작은 분자의 미세 결정 전자 회절
Summary
여기에서는 미세 결정 전자 회절(MicroED) 실험을 위한 소분자 결정 분말을 준비하기 위해 실험실에서 개발된 절차를 설명합니다.
Abstract
미세결정 전자 회절(MicroED) 실험을 위한 소분자 샘플을 준비하기 위한 자세한 프로토콜이 설명되어 있습니다. MicroED는 표준 전자 극저온 현미경(Cryo-EM) 장비를 사용하여 단백질 및 소분자의 구조를 해결하기 위해 개발되었습니다. 이러한 방식으로, 소분자, 펩티드, 가용성 단백질 및 막 단백질은 최근 고분해능으로 결정되었습니다. 카바마제핀이라는 약물을 예로 들어 소분자 의약품 그리드를 준비하기 위한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다. 데이터를 선별하고 수집하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 데이터 통합, 구조 결정 및 개선과 같은 전체 프로세스의 추가 단계는 다른 곳에서 제공됩니다. 소분자 그리드를 준비하는 데 필요한 시간은 30분 미만으로 추정됩니다.
Introduction
Microcrystal electron diffraction (MicroED)은 서브 마이크로미터 크기의 결정 1,2로부터 원자 분해능 구조를 결정하기 위한 전자 극저온 현미경(cryo-EM) 방법입니다. 결정은 표준 투과 전자 현미경 (TEM) 그리드에 적용되고 액체 에탄 또는 액체 질소에 뛰어 들어 동결됩니다. 그런 다음 그리드는 극저온에서 작동하는 TEM에 로드됩니다. 결정은 그리드에 위치하며 초기 회절 품질을 위해 스크리닝됩니다. 연속 회전 MicroED 데이터는 스크리닝된 결정의 하위 집합에서 수집되며, 여기서 데이터는 고속 카메라를 사용하여 동영상으로 저장됩니다3. 이들 영화는 표준 결정학 형식으로 변환되어 X선 결정학 실험과 거의 동일하게 처리된다4.
MicroED는 원래 단백질 미세 결정 1,2를 조사하기 위해 개발되었습니다. 단백질 결정학의 병목 현상은 전통적인 싱크로트론 X선 회절 실험을 위해 크고 잘 정돈된 결정을 성장시키는 것입니다. 전자가 X선보다 훨씬 더 강한 물질과 상호 작용하기 때문에 검출 가능한 회절을 생성하는 데 필요한 결정 크기의 한계는 상당히 작습니다5. 또한, 탄성 산란 사건에 대한 탄성 산란 사건의 비율은 전자에 더 유리하며, 이는 더 작은 전체 노출로 더 유용한 데이터를 수집할 수 있음을 시사한다5. 지속적인 개발로 인해 가장 까다로운 미세 결정 6,7,8,9에서 MicroED 데이터를 수집할 수 있었습니다.
최근에, MicroED는 겉보기에 비정질 물질로부터 소분자 의약품의 구조를 결정하기 위한 강력한 도구인 것으로 나타났다10,11,12,13. 이러한 분말은 구입한 시약 병, 정제 컬럼 또는 알약을 미세 분말로 분쇄하여 직접 얻을 수 있습니다10. 이 분말은 눈으로 볼 때 비정질로 보이지만 완전히 나노 결정으로 구성되거나 더 큰 비결정질, 비정질 분획에 미량의 나노 결정 침전물을 포함 할 수 있습니다. 그리드에 대한 물질의 적용은 용이하며, 결정 식별, 스크리닝 및 데이터 수집의 후속 단계는 가까운 장래에 자동화될 수도 있다(14). 다른 사람들은 샘플 준비 및 데이터 수집을 위해 다른 방법을 사용할 수 있지만, 여기에서는 MicroED 및 데이터 수집을 위한 소분자 샘플 준비를 위해 Gonen 실험실에서 개발 및 사용되는 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
시료 전처리는 일반적으로 스크리닝 및 데이터 수집 세션 후에 최적화가 이루어지는 반복적인 프로세스입니다. 소분자 샘플의 경우, 많은 의약품이 소수성인 경향이 있기 때문에 그리드를 글로우 방전하지 않고 그리드 준비를 먼저 시도하는 것이 종종 현명합니다10,11. 그리드에 나노 결정 침전물이 너무 적으면 그리드를 먼저 글로우 방전한 후 다시 시…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gonen 연구소는 Howard Hughes Medical Institute의 기금으로 지원됩니다. 이 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health) P41GM136508의 지원을 받았다.
Materials
| 0.1-1.5mL Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 14-282-300 | Any vial or tube will do. |
| Autogrid clips | Thermo-Fisher | 1036173 | Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system. |
| Autogrid C-rings | Thermo-Fisher | 1036171 | |
| Carbamazapine | Sigma | C4024-1G | Any amount will suffice for these experiments |
| CMOS based detector | Thermo-Fisher | CetaD 16M | We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable. |
| Delphi software | Thermo-Fisher | N/A | Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage |
| EPU-D software | Thermo-Fisher | N/A | Commercial software for the acquisition of MicroED data |
| Glass cover slides | Hampton | HR3-231 | |
| Glow discharger | Pelco | easiGlow | |
| High PrecisionTweezers | EMS | 78325-AC | Any high precision tweezer will do |
| Liquid nitrogen vessel | Spear Lab | FD-800 | A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen – 800mL |
| SerialEM software | UC Boulder | N/A | Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology |
| TEM grids | Quantifoil/EMS | Q310CMA | Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon. |
| transmission electron microscope (TEM) | Thermo-Fisher | Talos Arctica | |
| Whatman circular filter paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | 90mm or larger |
References
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