Scipion을 가진 극저온 EM 및 단일 입자 분석

1. Scipion에서 프로젝트 생성 및 데이터 가져오기 Scipion을 열고 프로젝트 만들기를 클릭하고 프로젝트의 이름과 프로젝트가 저장될 위치를 지정합니다(추가 그림 1). Scipion은 캔버스를 보여주는 프로젝트 창을 열며, 왼쪽에는 사용 가능한 메서드 목록이 있는 패널이 있으며, 각각은 데이터를 관리하는 데 사용할 수 있는 하나의 이미지 처리 도구를 나타냅니다.참고: Ctrl+F 를 사용하여 목록에 나타나지 않는 경우 메서드를 찾을 수 있습니다. 현미경으로 촬영한 동영상을 가져오려면 pwem을 선택합니다 – 왼쪽 패널에서 영화를 가져오거나 Ctrl+F를 누를 때 입력합니다. 새 창이 열립니다(추가 그림 2). 여기에는 데이터에 대한 경로 및 수집 매개 변수가 포함됩니다. 이 예에서는 현미경 전압 300 kV, 구형 수차 2.0mm, 진폭 대비 0.1, 배율 50000, 이미지에서 샘플링 속도 모드, 픽셀 크기 1.34 Å 등의 설정을 사용합니다. 양식의 모든 매개 변수가 채워지면 실행 단추를 클릭합니다.참고: 메서드가 시작되면 캔버스에 실행으로 레이블이 지정된 노란색으로 상자가 나타납니다. 메서드가 완료되면 상자가 녹색으로 변경되고 레이블이 완료됩니다. 메서드를 실행하는 동안 오류가 발생하면 상자가 빨간색으로 표시되어 실패로 표시됩니다. 이 경우 출력 로그 탭에서 캔버스의 아래쪽 부분을 확인하여 오류에 대한 설명이 나타납니다. 메서드가 완료되면 요약 탭에서 캔버스의 하단 부분에 있는 결과를 확인합니다. 여기서 메서드에 의해 생성된 출력이 이 경우 영화 집합이 표시됩니다. 결과 분석 버튼을 클릭하면 영화 목록에 새 창이 나타납니다. 2. 영화 정렬 : 영화에서 마이크로 그래프로 광학 유량19을 구현하는 광학 정렬 – 방법 xmipp3을 사용합니다. 양식을 채우기 위해 다음 매개 변수를 사용합니다(추가 그림 3): 입력 동영상은 1단계에서 얻은 것, 프레임에서 정렬범위는 2에서 13사이이며, 다른 옵션은 기본 값과 함께 유지됩니다. 프로그램을 실행합니다.참고: 양식의 굵게 표시된 매개 변수는 항상 채워져야 합니다. 다른 값은 기본 값을 가지거나 의무적으로 필요하지 않습니다. 폼 창의 위쪽 부분에서 계산 리소스가 분산되는 필드를 스레드, MPI 또는 GPU로 찾을 수 있습니다. 결과 분석 을 클릭하여 얻은 현미경 그래프와 예상 교대의 궤적을 확인합니다(그림 1). 본 모든 현미경 그래프에 대해: 전력 스펙트럼 밀도(PSD), 카르테시안 및 극성 좌표에서 영화(프레임당 1점)를 정렬하기 위해 얻은 궤적, 그리고 얻어진 현미경 그래프의 파일 이름(클릭, 현미경 그래프를 검사할 수 있음)을 살펴보십시오. 영화의 단일 프레임과 비교하여 표본의 입자가 현미경 그래프에서 훨씬 더 많이 표시됩니다. 3. CTF 추정 : 현미경의 수차 계산 첫째, 방법 grigoriefflab을 사용 – ctffind15. 설정은 입력 현미경 그래프가 2단계의 출력이고 수동 CTF 다운샘플링 계수는 1.5로 설정되고 해상도 범위는 0.06에서 0.42로 바릅니다. 또한 고급 옵션(양식의 전문가 수준에서 이 옵션을 선택하여 찾을 수 있음)에서 창 크기를 256으로 설정합니다. 나머지 매개 변수는 기본 값(추가 그림 4)과 함께 유지됩니다.참고: Scipion의 대부분의 메서드에서 고급 옵션은 더 많은 구성 매개 변수를 표시합니다. 시작할 프로그램이 완전히 알려지고 매개 변수의 의미를 이해할 때 이러한 옵션을 신중하게 사용합니다. 일부 매개 변수는 데이터를 살펴보지 않고도 채우기 어려울 수 있습니다. 이 경우 Scipion은 오른쪽에 마법사 창(추가 그림 5)을 표시하는 마법의 지팡이를 보여줍니다. 예를 들어 이 양식의 해상도 필드에서는 이러한 값을 선택하여 첫 번째 0에서 PSD의 마지막 눈에 띄는 링까지 영역을 대략 커버하도록 선택해야 하므로 특히 유용합니다. 메서드가 완료되면 실행 및 분석 결과 (그림 2)를 클릭합니다. 예상 CTF가 실험용 CTF와 일치하는지 확인합니다. 이를 위해 PSD를 살펴보고 모서리의 예상 링과 데이터에서 오는 링을 비교합니다. 또한 얻은 디포커스 값을 확인하여 예기치 않은 값을 찾고 각 현미경그래프를 폐기하거나 다시 계산할 수 있습니다. 이 예제에서는 전체 현미경 그래프 집합을 사용할 수 있습니다.참고: 창 하단의 버튼을 사용하여 마이크로그래프의 하위 집합( 마이크로그래프 빨간색 버튼 사용)을 만들고 CTF(CTF 의 빨간색 버튼 재계산)를 다시 계산해야 하는 경우 다시 계산합니다. 이전 추정을 구체화하려면 xmipp3 – ctf 추정20을 사용합니다. 입력 현미경 2의 출력으로 선택하고, 이전 CTF 추정이 grigoriefflab – ctffind의 출력을 선택하고, 고급 수준에서, 256 (보충 도 6)의 출력을 선택으로, 이전 CTF 추정에서 defoci를 사용합니다. 실행합니다. 결과 분석 분석을 클릭하여 얻은 CTF를 확인합니다. 이 방법을 사용하면 더 많은 데이터가 추정되고 일부 추가 열에 표시됩니다. 그 중 어느 것도 잘못된 추정 값을 나타내지 않기 때문에 모든 현미경 사진은 다음 단계에서 사용됩니다. 4. 입자 따기 : 현미경 그래프에서 입자찾기 따기를 시작하기 전에 현미경 사진의 사전 프로세스를 수행합니다. 오픈 xmipp3 – 사전 처리 현미경, 입력 현미경으로 설정 2 단계에서 얻은 것과 옵션을 선택 나쁜 픽셀을 제거? Stddev의 배수 5, 다운 샘플 현미경 사진? 2의 다운 샘플링 계수 (보충 도 7). 실행을 클릭하고 결과 현미경 사진의 크기가 감소되었는지 확인합니다. 피킹 용 xmipp3 – 수동 따기 (1 단계) 및 xmipp3 – 자동 따기 (단계 2)21. 수동 피킹을 사용하면 자동 따기 단계가 전체 파티클 집합을 학습하고 생성하는 파티클 집합을 수동으로 준비할 수 있습니다. 첫째, xmipp3 실행 – 입력 현미경으로 수동 따기 (1 단계)를 이전 전공정에서 얻은 현미경으로. 실행을 클릭하면 새 대화형 창이 나타납니다(그림 3). 이 창에서 현미경 사진(그림 3a) 및 기타 옵션 목록이 표시됩니다. 크기(px) 를 150으로 변경하면 각 파티클이 포함된 상자의 크기가 됩니다. 선택한 현미경이 더 큰 창에 나타납니다. 영역을 선택하고 그 안에 있는 모든 표시되는 파티클을 선택합니다(그림 3b). 그런 다음 학습 활성화 를 클릭하여 학습을 시작합니다. 현미경 그래프의 나머지 영역은 자동으로 선택됩니다(그림 3c). 선택한 파티클을 확인하고 클릭하여 더 많이 포함하거나 필요한 경우 shift+클릭으로 잘못된 입자를 제거합니다. 첫 번째 창에서 다음 현미경 그래프를 선택합니다. 현미경 그래프는 자동으로 선택됩니다. 필요한 경우 일부 파티클을 포함하거나 제거하려면 다시 확인하십시오. 약 5개의 현미경으로 이 단계를 반복하여 대표 교육 세트를 만듭니다. 이 작업이 완료되면 주 창의 좌표를 클릭하여 선택한 모든 파티클의 좌표를 저장합니다. 파티클의 교육 세트는 모든 현미경 에 대한 프로세스를 완료하기 위해 자동 따기로 이동 할 준비가되어 있습니다. 오픈 xmipp3 – Xmipp 입자 따기에서 나타내는 자동 따기 (2 단계)는 이전 수동 피킹을 실행하고, 마이크로 그래프는 감독과 동일하게 선택합니다. 실행을 클릭합니다. 이 메서드는 약 100000 좌표 집합을 출력으로 생성합니다. 컨센서스 접근 방식을 적용하므로 두 가지 방법이 모두 동의하는 파티클을 선택하는 두 번째 선택 방법을 수행하십시오. 오픈 스퍼퍼 – cryolo picking14 및 입력 현미경으로 미리 처리 된 현미경 그래프를 선택, 일반 모델을 사용하려면 예, 신뢰 임계값 0.3, 상자 크기 150 (보충 도 8). 실행합니다. 이 메서드는 약 100000 좌표를 생성해야 합니다. 실행 xmipp3 – 깊은 합의 따기22. 입력 좌표에는 스파이어의 출력이 포함되기 때문에 크라이올로 피킹 (단계 4.7) 및 xmipp3 – 자동 따기 (단계 4.6), 사전 학습된 모델 유형 선택 설정, 사전 학습 된 모델로 직접 학습 및 점수를 건너 뛰기? 예 (보충 그림 9). 실행합니다. 결과 분석을 클릭하고 새 창에서 높은 ‘zScoreDeepLearning1’ 값을 가진 파티클/좌표 선택 옆에 있는 눈 아이콘을 클릭합니다. 새 창은 모든 파티클 목록(그림 4)과 함께 열립니다. 열의 zScore 값은 파티클의 품질에 대한 통찰력을 제공하며 값이 낮으면 품질이 좋지 않습니다. 레이블을 클릭_xmipp_zScoreDeepLearning 가장 높은 zScore에 파티클을 주문합니다. zScore 가 0.75보다 높은 파티클 을 선택하고 좌표를 클릭하여 새 하위 집합을 만듭니다. 이렇게 하면 약 50000개의 좌표가 있는 하위 집합이 생성되어야 합니다. 오픈 xmipp3 – 깊은 현미경 사진 클리너. 입력이 이전 단계에서 얻은 하위 집합을 좌표로 선택하고, 마이크로그래프는 좌표와 동일하게 소스로 설정하고 임계값을 0.75로 유지합니다. 실행합니다. 요약 탭에서 좌표 수가 줄었는지는 확인하지만 이 경우 좌표만 제거됩니다.참고: 이 단계는 좌표 세트를 추가로 청소할 수 있으며 탄소 영역 이나 큰 불순물로 더 많은 영화 아티팩트로 다른 데이터 집합을 청소하는 데 매우 유용 할 수 있습니다. xmipp3 실행 – 추출 입자 (보충 도 10). 입력이 이전 단계 이후 얻은 좌표로 나타내고, 마이크로그래프는 다른 단계의 출력으로, 입력 현미경은 단계 2의 출력으로, CTF 추정은 xmipp3의 출력으로 – ctf 추정, 3까지의 다운샘플링 계수, 및 파티클 박스 크기가 100으로 나타낸다. 양식의 사전 처리 탭에서 모두에게 예를 선택합니다. 실행합니다. 출력에 100×100 픽셀의 크기가 감소된 파티클과 4.02Å/px의 픽셀 크기가 포함되어야 하는지 확인합니다. 다시 xmipp3 실행 – 다음 매개 변수를 변경 추출 입자 : 1로 다운 샘플링 계수 , 파티클 상자 크기 는 300로. 출력이 동일한 파티클 집합이지만 이제 전체 해상도로 확인합니다. 5. 2D 분류: 유사한 파티클을 함께 그룹화 4.11 단계에서 얻은 것과 같이 입력 입자가 있는 2d 분류11을 열고, 2D 분류 탭에서 클래스 수를 128로 열어 기본 값으로 다른 모든 매개 변수를 유지합니다. 실행합니다. 결과 분석을 클릭한 다음 Scipion을 사용하여 파티클 클래스 표시 옆에 있는 눈 아이콘을 클릭합니다(그림 5). 이 분류는 여러 클래스가 시들게 표시되거나 아티팩트로 표시되기 때문에 파티클 집합을 청소하는 데 도움이 됩니다. 좋은 뷰가 포함된 클래스를 선택합니다. 파티클(창 아래쪽의 빨간색 버튼)을 클릭하여 더 깨끗한 하위 집합을 만듭니다. 이제 xmipp3 – cl2d23을 열고 입력 이미지로 설정하여 이전 단계에서 얻은 이미지와 클래스 수를 128로 설정합니다. 실행을 클릭합니다.참고: 이 두 번째 분류는 파티클 집합의 추가 세척 단계로 사용됩니다. 일반적으로 가능한 한 많은 시끄러운 입자를 제거하는 것이 유용합니다. 그러나 더 간단한 워크플로우를 원하는 경우 하나의 2D 분류 방법만 사용할 수 있습니다. 메서드가 완료되면 결과 분석 및 표시 할 내용 : 클래스를 클릭하여 생성 된 128 클래스를 확인합니다. 생성된 클래스의 대부분은 어느 정도의 세부 사항을 가진 거대 분자의 투영을 보여줍니다. 그러나 일부 사람들은 시끄러운 것처럼 보입니다(이 예에서는 약 10개의 클래스). 모든 좋은 클래스를 선택하고 클래스 버튼을 클릭하여 좋은 클래스만 사용하여 새 하위 집합을 생성합니다. 이 하위 집합은 초기 볼륨을 생성하는 방법 중 하나에 대한 입력으로 사용됩니다. 동일한 선택된 클래스를 사용하면 파티클 을 클릭하여 잘못된 클래스에 속한 클래스를 제거한 후 더 깨끗한 하위 집합을 만듭니다. 오픈 pwem – 4.13 (전체 크기의 모든 파티클)의 출력으로 항목의 전체 세트와 하위 집합, 아니오로 임의의 하위 집합을 확인, 다른 세트는 이전 단계에서 만든 파티클의 하위 집합으로, 교차로 작업을 설정합니다. 이렇게 하면 전체 해상도의 파티클에서 이전 하위 집합이 추출됩니다. 6. 초기 볼륨 추정 : 3D 볼륨의 첫 번째 추측을 구축 이 단계에서는 서로 다른 방법으로 두 개의 초기 볼륨을 추정한 다음 컨센서스 도구를 사용하여 최종 추정 된 3D 볼륨을 생성합니다. 열기 xmipp3 – 5단계 이후 얻은 것과 같이 입력 클래스로 중요한24 메서드를 재구성하고 대칭 그룹을 c1로 재구성하고 나머지 매개 변수를 기본 값(보충 도 11)으로 유지합니다. 실행합니다. 결과 분석을 클릭합니다. 크기 100x100x100 픽셀의 낮은 해상도 볼륨과 4.02Å/px의 픽셀 크기를 얻을 수 있는지 확인합니다. 오픈 xmipp3 – 이전 단계에서 얻은 입력 볼륨으로 사용하는 자르기/크기 조정 볼륨(추가 그림 12) 볼륨 크기를 조정하고, 볼륨 크기를 조정하려면 예, 샘플링 속도로 크기를 조정하고 샘플링 속도를 1.34 Å/px로 조정합니다. 실행합니다. 출력 볼륨에 올바른 크기가 있는 요약 탭을 확인합니다. 이제 두 번째 초기 볼륨을 만듭니다. 열기 리온 – 3D 초기 model10, 입력 입자가 전체 해상도 (5.5의 출력)에서 좋은 입자를 사용하고 입자 마스크 직경을 402Å로 설정하여 나머지 매개 변수를 기본 값으로 유지합니다. 실행합니다. 결과 분석 한 다음 표시 볼륨에서 슬라이스를 클릭합니다. 낮은 해상도 볼륨하지만 구조의 주요 형상이 얻어지는지 확인합니다(보충 도 13). 이제 열기 pwem – 결합 방식에 대한 입력을 만들기 위해 두 개의 생성된 초기 볼륨을 결합하는 집합을 조인합니다. 볼륨을 입력 유형으로 표시하고 입력 집합의 두 개의 초기 볼륨을 선택하기만 하면 됩니다. 실행합니다. 출력은 두 볼륨을 모두 가진 두 개의 항목을 포함하는 집합이어야 합니다. 합의 도구는 xmipp3에 포함 된 것입니다 – 군단 합의25. 그거 여세요. 전체 크기 이미지 로 사용하면 초기 볼륨이 이전 단계에서 생성된 두 개의 항목으로 세트를 볼륨 하고 대칭 그룹이 c1인지 확인하므로 전체 해상도(출력 5.5)에서 좋은 파티클을 사용합니다. 실행을 클릭 합니다. 결과 분석을 클릭합니다. 보다 자세한 출력 볼륨이 얻어지는지 확인합니다(그림 6). 구조물을 둘러싼 소음이 더 많지만 구조 맵에 자세한 내용을 두면 로컬 미니마를 피하기 위한 다음 구체화 단계에 도움이 됩니다.참고: UCSF Chimera26 을 사용할 수 있는 경우 창 상단의 마지막 아이콘을 사용하여 획득한 볼륨의 3D 시각화를 만듭니다. 릴리온을 열고 실행 – 3D 자동 정제10을 통해 파티클의 첫 번째 3D 각도 할당을 합니다. 입력 입자로 5.5의 출력을 선택하고 파티클 마스크 직경을 402Å로 설정합니다. 참조 3D 맵 탭에서 이전 단계에서 얻은 입력 볼륨, c1로 대칭, 초기 로우패스 필터를 30Å로 선택합니다(보충 도 14). 결과 분석을 클릭합니다. 새 창에서 파이널을 볼륨으로 선택하고 표시 볼륨을 클릭합니다. 또한 결과 창의 디스플레이 해상도 플롯과 디스플레이 각 분포의 각 범위: 2D 플롯(그림 7)을 클릭하여 푸리에 쉘 상관관계(FSC)를 확인합니다. 재구성된 볼륨에는 훨씬 더 많은 세부 정보(구조의 바깥부분에 일부 흐린 영역)가 포함되어 있으며 FSC는 4.5Å 주위의 0.143 임계값을 교차합니다. 각 범위는 전체 3D 구를 다룹니다. 7.3D 분류: 형태 적 상태 발견 합의 방식을 사용하여 다른 형태 상태가 데이터에 있는 경우 발견할 수 있습니다. 열기 리온 – 3D 분류10 (보충 도 15). 입력 입자 는 6.10에서 얻은 입자 를 사용하고 파티클 마스크 직경 을 402Å로 설정합니다. 참조 3D 맵 탭에서 6.10단계 이후에 얻은 입력 볼륨 으로 사용하고 대칭을 c1로 설정하고 초기 로우패스 필터 를 15Å로 설정합니다. 마지막으로 최적화 탭에서 클래스 수를 3개로 설정합니다. 실행합니다. 결과 분석 을 클릭하여 결과를 확인하고 Scipion에서 분류 표시를 선택합니다. 생성된 세 가지 클래스와 몇 가지 흥미로운 조치가 표시됩니다. 처음 두 클래스에는 비슷한 수의 할당된 이미지(크기 열)가 있어야 하며 매우 유사해야 하며, 세 번째 클래스는 이미지 수가 적고 모양이 더 흐려집니다. 또한, rln정확도 회전 및 rln정확도번역은 처음 두 클래스에 대해 명확하게 더 나은 것이어야 합니다. 두 개의 최고의 클래스를 선택하고 클래스 버튼을 클릭하여 클래스가 포함된 하위 집합을 생성합니다. 7.1 및 7.2 단계를 반복하여 두 번째 좋은 클래스 그룹을 생성합니다. 둘 다 컨센서스 도구의 입력이 될 것입니다. xmipp3 열기 및 실행 – 합의 클래스 3D및 입력 클래스로 이전 단계에서 생성 된 두 개의 하위 집합을 선택합니다. 결과 분석을 클릭합니다. 클래스 간의 일치 입자의 수가 제시된다: 첫 번째 값은 서브 세트 1의 첫 번째 클래스와 서브 세트 2의 첫 번째 클래스에서 일치 입자의 수이며, 두 번째 값은 하위 집합 1및 하위 집합 2의 첫 번째 클래스에서 일치 입자의 수입니다. 파티클이 하나 또는 두 개의 클래스에 무작위로 할당되어 있는지 확인하므로 3D 분류 방법이 변형 변화를 찾을 수 없습니다. 이 결과를 감안할 때 전체 파티클 집합이 처리를 계속하는 데 사용됩니다. 8.3D 세련미: 동질모의 각할당 을 정제 다시 말하지만, 이 단계에서 합의 접근 방식을 적용합니다. 첫째, pwem을 열고 실행 – 6.9의 출력으로 항목의 전체 세트와 하위 집합, 예에 임의의 하위 집합을 확인하고, 5000 요소의 수. 이를 통해 다음 단계에서 사용되는 메서드를 학습하기 위해 이전 정렬이 있는 이미지의 하위 집합이 만들어집니다. open xmipp3 – 딥 정렬, 입력 이미지를 5.5에서 얻은 양량의 출력으로 설정하고, 6.10 이후에 얻은 양체 , 입력 훈련 세트 는 이전 단계에서 생성된 것으로 설정되고, 목표 해상도 를 10Å로 설정하고, 나머지 매개 변수를 기본 값으로 유지한다(보충 도 16). 실행을 클릭 합니다. 결과를 분석하려면 검색된 각도 분포를 확인하며, 경로가 누락되지 않고 각 커버리지가 6.10(그림 8)에 비해 약간 향상됩니다. xmipp3 열기 및 실행 – 각도를 비교 하고 입력 입자 1 의 출력6.9 및 입력 입자 2 의 출력으로 선택하여 8.2의 출력을 선택하여 대칭 그룹이 c1인지 확인합니다. 이 방법은 xmipp3 – 깊은 정렬 및 리온 – 3D 자동 정제 사이의 계약을 계산합니다. 결과 분석을 클릭하면 이동과 각도의 차이가 있는 파티클 목록이 표시됩니다. 창 의 상단 부분에있는 막대 아이콘을 클릭, 계산 된 변수의 플롯을 만들 수 있도록 다른 창이 열립니다 열립니다. _xmipp_angleDiff 선택하고 플롯 을 클릭하여 파티클당 각 차이의 표현을 확인합니다. _xmipp_shiftDiff 똑같이 하십시오. 이 수치에서, 입자의 절반정도에서 두 방법이 모두 동의한다(도 9). 각도 차이가 10º보다 낮은 파티클을 선택하고 새 하위 집합을 만듭니다. 지금, 오픈 xmipp3 – highres27 할당 된 각도의 로컬 개선을 할 수 있습니다. 먼저, 이전 단계에서 얻은 이미지를 풀 사이즈 이미지로 선택하고 초기 볼륨으로 출력6.9, 파티클 반경을 150픽셀로 설정하고 대칭 그룹을 c1로 설정합니다. 각도 할당 탭에서 이미지 정렬을 로컬로 설정, 반복 수를 1로 설정하고 Max를 설정합니다. 5Å/px로 목표 해상도 (보충 그림 17). 실행합니다. 요약 탭에서 출력 볼륨이 300x300x300 픽셀보다 작고 픽셀 크기가 약간 높은지 확인합니다. 결과를 분석하려면 얻은 결과를 확인합니다. FSC를 보려면 디스플레이 해상도 플롯을 클릭하고 디스플레이 볼륨에서: 재구성된 볼륨(추가 그림 18)을 확인합니다. 4-3.5Å에 가까운 좋은 해상도 볼륨이 얻어진다. 출력 파티클 표시를 클릭하고 파티클 목록이 있는 창에서 막대 아이콘을 클릭합니다. 새 창에서 100개의 빈이 있는 히스토그램으로 유형을 선택하고 _xmipp_cost 레이블을 선택하고 마지막으로 플롯(추가 그림 19)을 누릅니다. 이렇게 하면 비용 레이블의 히스토그램이 제시되며, 여기에는 파티클의 상관관계가 선택된 투영 방향과 포함됩니다. 이 경우, 단모달 밀도 함수가 얻어지며, 이는 입자 집합에 다른 집단을 갖지 않는다는 신호이다. 따라서 그들 모두는 정제를 계속하는 데 사용됩니다참고: 다중 모달 밀도 함수를 볼 경우 더 높은 최대값에 속하는 파티클 집합을 선택하여 워크플로우만 계속해야 합니다. 열고 다시 xmipp3 실행 – 이전 실행에서 계속 높은? 예, 8.5 이후 얻은 전체 크기 이미지 로 설정하고 Xmipp Highres의 이전 실행과 함께 이전 실행을 선택합니다. 각 할당 탭에서 이미지 정렬 을 로컬로 설정하고 1회 반복과 2.6Å/px를 대상 해상도(전체 해상도)로 설정합니다. 이제 출력에는 전체 해상도(크기 300x300x300 픽셀)의 볼륨이 포함되어야 합니다. 결과를 분석 하려면 얻은 볼륨과 FSC를 다시 확인하며, 이제 약 3Å(그림 10)에서 고해상도 볼륨이어야 합니다. 9. 평가 및 후처리 오픈 xmipp3 – 로컬 MonoRes28. 이 메서드는 로컬로 해상도를 계산합니다. 입력 볼륨으로 설정 8.10 후 얻은 볼륨, 설정 절반 볼륨을 사용 하시겠습니까? 실행합니다. 결과 분석을 클릭하고 해상도 히스토그램 표시를 선택하고 컬러 슬라이스 표시(그림 11)를 선택합니다. 볼륨의 다른 부분의 해상도가 표시됩니다. 구조의 중앙 부분의 복셀의 대부분은 3Å 주위에 해상도를 제시해야하며, 최악의 해상도는 외부 부분에서 달성된다. 또한 복셀 당 해상도의 히스토그램은 (아래도) 3Å 주위에 피크와 함께 표시됩니다. xmipp3를 열고 실행 – localdeblur 선명하게 29를 선명하게 적용합니다. 8.10에서 얻은 입력 맵으로 선택하고 해상도 맵으로 모노Re를 사용하여 이전 단계에서 얻은 맵으로 선택합니다. 결과 분석 분석을 클릭하여 얻은 볼륨을 확인합니다. 알고리즘의 마지막 반복에 해당하는 마지막 반복을 엽니다. UCSF Chimera26과 같은 다른 도구로 볼륨을 열어 볼륨의 특징을 3D로 더 잘 볼 수 있도록 하는 것이 좋습니다(그림 12). 마지막으로 xmipp3에 포함된 유효성 검사 도구를 엽니다- 파티클 수와 함께 해상도가 어떻게 변경되는지 보여 주는 overfitting30의 유효성을 검사합니다. 그것을 열고 8.5 단계에서 얻은 입자를 입력 입자로 포함하고, 해상도에 대한 경계 노이즈 계산을 설정하려면 초기 3D 참조 볼륨을 8.10의 출력으로 설정합니다. 고급 옵션에서는 파티클 수를 “500 1000 1500 2000 2000 3000 5000 1000 15000 2000″(보충 그림 20)으로 설정합니다. 실행합니다. 결과를 분석하려면 클릭합니다. 재구성에 사용되는 입자수가 증가함에 따라 녹색 선에서 해상도의 진화와 함께 두 플롯(그림 13)이 나타납니다. 빨간색 선은 정렬 된 가우시안 소음의 재구성으로 달성 된 해상도를 나타냅니다. 해상도는 입자의 수와 노이즈로부터의 입자에 비해 재구성의 큰 차이로 향상되며, 이는 좋은 구조 정보를 갖는 입자를 갖는 지표이다. 이전 결과에서, 처리후 부피에서 모델의 피팅이 수행될 수 있으며, 이는 거대 분자의 생물학적 구조를 발견할 수 있게 하였다.