uso di ventilatori e spray al 70% di etanolo. L’ipotermia a un obiettivo di 32,5 °C viene raggiunta in 15 minuti. Bisogna fare attenzione a garantire una delicata interazione tra l’uso dei ventilatori / lampada di calore e lo spray etanolo per mantenere la temperatura target. Come si può vedere dalla Figura 3A,si osserva un leggero superamento della temperatura, che può verificarsi se il raffreddamento non viene interrotto da circa 0,5 °C sopra la temperatura target. Il bersaglio viene mantenuto e stabilizzato al segno di 30 minuti e il riscaldamento viene avviato a 1,5 h. La figura 3B mostra il protocollo graduale in cui la temperatura target a 33 °C viene raggiunta a 2 h e mantenuta per 30 min prima di riacrezionare a 2,5 h. Qui, la temperatura viene regolata in incrementi che prolungano la durata necessaria per raggiungere la temperatura target. Le linee tratteggiate verticali in entrambi i grafici rappresentano la durata del raffreddamento. La Figura 3A e la Figura 3B sono ottenute dal dispositivo datalogger. All’inizio dell’esperimento, il datalogger è programmato per avviare la registrazione prima dell’impianto. Alla fine dell’esperimento, il datalogger viene rimosso dall’animale e collegato al lettore di temperatura fornito tramite porta USB. Il software (ad esempio, eTemperature) legge e genera i dati, che possono quindi essere esportati in un software per fogli di calcolo. Figura 2: Configurazione del protocollo di raffreddamento rapido. (A) Due ventole (freccia nera) erano situate sopra la regione lore bassa del ratto. All’inizio dell’ipotermia, entrambi i ventilatori sono stati accesi e lo spray etanolo è stato applicato alla parte bassa della schiena. La combinazione di etanolo e ventilatore facilita e accelera l’ipotermia per raggiungere rapidamente la temperatura target. (B) Una lampada di calore (freccia bianca) è stata utilizzata per prevenire l’overshoot di ipotermia. Una volta raggiunta la temperatura target, la lampada di calore è stata utilizzata per evitare che la temperatura interna del ratto scendesse più in basso. Una volta stabilizzato il bersaglio, la lampada di calore e/o la ventola rimanente sono state spente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Induzione dell’ipotermia con metodi attivi (A) e graduali (B). (A) La temperatura target è stata raggiunta in 15 minuti utilizzando il processo di raffreddamento attivo ed è stata mantenuta per 60 minuti nell’esempio precedente prima che l’animale fosse riwarmato. (B) La temperatura target è stata raggiunta in 2 ore utilizzando il metodo di raffreddamento graduale ed è stata mantenuta per 30 minuti prima che l’animale fosse rievocagliato. Le regioni ombreggiate in entrambi i grafici rappresentano i punti temporali in cui è stata mantenuta la temperatura target. Le linee perpendicolari punteggiate in entrambi i grafici si riferiscono alla durata complessiva del raffreddamento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Le procedure qui descritte sono facilmente implementabili, non invasive e forniscono diminuzioni affidabili e riproducibili della temperatura corporea interna alla temperatura target desiderata.

Ci sono diversi passaggi critici nel metodo di raffreddamento rapido che includono quanto segue. Non saturare eccessivamente lo spray di etanolo – bisogna fare attenzione a non immergere l’animale nell’etanolo, in quanto ciò interferirà con i risultati. Monitorare l’animale durante l’induzione dell’ipotermia- è necessario prestare attenzione per monitorare attentamente le risposte degli animali all’induzione rapida dell’ipotermia. Un attento monitoraggio della temperatura rettale è importante per garantire che la temperatura non scendi al di sotto del bersaglio desiderato: se ciò accade, spegnere le ventole e consentire alla lampada di calore di riscaldare delicatamente l’animale fino al bersaglio richiesto.

In entrambi i metodi, il monitoraggio fisiologico è importante per garantire un adeguato aggiustamento della dose anestetica. Per un raffreddamento prolungato, una dose anestetica inadeguata può prolungare la durata del raffreddamento. In questo caso, la concentrazione di isoflurano può essere aumentata fino a raggiungere un’adeguata velocità di raffreddamento. Un altro passo critico è la calibrazione incrociata dei dispositivi di temperatura. Quando si utilizza un tappetino termico regolato dalla sonda di temperatura e un datalogger nello stesso esperimento, è buona norma calibrare il datalogger con la sonda rettale, in vivo, poiché potrebbero esserci piccole variazioni nella temperatura registrata dei due dispositivi.

Questi metodi sono adatti per studi che desiderano esplorare l’uso dell’ipotermia come potenziale trattamento per i disturbi neurologici. L’obiettivo specifico dello studio dovrebbe dettare quale metodo viene utilizzato. Entrambi i metodi possono essere classificati come raffreddamento superficiale sistemico, tuttavia il secondo metodo non richiede alcun raffreddamento attivo. Il modello di raffreddamento graduale sopra descritto ha importanti potenziali applicazioni per l’uso dell’ipotermia nel trattamento dell’ictus ischemico. L’ipotermia di lunga durata e le conseguenti complicanze rappresentano una sfida per i pazienti anziani con ictus. Inoltre, la risposta tremante rende difficile raggiungere la temperatura target in alcunipazienti 10. Mentre i farmaci anti-brividi possono aiutare a ridurre la risposta ai brividi, il raffreddamento graduale di breve durata potrebbe migliorare più efficacemente il problema. Avere un periodo di raffreddamento più breve è anche probabile che riduca l’incidenza della polmonite spesso riportata negli studi. Un altro potenziale vantaggio di questo metodo di breve durata è che la velocità di riscaldamento potrebbe non essere così importante rispetto al raffreddamento di lunga durata. Studi clinici molto precoci sul raffreddamento di lunga durata in pazienti con ictus con infarti di grandi dimensioni hanno rilevato che il riscaldamento rapido ha portato a grandi aumenti della pressione intracranica (ICP), che ha peggiorato l’esito ed è stato spesso fatale. Ciò ha portato allo sviluppo di paradigmi di riscaldamento graduale, che hanno ulteriormente esteso la durata complessiva del raffreddamento. Il raffreddamento di breve durata mantiene la temperatura target solo per un breve periodo e può meno probabilmente provocare un ICP di rimbalzo. Lavori precedenti che hanno studiato il trattamento dell’ipotermia per l’elevazione dell’ICP, utilizzando un protocollo di raffreddamento e riscaldamento rapido simile a quelli descritti qui, non hanno mostrato alcun aumento dell’ICP di rimbalzo dopo il riscaldamento23,24.

Gli studi clinici di ipotermia per il trattamento dell’ictus ischemico non sono stati in grado di tradurre i benefici dell’ipotermia riportati negli studi sperimentali. La mancata corrispondenza delle velocità di raffreddamento e della durata tra modelli sperimentali e pazienti, sono variabili importanti che possono spiegare questa discrepanza. Avere un modello sperimentale di ipotermia che assomiglia meglio al tasso clinico di raffreddamento consentirà un’indagine più informata sui benefici dell’ipotermia come misura di trattamento per i pazienti con ictus.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo progetto è stato finanziato dall’Università di Newcastle, dall’Hunter Medical Research Institute (HMRI) Dalara Early Research Career Researcher Fellowship, dal NSW Health Early-Mid Career Research Fellowship e dal National Health and Medical Research Council (NHMRC) Australia.

Materials

Absolute ethanol ThermoFisher Scientific/ Ajax Finechem AJA214-20LPL Diluted with deionized water to give 70 % ethanol
Antiseptic solution (Chlorhexidine) David Craig A2957
Anaesthetic (Marcain) Aspen PS13977
Brushless fan motor Sirocco YX2505 2 x 12 V/130 mA
Heat lamp Reptile One AC220 240 V 50/60 Hz
Heat pad FHC, Inc 40-90-2
Rectal probe FHC, Inc 40-90-5D-02
Temperature controller FHC, Inc 40-90-8D
Temperature Datalogger Maxim DS1922L-F5
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Omileke, D., Bothwell, S., Beard, D. J., Mackovski, N., Azarpeykan, S., Coupland, K., Patabendige, A., Spratt, N. Short-Duration Hypothermia Induction in Rats using Models for Studies examining Clinical Relevance and Mechanisms. J. Vis. Exp. (169), e62325, doi:10.3791/62325 (2021).
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