تلطيخ وتصوير عالي الدقة لنماذج عضوية وكروية ثلاثية الأبعاد
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولات مفصلة وقوية وتكميلية لأداء التصوير الملطخ والدقة تحت الخلوية لنماذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد الثابتة التي تتراوح من 100 ميكرومتر إلى عدة ملليمترات ، مما يتيح تصور مورفولوجيتها وتكوينها من نوع الخلية وتفاعلاتها.
Abstract
تعد نماذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد (3D) في المختبر ، مثل الكائنات العضوية والكروية ، أدوات قيمة للعديد من التطبيقات بما في ذلك التطوير ونمذجة الأمراض واكتشاف الأدوية والطب التجديدي. لاستغلال هذه النماذج بشكل كامل ، من الأهمية بمكان دراستها على المستويين الخلوي ودون الخلوي. ومع ذلك ، فإن توصيف نماذج زراعة الخلايا 3D في المختبر يمكن أن يكون تحديا تقنيا ويتطلب خبرة محددة لإجراء تحليلات فعالة. هنا ، تقدم هذه الورقة بروتوكولات مفصلة وقوية وتكميلية لأداء التصوير الملطخ والدقة تحت الخلوية لنماذج زراعة الخلايا 3D الثابتة في المختبر والتي تتراوح من 100 ميكرومتر إلى عدة ملليمترات. تنطبق هذه البروتوكولات على مجموعة واسعة من المواد العضوية والكروية التي تختلف في خلاياها الأصلية ومورفولوجيتها وظروف الثقافة. من حصاد هيكل 3D إلى تحليل الصور ، يمكن إكمال هذه البروتوكولات في غضون 4-5 أيام. باختصار ، يتم جمع الهياكل ثلاثية الأبعاد وتثبيتها ، ويمكن بعد ذلك معالجتها إما من خلال تضمين البارافين والتلوين النسيجي / المناعي الكيميائي ، أو مباشرة مناعية وإعدادها للمقاصة البصرية وإعادة البناء ثلاثي الأبعاد (عمق 200 ميكرومتر) بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر.
Introduction
على مدى العقود الماضية ، بشر التقدم في بيولوجيا الخلايا الجذعية وتقنيات زراعة 3D في المختبر بثورة في علم الأحياء والطب. أصبحت نماذج الخلايا عالية التعقيد في 3D شائعة جدا لأنها تسمح للخلايا بالنمو والتفاعل مع إطار خارج الخلية المحيط ، مما يلخص عن كثب جوانب الأنسجة الحية بما في ذلك هندستها المعمارية وتنظيم الخلايا وتفاعلاتها ، أو حتى خصائص الانتشار. على هذا النحو ، يمكن أن توفر نماذج زراعة الخلايا 3D رؤى فريدة حول سلوك الخلايا في الأنسجة النامية أو المريضة في المختبر. العضويات والكروية كلاهما هياكل ثلاثية الأبعاد متعددة الخلايا ، تتراوح من عدة ميكرومتر إلى ملليمترات ، وهي الأبرز في الهياكل ثلاثية الأبعاد في المختبر. يمكن استزراع كلاهما داخل سقالة داعمة بما في ذلك (i) الهلاميات المائية المشتقة من الحيوانات (مستخلص الغشاء القاعدي ، الكولاجين) ، النباتات (الجينات / الأغاروز) ، أو توليفها من المواد الكيميائية ، أو (ii) المصفوفات الخاملة التي تحتوي على مسام لتعزيز تكاثر الخلايا ونموها.
يمكن أن تتطور الكائنات العضوية والكروية أيضا دون وجود سقالة داعمة من خلال الاعتماد على الخلايا للتجميع الذاتي في مجموعات. يعتمد هذا على تقنيات مختلفة مثل استخدام مواد غير لاصقة لمنع ارتباط الخلية والتوتر السطحي وقوة الجاذبية (على سبيل المثال ، تقنيات الإسقاط المعلق) ، أو الدوران الدائري المستمر للأوعية (على سبيل المثال ، ثقافة الغزل). في جميع الحالات ، تسهل هذه التقنيات تفاعلات الخلية الخلوية ومصفوفة الخلية للتغلب على قيود ثقافة الخلايا أحادية الطبقة التقليدية1. تم استخدام المصطلحين “organoids” و “spheroids” بالتبادل في الماضي ، ولكن هناك اختلافات رئيسية بين هذين النموذجين لثقافة الخلايا 3D. الكائنات العضوية هي مجموعات خلوية 3D في المختبر مشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات أو الخلايا الجذعية الخاصة بالأنسجة ، حيث تنظم الخلايا نفسها تلقائيا في أسلاف وأنواع خلايا متمايزة والتي تلخص على الأقل بعض وظائف الجهاز محل الاهتمام2. تشتمل الأجسام الكروية على مجموعة واسعة من الهياكل ثلاثية الأبعاد متعددة الخلايا التي تشكلت في ظل ظروف غير ملتصقة ويمكن أن تنشأ من مجموعة كبيرة ومتنوعة من أنواع الخلايا مثل خطوط الخلايا الخالدة أو الخلايا الأولية3. ومن ثم ، فإن الكائنات العضوية المتأصلة في أصول الخلايا الجذعية الجوهرية لها ميل أعلى للتجميع الذاتي والجدوى والاستقرار من الأجسام الكروية.
ومع ذلك ، في جوهرها ، هذان النموذجان عبارة عن هياكل 3D تتكون من خلايا متعددة ، وبالتالي فإن التقنيات التي تم تطويرها لدراستها متشابهة جدا. على سبيل المثال ، تعد أساليب التصوير القوية على مستوى دقة الخلية الواحدة ضرورية للتحقق من التعقيد الخلوي لكل من المواد العضوية والكروية. هنا ، من خلال تلخيص خبرة هذه المجموعة وخبرة القادة في مجال العضويات4 ، تصف هذه الورقة الإجراءات التفصيلية لأداء تلطيخ ثنائي الأبعاد (2D) و 3D بالكامل ، والتصوير ، وتحليل التركيب الخلوي ودون الخلوي والتنظيم المكاني للعضويات والكروية التي تتراوح من 100 ميكرومتر إلى عدة ملليمترات. في الواقع ، يقدم هذا الإجراء نوعين مختلفين ومتكاملين من التلوين واكتساب التصوير لتحليل مجموعة كبيرة ومتنوعة من أحجام وأنواع نماذج زراعة الخلايا 3D في المختبر. يعتمد استخدام أحدهما (تحليل 3D بالكامل) أو الآخر (تحليل قسم 2D) على النموذج المدروس والإجابات المطلوبة. يمكن تطبيق التحليل الكامل ثلاثي الأبعاد بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر ، على سبيل المثال ، لتصور الخلايا في ثقافة ثلاثية الأبعاد يصل عمقها إلى 200 ميكرومتر ، بغض النظر عن الحجم الكلي للهيكل ثلاثي الأبعاد ، في حين أن تحليل أقسام ثنائية الأبعاد يوفر نظرة ثاقبة للعينات من أي حجم ، وإن كان ذلك على مستوى 2D. تم تطبيق هذا الإجراء بنجاح عبر مجموعة متنوعة من المواد العضوية4،5 والأجسام الكروية المشتقة من الخلايا البشرية والفئران ، والتي نشأت من طبقات جرثومية جنينية مختلفة. تظهر نظرة عامة على الإجراء في الشكل 1. يشار إلى المراحل الرئيسية والعلاقات بينها والخطوات الحاسمة والتوقيت المتوقع.
الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية على الإجراء. يتم جمع نماذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد في المختبر وتثبيتها ، ثم يتم إعدادها إما لتلطيخ التركيب الكامل ثلاثي الأبعاد (الخيار أ) أو تضمينها في البارافين للتقسيم والتلوين ثنائي الأبعاد (الخيار ب). بالنسبة لتجارب التلوين ثلاثية الأبعاد ، يتم تصنيف الهياكل ثلاثية الأبعاد الثابتة باتباع خطوة التثبيت. يمكن تنفيذ خطوة اختيارية للمسح البصري لتحسين جودة التصوير وعمق الفحص المجهري الضوئي عن طريق تقليل تشتت الضوء أثناء معالجة الصور. يتم التقاط الصور على مجهر متحد البؤر مقلوب أو نظام محتوى عالي متحد البؤر وتحليلها باستخدام البرنامج المناسب. بالنسبة لتضمين البارافين ، تتم معالجة الهياكل ثلاثية الأبعاد مباشرة (الخيار b.1 للهياكل الكبيرة ≥ 400 ميكرومتر) أو تضمينها في هلام (b.2 ؛ هياكل صغيرة ≤ 400 ميكرومتر) للجفاف وتضمين البارافين. ثم يتم قطع كتل البارافين وتلطيخها (تلطيخ نسيجي أو كيميائي مناعي). يتم الحصول على صور لأقسام 2D على ماسح ضوئي رقمي للشرائح أو مجهر مستقيم ويتم تحليلها على منصة تحليل الصور باستخدام التحليل الكمي الرقمي السريع. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Protocol
Representative Results
Discussion
زراعة الخلايا هي أداة لا غنى عنها للكشف عن الآليات البيولوجية الأساسية المشاركة في نمو الأنسجة والأعضاء ، والوظيفة ، والتجديد والاضطراب ، والمرض. على الرغم من أن ثقافة الخلايا ثنائية الأبعاد أحادية الطبقة قد سادت ، فقد تحولت الأبحاث الحديثة نحو الثقافات التي تولد هياكل 3D أكثر انعكاسا للاستجابات الخلوية في الجسم الحي ، ويرجع ذلك بشكل خاص إلى التنظيم المكاني الإضافي واتصالات الخلايا الخلوية التي تؤثر على التعبير الجيني والسلوك الخلوي وبالتالي يمكن أن توفر المزيد من البيانات التنبؤية7. ومع ذلك ، لا تزال هناك العديد من التحديات ، بما في ذلك الحاجة إلى تقنيات تلطيخ وتصوير سهلة الاستخدام للتصور المجهري التفصيلي وتقييم هياكل 3D المعقدة على المستويين الخلوي ودون الخلوي. في هذا السياق ، تم توفير بروتوكولات مفصلة وقوية وتكميلية لإجراء تلطيخ وتصوير خلوي وتحت خلوي لنماذج زراعة الخلايا 3D الثابتة في المختبر والتي تتراوح من 100 ميكرومتر إلى عدة ملليمترات في الحجم.
يقدم هذا الإجراء استراتيجيتين مختلفتين للتعامل مع مجموعة كبيرة ومتنوعة من الأحجام والأنواع من نماذج زراعة الخلايا 3D في المختبر. يعتمد اختيار أحدهما (تحليل 3D بالكامل) أو الآخر (تحليل التقسيم 2D) على النموذج المستخدم والمشكلة التي تم التحقيق فيها. يتيح التحليل الكامل ثلاثي الأبعاد بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر تصور الخلايا ذات العمق الممتد حتى 200 ميكرومتر ، بغض النظر عن الحجم الكلي للهيكل ثلاثي الأبعاد ، في حين أن التقسيم ثنائي الأبعاد ينطبق على العينات من أي حجم ، لكن التصور يظل بعديا ثنائي الأبعاد. فيما يلي بعض الاقتراحات لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها والاعتبارات الفنية.
فقدان هياكل 3D أثناء سير العمل هو العيب الأكثر شيوعا. يمكن أن تظل ملتصقة بالنصائح والأنابيب ، وهذا هو السبب في أن أطراف وأنابيب الطلاء المسبق بمحلول PBS-BSA 0.1٪ هو المفتاح. علاوة على ذلك ، من الأهمية بمكان ترك هياكل 3D الرواسب بين تغييرات الكاشف وأداء جميع عمليات السحب بعناية فائقة. كما هو مذكور في الإجراء ، بالنسبة لجميع الخطوات ، إذا كان ترسيب الهيكل ثلاثي الأبعاد طويلا جدا ، فيمكن تدوير الخلايا بلطف عند 50 × جم لمدة 5 دقائق في RT. اعتمادا على الهدف من الدراسة ، ينبغي النظر في مزايا / عيوب مثل هذه الخطوة الغزل كما يمكن أن الطرد المركزي يضر شكل الهياكل 3D. علاوة على ذلك ، يجب توخي الحذر للحفاظ على هذا التشكل أثناء خطوة التثبيت لأن الكائنات العضوية الكيسية تميل إلى الانهيار. يجب أن يمنع تثبيت الهياكل التي يقل حجمها عن 400 ميكرومتر التغييرات الهيكلية.
للحصول على العلامات المناعية المثلى ، يعد استرداد المواد العضوية من مصفوفات 3D خطوة حاسمة. يمكن أن تعيق مصفوفة 3D اختراق الأجسام المضادة الكافية أو تؤدي إلى تلطيخ الخلفية العالية بسبب الارتباط غير المحدد بالمصفوفة. قد تؤدي إزالة ECM إلى تغيير مورفولوجيا الأجزاء الخارجية من المواد العضوية (لا سيما في حالة النتوءات الخلوية الصغيرة الممتدة من هياكل 3D المدروسة) وتعيق التحليلات جزئيا. لمثل هذه الهياكل 3D ، يمكن الاحتفاظ بالمصفوفة طوال الإجراء ؛ ومع ذلك ، يجب تكييف ظروف الثقافة بعناية لنمو الخلايا في الحد الأدنى من المصفوفة لمنع الاختراق غير الكافي للحلول والأجسام المضادة وتجنب خطوات الغسيل المتتالية التي تهدف إلى تقليل ضوضاء الخلفية المفرطة 6,8.
تعتبر خطوة المقاصة البصرية الموضحة في هذا البروتوكول في قسم تلطيخ التركيب الكامل ثلاثي الأبعاد ذات صلة بتصوير الهياكل ثلاثية الأبعاد التي يصل عمقها إلى 150-200 ميكرومتر بدلا من 50-80 ميكرومتر دون تطهير. مقارنة بمنهجيات المقاصة الأخرى التي تتطلب في كثير من الأحيان عدة أسابيع وتستخدم عوامل إزالة سامة ، تم استخدام خطوة إزالة سريعة وآمنة منشورة مسبقا في هذا البروتوكول 4,9. بالإضافة إلى ذلك ، فإن خطوة المقاصة هذه قابلة للعكس ، ويمكن إضافة أجسام مضادة جديدة إلى التلوين الأولي دون فقدان الدقة أو السطوع4. ومع ذلك ، اعتمادا على نموذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد الذي تمت دراسته ، قد لا يكون عمق 150-200 ميكرومتر كافيا لتصوير بنية ثلاثية الأبعاد بطريقة إعلامية ، ويمكن أن يتسبب بروتوكول المقاصة هذا في حدوث تغييرات في التشكل العام للعضويات الكروية أحادية الطبقات ذات اللومن الكبير4. يجب على المستخدمين تصميم تجربتهم بعناية ، وإذا لزم الأمر ، تحسين توقيت خطوة النفاذية / الحجب (للسماح باختراق الأجسام المضادة والمحلول) ، وخطوة المقاصة (لاختراق أعمق من 200 ميكرومتر ، يجب مسح العينات تماما) ، والحصول على الصور. والتكنولوجيات الأكثر انتشارا المتاحة في المرافق الأساسية هما الصفيحة الضوئية والفحص المجهري متحد البؤر. سيحتاج المستخدمون إلى اختيار تقنية بعناية بناء على حجم هياكل 3D الخاصة بهم وسؤالهم البيولوجي10. ومع ذلك ، بالمقارنة مع الفحص المجهري متحد البؤر ، تظل دقة الفحص المجهري للصفائح الضوئية التي تم الحصول عليها لمثل هذه الهياكل العميقة دون المستوى الأمثل للحصول على دقة تحت خلوية.
هنا ، تم الإبلاغ عن عملية مفصلة وقوية مخصصة لتضمين البارافين لعينات واحدة. ومن المثير للاهتمام ، أن Gabriel et al. طورت مؤخرا بروتوكولا يتضمن ثقافات خلايا 3D في البارافين مع زيادة الإنتاجية. استخدموا قالب polydimethylsiloxane (PDMS) لحصر 96 بنية ثلاثية الأبعاد في نمط microarray في كتلة واحدة ، مما يوفر وجهات نظر جديدة للدراسات حول نماذج الورم ثلاثية الأبعاد التي تشمل المزيد من المجموعات والنقاط الزمنية وظروف العلاج وتكرار11. ومع ذلك ، تتطلب هذه الطريقة مهارات وآلات واسعة النطاق ، لا سيما لتصنيع القوالب الأولية المستخدمة لإنشاء قوالب PDMS.
باختصار ، تصف هذه الورقة نهجين مختلفين ومتكاملين وقابلين للتكيف مما يتيح الحصول على معلومات دقيقة وكمية عن التركيب المعماري والخلوي للنماذج الخلوية 3D. كلا المعلمتين ضروريتان لدراسة العمليات البيولوجية مثل عدم التجانس الخلوي داخل الورم ودوره في مقاومة العلاجات.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل جائزة سانت بالدريك روبرت جيه أرسيسي للابتكار # 604303.
Materials
| Equipment | |||
| Biopsy pad Q Path blue | VWR | 720-2254 | |
| Cassettes macrostar III Blc couv. Char. x1500 | VWR | 720-2233 | |
| Cassette microtwin white | VWR | 720-2183 | |
| Chemical hood | Erlab | FI82 5585-06 | |
| Filter tips 1000 µL | Star lab Tip-One | S1122-1730 | |
| Fine forceps | Pyramid innovation | R35002-E | |
| Flat-bottom glass tubes with PTFE lined 2 mL | Fisher Scientific | 11784259 | Excellent for environmental samples, pharmaceuticals and diagnostic reagents. PTFE is designed for the ultimate in product safety. PTFE provides totally inert inner seal and surface facing the sample or product. |
| Glass bottom dish plate 35 mm | Ibedi | 2018003 | |
| Horizontal agitation | N-BIOTEK | NB-205 | |
| Incubator prewarmed to 65 °C | Memmert Incubator | LAB129 | |
| Inox molds 15×15 | VWR | 720-1918 | |
| Microscope Slides Matsunami TOMO-11/90 | Roche diagnostics | 8082286001 | these slides are used for a better adhesion of sections |
| Microtome | Microm Microtech France | HM340E | |
| Panoramic scan II | 3dhistech | 2397612 | |
| Paraffin embedding equipment | Leica | EG1150C | |
| Plastic pipette Pasteur 2 mL | VWR | 612-1681 | |
| Q Path flacon 150mL cape blanc x250 | VWR | 216-1308 | Good for environmental samples, pharmaceuticals and diagnostic reagents. Polypropylene (PP) are rigid, solid, provide excellent stress crack and impact resistance and have a good oil and alcohol barrier and chemical resistance. PE-lined cap is stress crack resistant and offers excellent sealing characteristics. |
| Set of micropipettors (p200, p1000) | Thermo Scientific | 11877351 (20-200) 11887351(p1000) | |
| OPERA PHENIX | PerkinElmer | HH14000000 | |
| SP5 inverted confocal microscope | Leica | LSM780 | |
| Tissue cassette | VWR | 720-0228 | |
| Zeiss Axiomager microscope | Leica | SIP 60549 | |
| Reagent | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030-100G | |
| Cytoblock (kit) | Thermofisher Scientific | 10066588 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 57648266 | CAUTION: toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles. |
| Eosin aqueous 1% | Sigma-Aldrich | HT110316 | |
| Ethanol 96% | VWR | 83804.360 | CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles. |
| Ethanol 100% | VWR | 20821.365 | CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles. |
| Formalin 4% | Microm Microtech France | F/40877-36 | CAUTION: Formalin contains formaldehyde which is hazardous. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles. |
| Fructose | Sigma-Aldrich | F0127 | |
| Gill hematoxylin type II | Microm Microtech France | F/CP813 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | 500 mL |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | CAUTION: Suspected of causing genetic defects. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles. |
| Normal donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | 10 mL |
| Paraffin Wax tek III | Sakura | 4511 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) 1 X | Gibco | 14190-094 | |
| Tris-Buffered Saline (TBS) 10X | Microm Microtech France | F/00801 | 100 mL |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | CAUTION: Triton X100 is hazardous. Avoid contact with skin and eyes. |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | CAUTION: Xylene is toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles. |
| Solutions | |||
| Clearing solution | Glycerol-Fructose clearing solution is 60% (vol/w) glycerol and 2.5 M fructose. To prepare 10 mL of this solution, mix 6 mL of glycerol and 4.5 g of fructose. Complete to 10 mL with dH2O. Use a magnetic stirrer overnight. Refractive index = 1.4688 at room temperature (RT: 19–23 °C). Store at 4 °C in dark for up to 1 month. | ||
| PBS-BSA 0,1% solution | To prepare 0,1% (vol/wt) PBS-BSA 0,1% solution, dissolve 500 mg of BSA in 50 mL of PBS-1X (store at 4°C for up to 2 weeks). And dilute 1mL of this solution into 9mL of PBS-1X. This solution can be used to precoat the tip and centrifugation tube. | ||
| Permeabilisation-blocking solution (PB solution) | The PBSDT blocking solution is PBS-1X supplemented with 0.1% – 1% Tritonx-100 (depending on the protein localization membrane/nucleus), 1% DMSO, 1% BSA and 1% donkey serum (or from the animal in which the secondary antibodies were raised). This solution can be stored at 4°C for up to 1 month. | ||
| PB:PBS-1X (1:10) solution | PB:PBS-1X (1:10) solution is a 10 time diluted PB solution. To prepare 10 mL of this solution dilute 1 mL of PB solution in 9 mL of PBS-1X. | ||
| Software | |||
| Halo software | Indicalabs | NM 87114 | |
| Harmony software | PerkinElmer | HH17000010 | |
References
- Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells. Cells. 8 (12), 1-13 (2019).
- Bartfeld, S., Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).
- Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. Advances in multicellular spheroids formation. Journal of the Royal Society, Interface. 14 (127), (2017).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).
- Rezanejad, H., Lock, J. H., Sullivan, B. A., Bonner-Weir, S. Generation of pancreatic ductal organoids and whole-mount immunostaining of intact organoids. Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 82 (2019).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. Handling and assessment of human primary prostate organoid culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e59051 (2019).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews: Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Lazzari, G., et al. Light sheet fluorescence microscopy versus confocal microscopy: in quest of a suitable tool to assess drug and nanomedicine penetration into multicellular tumor spheroids. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 142, 195-203 (2019).
- Gabriel, J., Brennan, D., Elisseeff, J. H., Beachley, V. Microarray embedding/sectioning for parallel analysis of 3D cell spheroids. Scientific Reports. 9, 16287 (2019).
