نشاط الخلايا العصبية الجانبية الخلفية Afferent خلال السباحة في حمار وحشي
Summary
نحن نصف بروتوكول لرصد التغيرات في نشاط الخلايا العصبية afferent خلال الأوامر الحركية في نموذج نظام خلايا الشعر الفقارية.
Abstract
تجمع الأنظمة الحسية الإشارات الضرورية لتوجيه السلوك ، ولكن يجب على الحيوانات فك شفرة المعلومات ذات الصلة بيولوجيا. يولد Locomotion إشارات إعادة أحشاء أن الحيوانات يجب أن تنفصل عن الإشارات الحسية ذات الصلة للبيئة المحيطة. على سبيل المثال، عندما تسبح سمكة، يتم الكشف عن التدفق المتولد عن تموج الجسم من قبل الأورام العصبية الميكانورية، التي تتألف من خلايا الشعر، التي تشكل نظام الخط الجانبي. خلايا الشعر ثم نقل معلومات حركة السوائل من جهاز الاستشعار إلى الدماغ عن طريق الخلايا العصبية الحسية afferent. في الوقت نفسه ، يتم ترحيل التفريغ الطبيعي للأمر الحركي إلى خلايا الشعر لمنع الحمل الزائد الحسي. ولذلك، فإن حساب التأثير المثبط للإشارات الحركية التنبؤية أثناء الحركة أمر بالغ الأهمية عند تقييم حساسية نظام الخط الجانبي. لقد طورنا نهجا كهربيا في الجسم الحي لمراقبة الخلايا العصبية الجانبية الخلفية ونشاط الجذر الحركي البطني في يرقات حمار وحشي (4-7 أيام بعد الإخصاب) في وقت واحد يمكن أن تستمر لعدة ساعات. يتم تحقيق التسجيلات خارج الخلية من الخلايا العصبية afferent باستخدام تقنية المشبك التصحيح فضفاضة، والتي يمكن الكشف عن النشاط من الخلايا العصبية واحد أو متعددة. يتم إجراء تسجيلات الجذر البطني من خلال الجلد مع أقطاب زجاجية للكشف عن نشاط الخلايا العصبية الحركية. يوفر بروتوكولنا التجريبي إمكانية مراقبة التغيرات الذاتية أو المثارة في المدخلات الحسية عبر السلوكيات الحركية في فقاريات سليمة ومتصرفة.
Introduction
تنقل الخلايا العصبية الأفرنتة في الأنظمة الحساسة الميكانيكية المعلومات من خلايا الشعر إلى الدماغ أثناء السمع والتوازن. يمكن أن يكشف علم الفيزيولوجيا الكهربية عن حساسية الخلايا العصبية من خلال التسجيلات المباشرة. في حين أن ترقيع الخلايا بأكملها من خلايا الشعر يمكن أن يكون تحديا، وتسجيل من الخلايا العصبية afferent المصب أسهل ويسمح تقييم إمكانات العمل استجابة لتحفيز تسيطر عليها1،2،3. تحفيز خلايا الشعر يؤدي إلى انحرافها، الذي يعدل هياكل الميكانيكا، وبالتالي يؤدي إلىزيادةفي إمكانات العمل (المسامير) في الخلايا العصبية afferent 4،5،6. في غياب المحفزات الخارجية ، ترتفع الخلايا العصبية الأفرنت أيضا تلقائيا بسبب تسرب الغلوتامات من خلايا الشعر إلى محطات ما بعد الاشتباك العصبي7،8، وقد ثبت أنها تساهم في الحفاظ علىالحساسية 9،10. التصحيح تسجيل المشبك من النشاط afferent تمكن من مراقبة حساسية خلايا الشعر وديناميات إشارة التي لا يمكن استخدام تقنيات ذات دقة زمنية أقل، كما هو الحال في microphonics11،12 أو التصوير الوظيفي الكالسيوم13،14،15. سيسمح البروتوكول التالي بتسجيل النشاط البؤري المتزامن مع الأوامر الحركية للكشف عن التغيرات الفورية في حساسية خلايا الشعر.
حمار وحشي (دانيو rerio) استخدام خلايا الشعر الواردة في الأورام العصبية التي تشكل نظام الخط الجانبي للكشف عن حركة المياه بالنسبة لجسمهم, الذي يترجم إلى إشارات عصبية ضرورية للملاحة16,17,18, تجنب المفترس, فريسة التقاط19,20, والتعليم21. ويمكن أيضا أن يكون تدفق المياه الذاتي ولدت من قبل حركات السباحة22،23،24، التنفس22،25،26، وتغذية27. وتشمل هذه السلوكيات الحركات المتكررة التي يمكن أن تعب خلايا الشعر وضعف الاستشعار. لذلك، من الضروري أن يميز نظام الخط الجانبي بين محفزات التدفق الخارجية (الخارجية) والمحفزات التدفقية ذاتية المولدة (إعادة الالتقيب). التفريغ الطبيعي يخفف إشارات التدفق الذاتي المولدة أثناء الحركة في حمار وحشي. يتم ترحيل هذه الإشارة الحركية التنبؤية المثبطة عبر الخلايا العصبية التنازلية إلى المستقبلات الحسية لتعديل الإدخال أو مقاطعة معالجة ردود الفعل reafferent28،29. عمل المنوية المساهمة في فهمنا المبكر لهذا النظام feedforward تعتمد على الاستعدادات في المختبر حيث لم يتم الحفاظ على الاتصال والنشاط الداخلي للدائرة العصبية28،30،31،32،33،34،35. يصف هذا البروتوكول نهجا للحفاظ على دائرة عصبية سليمة حيث يتم الحفاظ على ديناميكيات التغذية المرتدة الذاتية مما يتيح فهما أفضل للإفرازات الطبيعية في الجسم الحي.
يصف البروتوكول المبين هنا كيفية مراقبة الخلايا العصبية الجانبية الخلفية ونشاط الخلايا العصبية الحركية في وقت واحد في سمك الحمار الوحشي اليرقات. إن توصيف ديناميكيات الإشارات البؤرية قبل وأثناء وبعد الأوامر الحركية يوفر رؤى حول التغذية المرتدة الذاتية في الوقت الفعلي من الجهاز العصبي المركزي الذي يعدل حساسية خلايا الشعر أثناء الحركة. يحدد هذا البروتوكول المواد التي يجب إعدادها قبل التجارب ثم يصف كيفية شل يرقات حمار وحشي وإعدادها. وسوف يصف البروتوكول كيفية إنشاء تسجيل التصحيح فضفاضة مستقرة من الخلايا العصبية الأفرنت والجذر البطني خارج الخلية (VR) تسجيلات الخلايا العصبية الحركية. وتقدم البيانات التمثيلية التي يمكن الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول من فرد نموذجي، وقد أجريت تحليلات على نسخ متماثلة متعددة للبروتوكول التجريبي. يتم إجراء المعالجة المسبقة للبيانات باستخدام البرامج النصية المكتوبة المخصصة في MATLAB. وعموما، فإن هذا النموذج التجريبي في الجسم الحي يستعد لتوفير فهم أفضل لردود الفعل الحسية أثناء الحركة في نظام خلايا الشعر الفقارية النموذجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر البروتوكول التجريبي الموصوف إمكانية مراقبة التغيرات الذاتية في المدخلات الحسية عبر السلوكيات الحركية في فقاريات سليمة ومتصرفة. على وجه التحديد ، فإنه يفصل نهج في الجسم الحي لأداء التسجيلات خارج الخلية في وقت واحد من الخلايا العصبية الجانبية الخط النافر والجذور الحركية البطنية في ح…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نعرب عن امتناننا للدعم المقدم من المعهد الوطني للصحة (DC010809)، والمؤسسة الوطنية للعلوم (IOS1257150، 1856237)، ومختبر ويتني للعلوم البيولوجية البحرية إلى J.C.L. ونود أن نشكر الأعضاء السابقين والحاليين في مختبر لياو على حفز المناقشات.
Materials
| 100 mL beaker | PYREX | 1000 | resceptacle for etchant |
| 10x water immersion objective | Olympus | UMPLFLN10xW | low magnification for positioning larvae and recording electrode |
| 40x water immersion objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | higher magnification for position electrode tip and establishing patch-clamp |
| abfload.m | supplemental coding file | custom written MATLAB script for converting raw electrophysiology recordings to .mat files | |
| AffVR_preprocess.m | supplemental coding file | custom written MATLAB script for preprocessing recording data | |
| BNC coaxial cables | ThorLabs | 2249-C-12 | connecting amplifier and digitizer channels; require 4 |
| borosilicate glass capillaries w/ filament | Warner Instruments | G150F-3 | inner diameter: 0.86, outer diameter: 1.50; capillary glass used to form recording electrodes |
| burst_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
| computer | N/A | N/A | any computer should work |
| DC Power Supply | Tenma | 72-420 | used for electrically etching dissection pins |
| electrophysiology digitizer | Axon Instruments, Molecular Devices | Axon DigiData 1440A | enables acquisition of patch-clamp data |
| filament | Sutter Instrument Company | FB255B | 2.5 mm box filament used in micropipette puller |
| fine forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 | used to manipulate larvae and insert pins |
| fixed stage DIC microscope | Olympus | BX51WI | microscope used to visualize and establish patch-clamp recordings |
| flexible, tapered pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-169 | flexible tips enable insertion into recording electrode to dispense extracellular solution at the tip |
| FluoroDish | World Precision Instruments Inc. | FD3510-100 | cover glass bottomed dish recording dish |
| KimWipe | KimTech | 34155 | task wipe used for wicking away excess fluid from larvae |
| Kwik-Gard | World Precision Instruments Inc. | 710172 | self-mixing sylgard elastomer |
| MATLAB | MathWorks | R2020b | command line software for preprocessing data |
| microelectrode amplifier | Axon Instruments, Molecular Devices | MultiClamp 700B | patch clamp amplifier for dual channel recordings |
| microforge | Narishige | MF-830 microforge | to polish recording electrode |
| micromanipulator control unit | Siskiyou | MC1000-eR/T | 4-axis dial coordinator for controlling micromanipulator |
| micropipette puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | for pulling capillary glass into recording electrodes |
| microscope control unit | Siskiyou | MC1000e | positions the microscope around the fixed stage and preparation |
| motorized micromanipulator | Siskiyou | MX7600 | positions the headstage and attached recording electrode for patch-clamp recording |
| MultiClamp Commander | Molecular Devices | 2.2.2 | downloadable from Axon MultiClamp 700B Commander download page |
| optical air table | Newport Corporation | VH3036W-OPT | breadboard isolation table to float microscope and minimize vibrations during recordings |
| pCLAMP | Molecular Devices | 10.7.0 | downloadable from Axon pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition & Analysis Software Download page |
| permanent ink marker | Sharpie | order from amazon.com | for marking the leading edge side of the VR electrode to ensure proper orientation when inserting into pipette holder |
| petri-dish | Falcon | 35-3001 | used to immerse larvae in paralytic |
| pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | hold recording electrode and connect to the headstage |
| pneumatic transducer | Fluke Biomedical Instruments | DPM1B | for controlling recording electrode internal pressure |
| potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473-25G | etchant for etching dissection pins |
| silicone tubing | Tygon | 14-169-1A | tubing to connect pneumatic transducer to pipette holder |
| spike_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
| stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | used to visualize pin tips and during preparation of larvae |
| straight edge razor blade | Canopus | order from amazon.com | cuts the tungsten wire while making dissection pins |
| swimbout_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
| syringe | Becton Dickinson Compoany | 309602 | filled with extracellular solution to inject into recording electrodes |
| transfer pipette | Sigma-Aldrich | Z135003-500EA | single use, non-sterile pipette for transfering larvae |
| tricaine methanesulfonate | Syndel | 12854 | pharmaceutical aneasthetic used to euthanize larvae with high dosage. |
| tungsten wire | World Precision Instruments Inc. | 715500 | 0.002 inch, 50.8 μm diameter; used to make dissection pins |
| vacuum filtration unit | Sigma-Aldrich | SCGVU11RE | single use, sterile, vacuum filtration units used to sterilize extracellular solution used for electrophysiology electrode ringer |
| voltage-clamp current-clamp headstage | Molecular Devices | CV-7B | supplied with MultiClamp 700B amplifier used as left and right headstages |
| α-bungarotoxin | ThermoFisher | B1601 | for immobilizing the larvae prior to recording |
References
- Trapani, J. G., Nicolson, T. Mechanism of spontaneous activity in afferent neurons of the zebrafish lateral-line organ. The Journal of Neuroscience. 31 (5), 1614-1623 (2011).
- Haehnel-Taguchi, M., Akanyeti, O., Liao, J. C. Afferent and motorneuron activity in response to single neuromast stimulation in the posterior lateral line of larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 112 (6), 1329-1339 (2014).
- Levi, R., Akanyeti, O., Ballo, A., Liao, J. C. Frequency response properties of primary afferent neurons in the posterior lateral line system of larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 113 (2), 657-668 (2015).
- Harris, G. G., Fishkopf, L. S., Flock, A. Receptor potentials from hair cells of the lateral line. Science. 167 (3914), 76-79 (1970).
- Dow, E., Jacobo, A., Hossain, S., Siletti, K., Hudspeth, A. J. Connectomics of the zebrafish’s lateral line neuromast reveals wiring and miswiring in a simple microcircuit. eLife. 7, 33988 (2018).
- Obholzer, N., et al. Vesicular glutamate transporter 3 is required for synaptic transmission in zebrafish hair cells. The Journal of Neuroscience. 28 (9), 2110-2118 (2008).
- Keen, E. C., Hudspeth, A. J. Transfer characteristics of the hair cell’s afferent synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (14), 5537-5542 (2006).
- Li, G., Keen, E., Andor-Ardó, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell’s ribbon synapse. The Journal of Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).
- Manley, G. A., Robertson, D. Analysis of spontaneous activity of auditory neurons in the spiral ganglion of the guinea-pig cochlea. The Journal of Physiology. 258 (2), 323-336 (1976).
- Kiang, N. Y. S., Watanabe, T., Thomas, E., Clark, L. . Discharge patterns of single fibers in the cat’s auditory nerve. , (1965).
- Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Ionic basis of the receptor potential in a vertebrate hair cell. Nature. 281 (5733), 675-677 (1979).
- Trapani, J. G., Nicolson, T. Physiological recordings from zebrafish lateral-line hair cells and afferent neurons. Methods in Cell Biology. 100, 219-231 (2010).
- Reinig, S., Driever, W., Arrenberg, A. B. The descending diencephalic dopamine system is tuned to sensory stimuli. Current Biology. 27 (3), 318-333 (2017).
- Zhang, Q., et al. Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage. Nature Communications. 9 (1), 1388 (2018).
- Pichler, P., Lagnado, L. Motor behavior selectively inhibits hair cells activated forward motion in the lateral line of zebrafish. Current Biology. 30 (1), 150-157 (2020).
- Olszewski, J., Haehnel, M., Taguchi, M., Liao, J. C. Zebrafish larvae exhibit rheotaxis and can escape a continuous suction source using their lateral line. PloS One. 7 (5), 36661 (2012).
- Suli, A., Watson, G. M., Rubel, E. W., Raible, D. W. Rheotaxis in larval zebrafish is mediated by lateral line mechanosensory hair cells. PLoS One. 7 (2), 29727 (2012).
- Oteiza, P., Odstcil, I., Lauder, G., Portugues, R., Engert, F. A novel mechanism for mechanosensory-based rheotaxis in larval zebrafish. Nature. 547 (7664), 445-448 (2017).
- McHenry, M. J., Feitl, K. E., Strother, J. A. Larval zebrafish rapidly sense the water flow of a predator’s strike. Biology Letters. 5 (4), 477-479 (2009).
- Stewart, W. J., Cardenas, G. S., McHenry, M. J. Zebrafish larvae evade predators by sensing water flow. The Journal of Experimental Biology. 216, 388-398 (2013).
- Mekdara, P. J., Schwalbe, M. A. B., Coughlin, L. L., Tytell, E. D. The effects of lateral line ablation and regeneration in schooling giant danios. The Journal of Experimental Biology. 221, 175166 (2018).
- Palmer, L. M., Giuffrida, B. A., Mensinger, A. F. Neural recordings from the lateral line in free-swimming toadfish, Opsanus tau. The Biological Bulletin. 205 (2), 216-218 (2003).
- Ayali, A., Gelman, S., Tytell, E. D., Cohen, A. H. Lateral line activity during undulatory body motions suggests a feedback link in closed-loop control of sea lamprey swimming. Canadian Journal of Zoology. 87 (8), 671-683 (2009).
- Mensinger, A. F., Van Wert, J. C., Rogers, L. S. Lateral line sensitivity in free-swimming toad fish Opsanus tau. The Journal of Experimental Biology. 222, 190587 (2019).
- Montgomery, J., Bodznick, D., Halstead, M. Hindbrain signal processing in the lateral line system of the dwarf scorpionfish Scopeana papillosus. The Journal of Experimental Biology. 199, 893-899 (1996).
- Montgomery, J. C., Bodznick, D. An adaptive filter that cancels self-induced noise in the electrosensory and lateral line mechanosensory systems of fish. Neuroscience Letters. 174 (2), 145-148 (1994).
- Palmer, L. M., Deffenbaugh, M., Mensinger, A. F. Sensitivity of the anterior lateral line to natural stimuli in the oyster toadfish, Opsanus tau (Linnaeus). The Journal of Experimental Biology. 208, 3441-3450 (2005).
- Russell, I. J., Roberts, B. L. Inhibition of spontaneous lateral-line activity of efferent nerve stimulation. The Journal of Experimental Biology. 57, 77-82 (1972).
- Lunsford, E. T., Skandalis, D. A., Liao, J. C. Efferent modulation of spontaneous lateral line activity during and after zebrafish motor commands. Journal of Neurophysiology. 122 (6), 2438-2448 (2019).
- Russell, I. J. The pharmacology of efferent synapses in the lateral-line system of Xenopus laevis. The Journal of Experimental Biology. 54 (3), 643-659 (1971).
- Roberts, B. L., Russell, I. J. The activity of lateral-line efferent neurons in stationary and swimming dogfish. The Journal of Experimental Biology. 57 (2), 435-448 (1972).
- Flock, A., Russell, I. J. The post-synaptic action of efferent fibres in the lateral line organ of the burbot Lota lota. The Journal of Physiology. 235 (3), 591-605 (1973).
- Montgomery, J. C. Noise cancellation in the electrosensory system of the thornback ray; common mode rejection of input produced by the animal’s own ventilatory movement. Journal of Comparative Physiology. 155, 103-111 (1984).
- Tricas, T. C., Highstein, S. M. Action of the octavolateralis efferent system upon the lateral line of free-swimming toadfish, Opsanus tau. Journal of Comparative Physiology. 169 (1), 25-37 (1991).
- Weeg, M. S., Land, B. R., Bass, A. H. Vocal pathways modulate efferent neurons to the inner ear and lateral line. The Journal of Neuroscience. 25 (25), 5967-5974 (2005).
- Elgoyhen, A. B., Johnson, D. S., Boulter, J., Vetter, D. E., Heinemann, S. α9: an acetylcholine receptor with novel pharmacological properties expressed in rat cochlear hair cells. Cell. 79 (4), 705-715 (1994).
- Masino, M. A., Fetcho, J. R. Fictive swimming motor patterns in wild type and mutant larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 93 (6), 3177-3188 (2005).
- Hentschke, H. abfload. 1.4.0.0. MATLAB Central File Exchange. , (2020).
- Harris, G. G., Milne, D. C. Input-output characteristics of the lateral-line sense organs of Xenopus laevis. The Journal of the Acoustical Society of America. 40 (1), 32-42 (1966).
- Liao, J. C., Haehnel, M. Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy. Journal of Neurophysiology. 107 (10), 2615-2623 (2012).
- Song, S., et al. Mathematical modeling and analyses of interspike-intervals of spontaneous activity in afferent neurons of the zebrafish lateral line. Nature Science Reports. 8, 14851 (2018).
- Liao, J. C., Fetcho, J. R. Shared versus specialized glycinergic spinal interneurons in axial motor circuits of larval zebrafish. The Journal of Neuroscience. 28 (48), 12982-12992 (2008).
- von Holst, E., Mittelstaedt, H. The principle of reafference: interactions between the central nervous system and the peripheral organs. Die Naturwissenschften. 37, 463 (1950).
- Crapse, T. B., Sommer, M. A. Corollary discharge across the animal kingdom. Nature Reviews. Neuroscience. 9 (8), 587-600 (2008).
- Brichta, A. M., Goldberg, J. M. Responses to efferent activation and excitatory response-intensity relations of turtle posterior-crista afferents. Journal of Neurophysiology. 83 (3), 1224-1242 (2000).
