שיטה לשימור שורשי ביצות וריזוספרות להדמיה יסודית
Summary
אנו מתארים פרוטוקול לדוגמה, שימור וקטע שורשים שלמים ואת אדמת הריזוספירה שמסביב מסביבות ביצות באמצעות אורז(Oryza sativa L.) כמין לדוגמה. לאחר שהשתמרה, ניתן לנתח את הדגימה באמצעות טכניקות הדמיה אלמנטריות, כגון הדמיית פלואורסצנטיות כימית של קרני רנטגן סינכרוטרון (XRF).
Abstract
שורשים אינטראקציה נרחבת עם סביבת הקרקע שלהם אבל לדמיין אינטראקציות כאלה בין השורשים ואת הריזוספירה שמסביב הוא מאתגר. הכימיה של הריזוספירה של צמחי ביצות מאתגרת במיוחד ללכידה בגלל שיפועי חמצן תלולים מהשורשים לאדמה בתפזורת. כאן מתואר פרוטוקול המשמר ביעילות את מבנה השורש ואת הכימיה של קנה שורש של צמחי ביצות באמצעות הקפאת טריקה וייבוש קפוא. מקפיא סלאם, שבו המדגם קפוא בין גושי נחושת מקורר מראש עם חנקן נוזלי, ממזער נזק שורש ועיוות מדגם שיכול להתרחש עם הקפאת הבזק תוך מזעור שינויי דגימה כימיים. בעוד עיוות מדגם עדיין אפשרי, היכולת להשיג דגימות מרובות במהירות ועם עלות מינימלית מגדילה את הפוטנציאל להשיג דגימות משביעות רצון וממטבת את זמן ההדמיה. הנתונים מראים כי שיטה זו מצליחה לשמר מינים מופחתים של ארסן בשורשי אורז וריזוספרות הקשורות ללוחות ברזל. שיטה זו יכולה להיות מאומצת למחקרים של קשרי קרקע-צמחים במגוון רחב של סביבות ביצות המשתרעות על פני ריכוזים הנעים בין רכיבה על אופניים יסוד עקבות ליישומי phytoremediation.
Introduction
שורשים וריזוספרות שלהם הם דינמיים, הטרוגניים, וחשובים מאוד להבנת האופן שבו צמחים משיגים חומרים מזינים ומזהמיםמינרליים 1,2,3. שורשים הם המסלול העיקרי שבאמצעותו חומרים מזינים (למשל, זרחן) ומזהמים (למשל, ארסן) עוברים מאדמה לצמחים ובכך להבין שלתהליך זה יש השלכות על כמות ואיכות המזון, תפקוד המערכת האקולוגית והפיטורה. עם זאת, השורשים דינמיים במרחב ובזמן הגדלים בתגובה לצרכי רכישת חומרים מזינים ולעתים קרובות הם משתנים בתפקוד, בקוטר ובמבנה (למשל, שורשים לרוחב, שורשים הרפתקניים, שערות שורש)2. הטרוגניות של מערכות שורשים ניתן ללמוד על סולמות מרחביים מן הסלולר לרמת המערכת האקולוגית ועל סולמות זמניים משעה כדי decadal. לפיכך, האופי הדינמי וההטרוגני של השורשים והאדמה הסובבת שלהם, או קנה שורש, מציב אתגרים ללכידת הכימיה של הריזוספירה לאורך זמן. למרות אתגר זה, חובה ללמוד שורשים בסביבת הקרקע שלהם כדי לאפיין את מערכת היחסים הקריטית בין צמח לקרקע.
הכימיה של הריזוספירה של צמחי הביצות מאתגרת במיוחד לחקור בגלל שיפועי חמצן תלולים הקיימים מאדמה בתפזורת לשורשים, שמשתנים במרחב ובזמן. בגלל שורשים זקוקים לחמצן כדי להנשים, צמחי ביצות הסתגלו לתנאי החמצן הנמוכים של קרקעות ביצות על ידי יצירת aerenchyma4,5. Aerenchyma הם רקמות קליפת המוח חלולות המשתרעות מירי לשורשים, ומאפשרות פיזור אוויר דרך הצמח לשורשים. עם זאת, חלק מהאוויר הזה דולף לתוך הריזוספירה בחלקים פחות תת-קרקעיים של השורשים במיוחד ליד צמתים שורש לרוחב, טיפים שורש פחות בוגרים ואזורי התארכות6,7,8,9. אובדן חמצן רדיאלי זה יוצר אזור מחומצן בריזוספירה של צמחי ביצות המשפיעה על הכימיה של הריזוספירה (ביו-גיאו) ונבדלת מהאדמה בתפזורת מופחתת10,11,12. כדי להבין את גורלם והובלתם של חומרים מזינים ומזהמים בריזוספירות ובשורשים של ביצות, חיוני לשמר את האדמה בתפזורת המופחתת מבחינה כימית, את הריזוספירה המחומצנת ואת שורשי צמחי הביצות לניתוח. עם זאת, מכיוון שהאדמה בתפזורת מכילה מרכיבי קרקע מופחתים הרגישים לחמצן, שיטות שימור שורשים ואדמה חייבות לשמר מבני שורש ולמזער תגובות רגישות לחמצן.
קיימות שיטות לתיקון רקמות הצמח ולשמירה על מבנה אולטרה להדמיה, אך לא ניתן ליישם שיטות אלה כדי לשמר כימית שורשים הגדלים בקרקע ביצות. עבור חקירות שבהן רק ההתפלגות היסודית בתוך תאי הצמח רצויה, צמחים בדרך כלל גדלים הידרופוניקה ושורשים ניתן להסיר בקלות מן הפתרון, קבוע תחת החלפה הקפאה הקפאה בלחץ גבוה וחתך עבור מגוון רחב של יישומי הדמיה כולל ספקטרומטר מסה יון משני ברזולוציה גבוהה (nanoSIMS), מיקרוסקופיה אלקטרונים, וניתוח פלואורסצנטיות רנטגן סינכרוטרון (S-XRF)13, 14,15. כדי לחקור את Fe plaque בצד החיצוני של שורשי הביצות, מחקרים הידרופוניים אלה חייבים באופן מלאכותי לגרום היווצרות פלאק Fe בפתרון16, אשר אינו מייצג במדויק את ההטרוגניות של ההפצה והרכב מינרלי של היווצרות פלאק Fe ואלמנטים הקשורים במקום17,18,19,20. קיימות שיטות לשימור אדמת ביצות ומיקרואורגניזמים הקשורים עם מקפיא coring21, אבל קשה להשיג שורשים עם טכניקה זו. השיטות הנוכחיות לדמיין שורשים הגדלים בקרקע והכימיה הריזוספירית שלהם מורכבות משני סוגי מדידה עיקריים: שטפים אלמנטליים וריכוז אלמנטרי כולל (וספציה). הראשון נמדד בדרך כלל באמצעות שיפועים מפוזרים בסרטים דקים (DGT)22,23,24, שבו הקרקע ממוקמת לתוך rhizoboxes כדי לתמוך צמיחת הצמח בסביבת מעבדה ואלמנטים מעבדה בקרקע מפוזרים באמצעות ג’ל לשכבת כריכה. לאחר מכן ניתן לדמיין שכבת איגוד זו כדי לכמת את רכיבי העניין של המעבדה. טכניקה זו יכולה להמחיש בהצלחה את היחסים בין השורשים לבין הריזוספירה24,25,26,27, אבל חפצים מ תוחם שורש עשוי להתקיים על ידי גידול צמחים ב rhizoboxes, ומידע על פנים השורש אינו נתפס עם DGT. זה האחרון כרוך דגימה של השורשים ו rhizosphere, שמירה על המדגם, וניתוח ישיר של התפלגות אלמנטים על סעיף מדגם. עבור דגימה סביבתית זו של שורשי צמח הביצות ואת קנה ריזוספירה הסובבת, טיפול מדגם זהיר נדרש כדי למנוע חפצים מהכנת מדגם.
כאן מתואר פרוטוקול המשמר ביעילות מבני שורש וכימיה של פריזוספירה של צמחי ביצות על ידי הקפאת טריקה וייבוש קפוא. הקפאת הבזק יכולה להאט באופן דרסטי את התמורות של מפולות רגישות לחמצן, אך עלולה לפגוע בשורשים ועלול לגרום לגיוס כאשר הדגימות מתייבשות. עם זאת, מקפיא טריקה שבו המדגם קפוא בין בלוקים נחושת מקורר מראש עם חנקן נוזלי ממזער נזק שורש עיוות מדגם28. הדגימות המשומרות מוטמעות לאחר מכן בשרף אפוקסי המשמר כדגימה20,29 וניתן לחתוך ולצחצח להדמיה של שורשים בתוך אדמת הריזוספירה שלהם. הדגימות בדו”ח זה נותחו על ידי הדמיית דגימה כימית S-XRF לאחר חתך דק. עם זאת, ניתן להשתמש בטכניקות הדמיה אחרות, כולל ספקטרומטריית מסת פלזמה מצמידה לייזר (LA-ICP-MS), פליטת רנטגן הנגרמת על ידי חלקיקים (PIXE), ספקטרומטריית מסת יון משנית (SIMS) והדמיה של ספקטרוסקופיית פירוק המושרה בלייזר (LIBS).
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מתאר פרוטוקול להשגת אדמה בתפזורת משומרת + ריזוספירות של שורשי צמח ביצות באמצעות טכניקת הקפאת טריקה שניתן להשתמש בה להדמיה יסודית ו /או מיפוי דגימה כימית.
ישנם מספר יתרונות של שיטה זו על פני שיטות קיימות. ראשית, שיטה זו מאפשרת חקירה סימולטנית של שורשים ואת הריזוספרות ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מכירים במענק זרעים משותף לסיפרט וטאפרו כדי לתמוך בשיתוף פעולה בין אוניברסיטת דלאוור למעבדה הלאומית ברוקהייבן. חלקים ממחקר זה השתמשו בקו הקרן XFM (4-BM) של מקור האור הלאומי סינכרוטרון II, משרד האנרגיה האמריקאי (DOE) של מתקן משתמשים מדעיים המופעל עבור משרד DOE למדע על ידי המעבדה הלאומית ברוקהייבן תחת חוזה מס ‘. דה-SC0012704.
Materials
| Copper blocks | McMaster Carr | 89275K42 | |
| Diamond blade | Buehler | 15 LC, 102 mm x 0.3 mm | operation speed: 225 rpm |
| Epoxy forms | Struers | 40300085 | FixiForm |
| Epoxy | Epotek | 301-2FL | |
| Superglue | Loctite | 404 | |
| Thin sectioning machine | Buehler | PetroThin | |
| Wet saw | Buehler | IsoMet 1000 |
References
- Ahkami, A. H., White, R. A., Handakumbura, P. P., Jansson, C. Rhizosphere engineering: Enhancing sustainable plant ecosystem productivity. Rhizosphere. 3 (2), 233-243 (2017).
- McNear, D. H. The rhizosphere – roots, soil and everything in between. Nature Education Knowledge. 4 (3), 1 (2013).
- Berendsen, R. L., Pieterse, C. M. J., Bakker, P. A. H. M. The rhizosphere microbiome and plant health. Trends in Plant Science. 17 (8), 478-486 (2012).
- Armstrong, W., Justin, S., Beckett, P. M., Lythe, S. Root adaptation to soil waterlogging. Aquatic Botany. 39 (1-2), 57-73 (1991).
- Armstrong, W. Oxidising activity of roots in waterlogged soils. Physiologia Plantarum. 20 (4), 920-926 (1967).
- Armstrong, W. Oxygen diffusion from roots of some Brittish bog plants. Nature. 204 (496), 801-802 (1964).
- Li, H., Ye, Z. H., Wei, Z. J., Wong, M. H. Root porosity and radial oxygen loss related to arsenic tolerance and uptake in wetland plants. Environmental Pollution. 159 (1), 30-37 (2011).
- Kotula, L., Ranathunge, K., Steudle, E. Apoplastic barriers effectively block oxygen permeability across outer cell layers of rice roots under deoxygenated conditions: roles of apoplastic pores and of respiration. New Phytologist. 184 (4), 909-917 (2009).
- Mei, X. Q., Ye, Z. H., Wong, M. H. The relationship of root porosity and radial oxygen loss on arsenic tolerance and uptake in rice grains and straw. Environmental Pollution. 157 (8-9), 2550-2557 (2009).
- Khan, N., et al. Root Iron Plaque on Wetland Plants as a Dynamic Pool of Nutrients and Contaminants. Advances in Agronomy. 138, 1-96 (2016).
- Yamaguchi, N., Ohkura, T., Takahashi, Y., Maejima, Y., Arao, T. Arsenic Distribution and Speciation near Rice Roots Influenced by Iron Plaques and Redox Conditions of the Soil Matrix. Environmental Science and Technology. 48 (3), 1549-1556 (2014).
- Frommer, J., Voegelin, A., Dittmar, J., Marcus, M. A., Kretzschmar, R. Biogeochemical processes and arsenic enrichment around rice roots in paddy soil: results from micro-focused X-ray spectroscopy. European Journal of Soil Science. 62 (2), 305-317 (2011).
- Moore, K. L., et al. Combined NanoSIMS and synchrotron X-ray fluorescence reveal distinct cellular and subcellular distribution patterns of trace elements in rice tissues. New Phytologist. 201 (1), 104-115 (2014).
- vander Ent, A., et al. X-ray elemental mapping techniques for elucidating the ecophysiology of hyperaccumulator plants. New Phytologist. 218 (2), 432-452 (2018).
- Sarret, G., Smits, E. A. H. P., Michel, H. C., Isaure, M. P., Zhao, F. J., Tappero, R. Use of Synchrotron-Based Techniques to Elucidate Metal Uptake and Metabolism in Plants. Advances in Agronomy. 119, 1-82 (2013).
- Moore, K. L., et al. High-Resolution Secondary Ion Mass Spectrometry Reveals the Contrasting Subcellular Distribution of Arsenic and Silicon in Rice Roots. Plant Physiology. 156 (2), 913-924 (2011).
- Seyfferth, A. L. Abiotic effects of dissolved oxyanions on iron plaque quantity and mineral composition in a simulated rhizosphere. Plant and Soil. 397 (1-2), (2015).
- Seyfferth, A. L., Webb, S. M., Andrews, J. C., Fendorf, S. Arsenic localization, speciation, and co-occurrence with iron on rice (Oryza sativa L) roots having variable Fe coatings. Environmental Science and Technology. 44 (21), (2010).
- Amaral, D. C., Lopes, G., Guilherme, L. R. G., Seyfferth, A. L. A new approach to sampling Iintact Fe plaque reveals Si-induced changes in Fe mineral composition and shoot As in rice. Environmental Science and Technology. 51 (1), 38-45 (2017).
- Seyfferth, A. L., Webb, S. M., Andrews, J. C., Fendorf, S. Defining the distribution of arsenic species and plant nutrients in rice (Oryza sativa L.) from the root to the grain. Geochimica et Cosmochimica Acta. 75 (21), (2011).
- Franchini, A. G., Zeyer, J. Freeze-Coring Method for Characterization of Microbial Community Structure and Function in Wetland Soils at High Spatial Resolution. Applied and Environmental Microbiology. 78 (12), 4501-4504 (2012).
- Smolders, E., Wagner, S., Prohaska, T., Irrgeher, J., Santner, J. Sub-millimeter distribution of labile trace element fluxes in the rhizosphere explains differential effects of soil liming on cadmium and zinc uptake in maize. Science of the Total Environment. 738, 140311 (2020).
- Santner, J., et al. High-resolution chemical imaging of labile phosphorus in the rhizosphere of Brassica napus L. cultivars. Environmental and Experimental Botany. 77, 219-226 (2012).
- Williams, P. N., et al. Localized Flux Maxima of Arsenic, Lead, and Iron around Root Apices in Flooded Lowland Rice. Environmental Science and Technology. 48 (15), 8498-8506 (2014).
- Yin, D. X., et al. Localized Intensification of Arsenic Release within the Emergent Rice Rhizosphere. Environmental Science and Technology. 54 (6), 3138-3147 (2020).
- Santner, J., et al. High-resolution chemical imaging of labile phosphorus in the rhizosphere of Brassica napus L. cultivars. Environmental and Experimental Botany. 77, 219-226 (2012).
- Smolders, E., Wagner, S., Prohaska, T., Irrgeher, J., Santner, J. Sub-millimeter distribution of labile trace element fluxes in the rhizosphere explains differential effects of soil liming on cadmium and zinc uptake in maize. Science of the Total Environment. 738, 140311 (2020).
- Seyfferth, A. L., Ross, J., Webb, S. M. Evidence for the root-uptake of arsenite at lateral root junctions and root apices in rice (Oryza sativa L.). Soil Processes. 1, 3 (2017).
- Masue-Slowey, Y., Kocar, B. D., Jofre, S. A. B., Mayer, K. U., Fendorf, S. Transport Implications Resulting from Internal Redistribution of Arsenic and Iron within Constructed Soil Aggregates. Environmental Science and Technology. 45 (2), 582-588 (2011).
- Root, R. A., Fathordoobadi, S., Alday, F., Ela, W., Chorover, J. Microscale Speciation of Arsenic and Iron in Ferric-Based Sorbents Subjected to Simulated Landfill Conditions. Environmental Science and Technology. 47 (22), 12992-13000 (2013).
- Blute, N. K., Brabander, D. J., Hemond, H. F., Sutton, S. R., Newville, M. G., Rivers, M. L. Arsenic sequestration by ferric iron plaque on cattail roots. Environmental Science and Technology. 38 (22), 6074-6077 (2004).
- Hansel, C. M., La Force, M. J., Fendorf, S., Sutton, S. Spatial and temporal association of As and Fe species on aquatic plant roots. Environmental Science and Technology. 36 (9), 1988-1994 (2002).
- Yin, D. X., et al. Localized Intensification of Arsenic Release within the Emergent Rice Rhizosphere. Environmental Science and Technology. 54 (6), 3138-3147 (2020).
- Maisch, M., Lueder, U., Kappler, A., Schmidt, C. Iron Lung: How Rice Roots Induce Iron Redox Changes in the Rhizosphere and Create Niches for Microaerophilic Fe(II)-Oxidizing Bacteria. Environmental Science and Technology Letters. 6 (10), 600-605 (2019).
- Voegelin, A., Weber, F. -. A. A., Kretzschmar, R. Distribution and speciation of arsenic around roots in a contaminated riparian floodplain soil: Micro-XRF element mapping and EXAFS spectroscopy. Geochimica Et Cosmochimica Acta. 71 (23), 5804-5820 (2007).
- Smith, E., Kempson, I., Juhasz, A. L., Weber, J., Skinner, W. M., Grafe, M. Localization and speciation of arsenic and trace elements in rice tissues. Chemosphere. 76 (4), 529-535 (2009).
- Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
- Echlin, P., Lai, C., Hayes, T., Saubermann, A. Cryofixation of Lemna-minor roots for morphological and analytical studies. Cryoletters. 1 (9), 289-300 (1980).
- Ma, R., Shen, J. L., Wu, J. S., Tang, Z., Shen, Q. R., Zhao, F. J. Impact of agronomic practices on arsenic accumulation and speciation in rice grain. Environmental Pollution. 194, 217-223 (2014).
- Chen, Z., Zhu, Y. G., Liu, W. J., Meharg, A. A. Direct evidence showing the effect of root surface iron plaque on arsenite and arsenate uptake into rice (Oryza sativa) roots. New Phytologist. 165 (1), 91-97 (2005).
- Lee, C. H., Hsieh, Y. C., Lin, T. H., Lee, D. Y. Iron plaque formation and its effect on arsenic uptake by different genotypes of paddy rice. Plant and Soil. 363 (1-2), 231-241 (2013).
- Seyfferth, A. L., Amaral, D. C., Limmer, M. A., Guilherme, L. R. G. Combined impacts of Si-rich rice residues and flooding extent on grain As and Cd in rice. Environment International. 128, 301-309 (2019).
- Seyfferth, A., Limmer, M., Wu, W. Si and Water Management Drives Changes in Fe and Mn Pools that Affect As Cycling and Uptake in Rice. Soil Systems. 3 (3), (2019).
- Limmer, M. A., Mann, J., Amaral, D. C., Vargas, R., Seyfferth, A. L. Silicon-rich amendments in rice paddies: Effects on arsenic uptake and biogeochemistry. Science of the Total Environment. 624, 1360-1368 (2018).
