Cryo-EM et analyse monoparticule avec Scipion

1. Création d’un projet dans Scipion et importation des données Ouvrez Scipion et cliquez sur Créer un projet, spécifiez le nom du projet et l’emplacement où il sera enregistré (Figure supplémentaire 1). Scipion ouvrira la fenêtre du projet montrant un canevas avec, sur le côté gauche, un panneau avec une liste de méthodes disponibles, chacune d’entre elles représente un outil de traitement d’image qui peut être utilisé pour gérer les données.Remarque : Ctrl + F peut être utilisé pour trouver une méthode si elle n’apparaît pas dans la liste. Pour importer les films pris au microscope, sélectionnez le pwem – importer des films sur le panneau de gauche (ou tapez-le en appuyant sur Ctrl + F). Une nouvelle fenêtre s’ouvrira (Figure supplémentaire 2). Là, incluez le chemin d’accès aux données et les paramètres d’acquisition. Dans cet exemple, utilisez la configuration suivante : Tension du microscope 300 kV, Aberration sphérique 2,0 mm, Contraste d’amplitude 0,1, Taux de grossissement 50000, Mode Taux d’échantillonnage vers Image de l’expéditeur et Taille de pixel 1,34 Å. Lorsque tous les paramètres du formulaire sont remplis, cliquez sur le bouton Exécuter .Remarque : Lorsqu’une méthode démarre, une zone apparaît dans la zone de travail en couleur jaune étiquetée comme en cours d’exécution. Lorsqu’une méthode se termine, la zone passe au vert et l’étiquette devient terminée. En cas d’erreur lors de l’exécution d’une méthode, la case apparaîtra en rouge, étiquetée comme ayant échoué. Dans ce cas, vérifiez la partie inférieure du canevas, dans l’onglet Journal de sortie , une explication de l’erreur apparaîtra. Une fois la méthode terminée, vérifiez les résultats dans la partie inférieure du canevas dans l’onglet Résumé . Ici, les sorties générées par la méthode sont présentées, dans ce cas, l’ensemble des films. Cliquez sur le bouton Analyser les résultats et une nouvelle fenêtre apparaîtra avec la liste des films. 2. Alignement des films : des films aux micrographies Utilisez la méthode xmipp3 – alignement optique qui implémente le flux optique19. Utilisez les paramètres suivants pour remplir le formulaire (Figure supplémentaire 3) : les films d’entrée sont ceux obtenus à l’étape 1, la plage dans Images à ALIGN est comprise entre 2 et 13, les autres options restent avec les valeurs par défaut. Exécutez le programme.REMARQUE : Les paramètres en gras dans un formulaire doivent toujours être remplis. Les autres auront une valeur par défaut ou ne seront pas obligatoirement requis. Dans la partie supérieure de la fenêtre de formulaire, les champs où les ressources de calcul sont distribuées peuvent être trouvés, sous forme de threads, d’IPM ou de GPU. Cliquez sur Analyser les résultats pour vérifier les micrographies obtenues et la trajectoire des décalages estimés (Figure 1). Pour chaque micrographie vue : regardez la densité spectrale de puissance (PSD), les trajectoires obtenues pour aligner le film (un point par image) en coordonnées cartésiennes et polaires, et le nom de fichier de la micrographie obtenue (en cliquant dessus, la micrographie peut être inspectée). Notez que les particules de l’échantillon sont beaucoup plus visibles dans la micrographie, par rapport à une seule image du film. 3. Estimation CTF : calcul des aberrations du microscope Tout d’abord, utilisez la méthode grigoriefflab – ctffind15. La configuration est la suivante: les micrographies d’entrée sont la sortie de l’étape 2, le facteur de sous-échantillonnage manuel CTF est défini sur 1,5 et la plage de résolution va de 0,06 à 0,42. De plus, dans les options Avancées (qui peuvent être trouvées en sélectionnant ce choix dans le niveau Expert du formulaire), définissez la taille de la fenêtre sur 256. Les paramètres restants restent avec les valeurs par défaut (figure supplémentaire 4).REMARQUE: Dans la plupart des méthodes de Scipion, l’option Avancé affiche plus de paramètres de configuration. Utilisez ces options avec précaution, lorsque le programme à lancer est complètement connu et que la signification des paramètres est comprise. Certains paramètres peuvent être difficiles à remplir sans avoir à regarder les données; dans ce cas, Scipion montre une baguette magique sur le côté droit qui montrera une fenêtre d’assistant (Figure supplémentaire 5). Par exemple, dans le champ Résolution de ce formulaire est particulièrement utile, car ces valeurs doivent être sélectionnées pour couvrir approximativement la région du premier zéro au dernier anneau perceptible de la DSP. Cliquez sur Exécuter et sur Analyser les résultats (Figure 2) lorsque la méthode est terminée. Vérifiez que le CTF estimé correspond à celui expérimental. À cette fin, examinez la DSP et comparez les anneaux estimés dans le coin avec ceux provenant des données. Vérifiez également les valeurs de défocalisation obtenues pour trouver des valeurs inattendues et les micrographies respectives peuvent être jetées ou recalculées. Dans cet exemple, l’ensemble des micrographies peut être utilisé.REMARQUE: Utilisez les boutons dans la partie inférieure de la fenêtre pour créer un sous-ensemble de micrographies (avec le bouton rouge Micrographies ) et pour recalculer un CTF (avec le bouton rouge Recalculer les CTF ), en cas de besoin. Pour affiner l’estimation précédente, utilisez xmipp3 – ctf estimation20. Sélectionnez comme Micrographies d’entrée la sortie de l’étape 2, sélectionnez l’option Utiliser defoci d’une estimation CTF précédente, comme Estimation CTF précédente choisissez la sortie de grigoriefflab – ctffind et, dans le niveau Avancé, modifiez la taille de la fenêtre à 256 (Figure supplémentaire 6). Exécutez-le. Cliquez sur Analyser les résultats pour vérifier les CTF obtenus. Avec cette méthode, plus de données sont estimées et représentées dans quelques colonnes supplémentaires. Comme aucune d’entre elles ne montre de valeurs estimées incorrectes, toutes les micrographies seront utilisées dans les étapes suivantes. 4. Prélèvement de particules : trouver des particules dans les micrographies Avant de commencer la cueillette, effectuez un prétraitement des micrographies. Ouvrez xmipp3 – prétraitez les micrographies, définissez comme micrographies d’entrée celles obtenues à l’étape 2 et sélectionnez les options Supprimer les pixels défectueux? avec Multiple de Stddev à 5 et Micrographies de sous-échantillonnage? avec un facteur de sous-échantillonnage de 2 (Figure supplémentaire 7). Cliquez sur Exécuter et vérifiez que la taille des micrographies résultantes a été réduite. Pour le picking, utilisez xmipp3 – manual-picking (étape 1) et xmipp3 – auto-picking (step 2)21. Le picking manuel permet de préparer manuellement un ensemble de particules avec lesquelles l’étape d’auto-picking apprendra et générera l’ensemble complet de particules. Tout d’abord, exécutez xmipp3 – prélèvement manuel (étape 1) avec des micrographies d’entrée comme micrographies obtenues dans le préprocessus précédent. Cliquez sur Exécuter et une nouvelle fenêtre interactive apparaîtra (Figure 3). Dans cette fenêtre, une liste des micrographies (Figure 3a) et d’autres options est présentée. Changez la taille (px) à 150, ce sera la taille de la boîte contenant chaque particule. La micrographie sélectionnée apparaît dans une fenêtre plus grande. Choisissez une région et choisissez toutes les particules visibles qu’elle contient (Figure 3b). Ensuite, cliquez sur Activer la formation pour commencer l’apprentissage. Les autres régions de la micrographie sont automatiquement prélevées (Figure 3c). Vérifiez les particules sélectionnées et incluez-en d’autres en cliquant dessus, ou supprimez les mauvaises avec Maj + clic, si nécessaire. Sélectionnez la micrographie suivante dans la première fenêtre. La micrographie sera automatiquement prélevée. Vérifiez à nouveau pour inclure ou enlever certaines particules, si nécessaire. Répétez cette étape avec environ 5 micrographies pour créer un ensemble de formation représentatif. Une fois cela fait, cliquez sur Coordonnées dans la fenêtre principale pour enregistrer les coordonnées de toutes les particules sélectionnées. L’ensemble de particules d’entraînement est prêt à passer au prélèvement automatique pour terminer le processus pour toutes les micrographies. Ouvrez xmipp3 – prélèvement automatique (étape 2) indiquant dans le prélèvement de particules Xmipp exécuter le prélèvement manuel précédent, et Micrographes à sélectionner comme Identique à supervisé. Cliquez sur Exécuter. Cette méthode générera en sortie un ensemble d’environ 100000 coordonnées. Appliquez une approche consensuelle, alors effectuez une deuxième méthode de prélèvement pour sélectionner les particules dans lesquelles les deux méthodes sont d’accord. Ouvrez sphire – cryolo picking14 et sélectionnez les micrographies prétraitées comme micrographies d’entrée, utilisez un modèle général ? à Oui, avec un seuil de confiance de 0,3 et une taille de boîte de 150 (figure supplémentaire 8). Exécutez-le. Cette méthode devrait également générer environ 100000 coordonnées. Exécutez xmipp3 – sélection par consensus profond22. Comme les coordonnées d’entrée incluent la sortie de sphire – cryolo picking (étape 4.7) et xmipp3 – auto-picking (étape 4.6), définissez Select model type sur Pretrained, et Skip training and score directly with pretrained model? À Oui (figure supplémentaire 9). Exécutez-le. Cliquez sur Analyser les résultats et, dans la nouvelle fenêtre, sur l’icône en forme d’œil à côté de Sélectionner les particules/coordonnées avec des valeurs élevées ‘zScoreDeepLearning1’. Une nouvelle fenêtre s’ouvrira avec une liste de toutes les particules (Figure 4). Les valeurs zScore dans la colonne donnent un aperçu de la qualité d’une particule, des valeurs faibles signifient une mauvaise qualité. Cliquez sur l’étiquette_xmipp_zScoreDeepLearning pour commander les particules du zScore le plus élevé au plus bas. Sélectionnez les particules dont le zScore est supérieur à 0,75 et cliquez sur Coordonnées pour créer le nouveau sous-ensemble. Cela devrait créer un sous-ensemble avec environ 50000 coordonnées. Ouvrez xmipp3 – nettoyeur de micrographies profondes. Sélectionnez comme coordonnées d’entrée le sous-ensemble obtenu à l’étape précédente, Micrographies source identique aux coordonnées et maintenir le seuil à 0,75. Exécutez-le. Vérifiez dans l’onglet Résumé que le nombre de coordonnées a été réduit, bien que dans ce cas, seules quelques coordonnées soient supprimées.REMARQUE: Cette étape est capable de nettoyer en outre l’ensemble des coordonnées et pourrait être très utile pour nettoyer d’autres ensembles de données avec plus d’artefacts de film comme des zones de carbone ou de grandes impuretés. Exécutez xmipp3 – extraire des particules (Figure supplémentaire 10). Indiquez comme coordonnées d’entrée les coordonnées obtenues après l’étape précédente, la source des micrographies comme autre, les micrographies d’entrée comme sortie de l’étape 2, l’estimation CTF comme sortie de l’estimation xmipp3 – ctf, le facteur de sous-échantillonnage à 3 et la taille de la boîte de particules à 100. Dans l’onglet Prétraitement du formulaire, sélectionnez Oui à tous. Exécutez-le. Vérifiez que la sortie doit contenir les particules dans une taille réduite de 100×100 pixels et une taille de pixel de 4.02Å/px. Exécutez à nouveau xmipp3 – extrayez les particules en modifiant les paramètres suivants : Facteur de sous-échantillonnage à 1 et Taille de la boîte de particules à 300. Vérifiez que la sortie est le même ensemble de particules mais maintenant à la pleine résolution. 5. Classification 2D: regroupement de particules similaires Ouvrez la méthode cryosparc2 – classification 2d11 avec les particules d’entrée comme celles obtenues à l’étape 4.11 et, dans l’onglet Classification 2D, le Nombre de classes à 128, conservez tous les autres paramètres avec les valeurs par défaut. Exécutez-le. Cliquez sur Analyser les résultats , puis sur l’icône en forme d’œil à côté de Afficher les classes de particules avec Scipion (Figure 5). Cette classification aidera à nettoyer l’ensemble des particules, car plusieurs classes apparaîtront bruyantes ou avec des artefacts. Sélectionnez les classes contenant de bonnes vues. Cliquez sur Particules (bouton rouge dans la partie inférieure de la fenêtre) pour créer le sous-ensemble nettoyeur. Maintenant, ouvrez xmipp3 – cl2d23 et définissez comme images d’entrée les images obtenues à l’étape précédente et le nombre de classes comme 128. Cliquez sur Exécuter.REMARQUE: Cette deuxième classification est utilisée comme étape de nettoyage supplémentaire de l’ensemble de particules. Habituellement, il est utile d’éliminer autant de particules bruyantes que possible. Toutefois, si un flux de travail plus simple est souhaité, une seule méthode de classification 2D peut être utilisée. Une fois la méthode terminée, vérifiez les 128 classes générées en cliquant sur Analyser les résultats et sur Ce qu’il faut afficher: classes. La plupart des classes générées montrent une projection de la macromolécule avec un certain niveau de détail. Cependant, certains d’entre eux semblent bruyants (dans cet exemple environ 10 classes). Sélectionnez toutes les bonnes classes et cliquez sur le bouton Classes pour générer un nouveau sous-ensemble avec uniquement les bonnes. Ce sous-ensemble sera utilisé comme entrée dans l’une des méthodes de génération d’un volume initial. Avec les mêmes classes sélectionnées, cliquez sur Particules pour créer un sous-ensemble plus propre après avoir supprimé celles appartenant aux mauvaises classes. Ouvrir pwem – sous-ensemble avec l’ensemble complet d’éléments comme sortie de 4.13 (toutes les particules en taille réelle), Définir le sous-ensemble aléatoire sur Non, Autre comme sous-ensemble de particules créé à l’étape précédente et Définir l’opération comme intersection. Cela extraira le sous-ensemble précédent des particules à pleine résolution. 6. Estimation initiale du volume : construire la première estimation du volume 3D Dans cette étape, estimez deux volumes initiaux avec des méthodes différentes, puis utilisez un outil de consensus pour générer le volume 3D estimé final. Ouvrez xmipp3 – reconstruisez la méthode significant24 avec des classes Input comme celles obtenues après l’étape 5, groupe de symétrie comme c1, et conservez les paramètres restants avec leurs valeurs par défaut (figure supplémentaire 11). Exécutez-le. Cliquez sur Analyser les résultats. Vérifiez qu’un volume basse résolution de taille 100x100x100 pixels et une taille de pixel de 4.02Å/px est obtenu. Ouvrir xmipp3 – recadrer/redimensionner les volumes (figure supplémentaire 12) en utilisant comme volumes d’entrée celui obtenu à l’étape précédente, Redimensionner les volumes ? en Oui, Redimensionner l’option vers Taux d’échantillonnage et Redimensionner le taux d’échantillonnage à 1,34 Å/px. Exécutez-le. Vérifiez dans l’onglet Résumé que le volume de sortie a la taille correcte. Maintenant, créez le deuxième volume initial. Open relion – Modèle initial 3D10, comme les particules d’entrée utilisent les bonnes particules à pleine résolution (sortie de 5,5) et définissent le diamètre du masque de particules sur 402Å, conservez les paramètres restants avec les valeurs par défaut. Exécutez-le. Cliquez sur Analyser les résultats , puis sur Afficher le volume avec : tranches. Vérifiez qu’un volume de faible résolution mais avec la forme principale de la structure est obtenu (Figure supplémentaire 13). Maintenant, ouvrez pwem – join sets pour combiner les deux volumes initiaux générés afin de créer l’entrée de la méthode de consensus. Indiquez simplement Volumes comme type d’entrée et sélectionnez les deux volumes initiaux dans Jeu d’entrées. Exécutez-le. La sortie doit être un ensemble contenant deux éléments avec les deux volumes. L’outil de consensus est celui inclus dans xmipp3 – swarm consensus25. Ouvre-le. Utilisez comme images pleine grandeur les bonnes particules en pleine résolution (sortie de 5,5), comme volumes initiaux l’ensemble avec deux éléments générés à l’étape précédente, et assurez-vous que le groupe symétrie est c1. Cliquez sur Exécuter. Cliquez sur Analyser les résultats. Vérifiez qu’un volume de sortie plus détaillé est obtenu (Figure 6). Bien qu’il y ait plus de bruit autour de la structure, avoir plus de détails dans la carte de la structure aidera les étapes de raffinement suivantes pour éviter les minima locaux.REMARQUE: Si UCSF Chimera26 est disponible, utilisez la dernière icône dans la partie supérieure de la fenêtre pour faire une visualisation 3D du volume obtenu. Ouvrir et exécuter relion – 3D auto-refine10 pour faire une première affectation angulaire 3D des particules. Sélectionnez comme particules d’entrée la sortie de 5,5 et définissez le diamètre du masque de particules sur 402Å. Dans l’onglet Carte 3D de référence, sélectionnez comme volume d’entrée celui obtenu à l’étape précédente, Symétrie en c1 et Filtre passe-bas initial à 30Å (Figure supplémentaire 14). Cliquez sur Analyser les résultats. Dans la nouvelle fenêtre, sélectionnez final comme Volume pour visualiser et cliquez sur Afficher le volume avec: tranches pour voir le volume obtenu. Vérifiez également la corrélation de coque de Fourier (FSC) en cliquant sur Afficher les tracés de résolution dans la fenêtre de résultats et sur la couverture angulaire dans Afficher la distribution angulaire : tracé 2D (Figure 7). Le volume reconstruit contient beaucoup plus de détails (probablement avec quelques zones floues dans la partie extérieure de la structure), et le FSC franchit le seuil de 0,143 autour de 4,5Å. La couverture angulaire couvre l’ensemble de la sphère 3D. 7.3D classification : découverte des états conformationnels En utilisant une approche consensuelle, si différents états conformationnels sont dans les données peut être découvert. Relion ouvert – Classification 3D10 (Figure supplémentaire 15). Comme particules d’entrée, utilisez celles qui viennent d’être obtenues en 6.10 et réglez le diamètre du masque de particules sur 402Å. Dans l’onglet Carte 3D de référence, utilisez comme volume d’entrée celui obtenu après l’étape 6.10, définissez Symétrie sur c1 et Filtre passe-bas initial sur 15Å. Enfin, dans l’onglet Optimisation, définissez le Nombre de classes sur 3. Exécutez-le. Vérifiez les résultats en cliquant sur Analyser les résultats, sélectionnez Afficher la classification dans Scipion. Les trois classes générées et quelques mesures intéressantes sont montrées. Les deux premières classes doivent avoir un nombre similaire d’images assignées (colonne de taille ) et se ressembler beaucoup, tandis que la troisième a moins d’images et une apparence plus floue. En outre, les rlnAccuracyRotations et rlnAccuracyTranslations devraient être nettement meilleures pour les deux premières classes. Sélectionnez les deux meilleures classes et cliquez sur le bouton Classes pour générer un sous-ensemble les contenant. Répétez les étapes 7.1 et 7.2 pour générer un deuxième groupe de bonnes classes. Les deux seront l’apport de l’outil de consensus. Ouvrez et exécutez xmipp3 – classes de consensus 3D et sélectionnez comme classes d’entrée les deux sous-ensembles générés dans les étapes précédentes. Cliquez sur Analyser les résultats. Le nombre de particules coïncidentes entre les classes est présenté : la première valeur est le nombre de particules coïncidentes dans la première classe du sous-ensemble 1 et la première classe du sous-ensemble 2, la deuxième valeur est le nombre de particules coïncidentes dans la première classe du sous-ensemble 1 et la deuxième classe du sous-ensemble 2, etc. Vérifiez que les particules sont assignées au hasard aux classes un ou deux, ce qui signifie que la méthode de classification 3D n’est pas en mesure de trouver des changements conformationnels. Compte tenu de ce résultat, l’ensemble des particules sera utilisé pour poursuivre le traitement. 8.3D raffinement : affiner les affectations angulaires d’une population homogène Encore une fois, appliquez une approche consensuelle à cette étape. Tout d’abord, ouvrez et exécutez pwem – sous-ensemble avec l’ensemble complet d’éléments comme sortie de 6.9, Faire un sous-ensemble aléatoire à Oui et Nombre d’éléments à 5000. Avec cela, un sous-ensemble d’images avec un alignement précédent pour entraîner la méthode utilisée dans l’étape suivante est créé. Ouvrez xmipp3 – alignement en profondeur, définissez les images d’entrée comme sortie de bonnes particules obtenues en 5,5 , Volume comme celui obtenu après 6,10, Jeu d’entraînement d’entrée comme celui créé à l’étape précédente, Résolution cible à 10Å et conservez les paramètres restants avec les valeurs par défaut (Figure supplémentaire 16). Cliquez sur Exécuter. Cliquez sur Analyser les résultats pour vérifier la distribution angulaire obtenue, où il n’y a pas de directions manquantes et la couverture angulaire s’améliore légèrement par rapport à celle de 6,10 (Figure 8). Ouvrir et exécuter xmipp3 – comparez les angles et sélectionnez comme particules d’entrée 1 la sortie de 6,9 et particules d’entrée 2 la sortie de 8,2, assurez-vous que le groupe de symétrie est c1. Cette méthode calcule l’accord entre xmipp3 – alignement profond et relion – affinement automatique 3D. Cliquez sur Analyser les résultats, la liste des particules, avec les différences obtenues dans les décalages et les angles, est affichée. Cliquez sur l’icône de la barre dans la partie supérieure de la fenêtre, une autre fenêtre s’ouvrira qui permet de faire des tracés des variables calculées. Sélectionnez _xmipp_angleDiff et cliquez sur Tracer pour voir une représentation des différences angulaires par particule. Faites de même avec _xmipp_shiftDiff. Dans ces chiffres, environ la moitié des particules concordent entre les deux méthodes (figure 9). Sélectionnez les particules dont les différences angulaires sont inférieures à 10º et créez un nouveau sous-ensemble. Maintenant, ouvrez xmipp3 – highres27 pour affiner localement les angles attribués. Tout d’abord, sélectionnez comme Images pleine grandeur les images obtenues à l’étape précédente, et comme volumes initiaux la sortie de 6,9, définissez Rayon de particule sur 150 pixels et Groupe symétrie sur c1. Dans l’onglet Affectation angulaire, définissez l’alignement de l’image sur Local, Nombre d’itérations sur 1 et Max. Résolution cible de 5Å/px (figure supplémentaire 17). Exécutez-le. Dans l’onglet Résumé , vérifiez que le volume de sortie est inférieur à 300x300x300 pixels et avec une taille de pixel légèrement supérieure. Cliquez sur Analyser les résultats pour voir les résultats obtenus. Cliquez sur Afficher les graphiques de résolution pour voir le FSC, et sur Afficher le volume : Reconstruit pour voir le volume obtenu (Figure supplémentaire 18). Un bon volume de résolution proche de 4-3,5Å est obtenu. Cliquez sur Afficher les particules de sortie et, dans la fenêtre avec la liste des particules, cliquez sur l’icône de la barre. Dans la nouvelle fenêtre, sélectionnez Taper comme histogramme, avec 100 bacs, sélectionnez _xmipp_cost’étiquette, puis appuyez sur Tracer (figure supplémentaire 19). De cette façon, l’histogramme de l’étiquette de coût est présenté, qui contient la corrélation de la particule avec la direction de projection sélectionnée pour elle. Dans ce cas, une fonction de densité unimodale est obtenue, ce qui est un signe de ne pas avoir de populations différentes dans l’ensemble des particules. Ainsi, tous seront utilisés pour poursuivre le raffinementREMARQUE: En cas de voir une fonction de densité multimodale, l’ensemble des particules appartenant au maximum supérieur doit être sélectionné pour continuer le flux de travail uniquement avec elles. Ouvrir et exécuter à nouveau xmipp3 – highres avec Continuer à partir d’une exécution précédente? sur Oui, définissez comme Images pleine grandeur celles obtenues après la version 8.5 et Sélectionnez l’exécution précédente avec l’exécution précédente de Xmipp Highres. Dans l’onglet Affectation angulaire , définissez l’alignement de l’image sur Local, avec 1 itération et 2,6Å/px comme résolution cible (pleine résolution). Maintenant, la sortie doit contenir un volume en pleine résolution (taille 300x300x300 pixels). Cliquez sur Analyser les résultats pour vérifier à nouveau le volume obtenu et le FSC, qui devrait maintenant être un volume haute résolution à environ 3Å (Figure 10). 9. Évaluation et post-traitement Ouvrez xmipp3 – MonoRes28 local. Cette méthode calculera la résolution localement. Définissez comme volume d’entrée celui obtenu après 8.10, définissez Souhaitez-vous utiliser des demi-volumes? sur Oui et Plage de résolution de 1 à 10Å. Exécutez-le. Cliquez sur Analyser les résultats et sélectionnez Afficher l’histogramme de résolution et Afficher les tranches colorées (Figure 11). La résolution dans les différentes parties du volume est affichée. La plupart des voxels de la partie centrale de la structure doivent présenter des résolutions autour de 3Å, tandis que les pires résolutions sont atteintes dans les parties extérieures. En outre, un histogramme des résolutions par voxel est montré avec un pic autour de (même en dessous) de 3Å. Ouvrez et exécutez xmipp3 – affûtage localdeblur29 pour appliquer un affûtage. Sélectionnez comme carte d’entrée celle obtenue en 8.10, et comme carte de résolution celle obtenue à l’étape précédente avec MonoRes. Cliquez sur Analyser les résultats pour vérifier les volumes obtenus. Ouvrez le dernier, correspondant à la dernière itération de l’algorithme. Il est recommandé d’ouvrir le volume avec d’autres outils, tels que UCSF Chimera26, pour mieux voir les caractéristiques du volume en 3D (Figure 12). Enfin, ouvrez l’outil de validation inclus dans xmipp3 – validate overfitting30 qui montrera comment la résolution change avec le nombre de particules. Ouvrez-le et incluez comme particules d’entrée les particules obtenues à l’étape 8.5, réglez Calculer le bruit lié à la résolution? sur Oui, avec le volume de référence 3D initial comme sortie de 8.10. Dans Options avancées, définissez le Nombre de particules sur « 500 1000 1500 2000 3000 5000 10000 15000 20000 » (Figure supplémentaire 20). Exécutez-le. Cliquez sur Analyser les résultats. Deux tracés apparaîtront (Figure 13) avec l’évolution de la résolution, dans la ligne verte, au fur et à mesure que le nombre de particules utilisées dans la reconstruction augmentera. La ligne rouge représente la résolution obtenue avec une reconstruction du bruit gaussien aligné. La résolution s’améliore avec le nombre de particules et une grande différence de la reconstruction à partir de particules par rapport à celle du bruit est observée, ce qui est un indicateur d’avoir des particules avec de bonnes informations structurelles. À partir des résultats précédents, un ajustement d’un modèle dans le volume post-traité a pu être effectué, ce qui permettrait de découvrir les structures biologiques de la macromolécule.