Производство человеческих CRISPR-инженерных CAR-T-клеток

Терапия химерными антигенными рецепторами (CAR)-Т-клетками произвела революцию в области приемной клеточной терапии и иммунотерапии рака. CAR-T-клетки представляют собой инженерные Т-клетки, экспрессирующие синтетический иммунный рецептор, который сочетает антиген-специфический фрагмент одноцепочечного антитела с сигнальными доменами, полученными из цепи TCRzeta, и костимуляторными доменами, необходимыми и достаточными для активации Т-клеток и костимуляции^1,2,3,4 . Производство CAR-T-клеток начинается с извлечения собственных Т-клеток пациента, за которыми следует вирусная трансдукция ex vivo модуля CAR и расширение продукта CAR-T-клеток магнитными шариками, которые функционируют как искусственные антиген-презентационные клетки^5. Расширенные CAR-T-клетки повторно вводятся пациенту, где они могут приживляться, устранять опухолевые клетки-мишени и даже сохраняться в течение нескольких лет после инфузии^6,7,8. Хотя терапия CAR-T-клетками привела к замечательным показателям ответа при злокачественных новообразованиях В-клеток, клинический успех солидных опухолей был поставлен под сомнение несколькими факторами, включая плохую инфильтрацию Т-клеток^9,иммуносупрессивную микроокружение опухоли^10,охват и специфичность антигена и дисфункцию CAR-T-клеток^11,12 . Другое ограничение современной терапии CAR-T-клетками включает использование аутологицных Т-клеток. После нескольких раундов химиотерапии и высокой опухолевой нагрузки CAR-T-клетки могут быть низкого качества по сравнению с аллогенными продуктами CAR-T от здоровых доноров в дополнение ко времени и затратам, связанным с производством аутологичных CAR-T-клеток. Генное редактирование продукта CAR-T-клеток с помощью CRISPR/Cas9 представляет собой новую стратегию преодоления существующих ограничений CAR-T-клеток^{13,14,15,16,17.}

CRISPR/Cas9 представляет собой двухкомпонентную систему, которая может быть использована для целенаправленного редактирования генома в клетках млекопитающих^18,19. CRISPR-ассоциированная эндонуклеаза Cas9 может индуцировать сайт-специфические двухцепочечные разрывы, управляемые небольшими РНК, путем спаривания оснований с целевой последовательностью ДНК^20. При отсутствии шаблона восстановления двухцепочечные разрывы восстанавливаются по подверженному ошибкам пути негомологичных конечных соединений (NHEJ), что приводит к мутациям сдвига кадра или преждевременным стоп-кодонам через мутации вставки и делеции (INDL)^19,20,21. Эффективность, простота использования, экономичность и возможность мультиплексного редактирования генома делают CRISPR/Cas9 мощным инструментом для повышения эффективности и безопасности аутологичных и аллогенных CAR-T-клеток. Этот подход также может быть использован для редактирования TCR-направленных Т-клеток путем замены конструкции CAR на TCR. Кроме того, аллогенные CAR-T-клетки, которые имеют ограниченный потенциал вызывать болезнь трансплантата по сравнению с болезнью хозяина, также могут быть сгенерированы путем редактирования генов локуса TCR, b2m и HLA.

В этом протоколе мы показываем, как CRISPR-инженерия Т-клеток может быть объединена с вирусной векторной доставкой CAR-Transgene для генерации отредактированных геномом продуктов CAR-T-клеток с повышенной эффективностью и безопасностью. Принципиальная схема всего процесса показана на рисунке 1. Используя этот подход, мы продемонстрировали высокоэффективный нокаут гена в первичных клетках CAR-T человека. На рисунке 2A подробно описана временная шкала каждого этапа редактирования и изготовления Т-клеток. Также обсуждаются стратегии проектирования направляющей РНК и нокаутной валидации для применения этого подхода к различным генам-мишеням.