Luchtinflatie van muizenlongen met vasculaire perfusie-fixatie
Summary
Gepresenteerd is een methode voor luchtinflatie met vasculaire perfusie-fixatie van de longen die de locatie van cellen in luchtwegen, longblaasjes en interstitium behoudt voor structuur-functieanalyses. Constante luchtwegdruk wordt gehandhaafd met een luchtinflatiekamer, terwijl fixatief wordt toegediend via de rechter ventrikel. Longen worden verwerkt voor histologische studies.
Abstract
Longhestologie wordt vaak gebruikt om de bijdragen van luchtruimcellen tijdens longhomeostase en pathogenese van ziekten te onderzoeken. Veelgebruikte fixatiemethoden op basis van instillatie kunnen echter luchtruimcellen en slijm in terminale luchtwegen verplaatsen en de weefselmorfologie veranderen. Ter vergelijking: vasculaire perfusie-fixatietechnieken zijn superieur in het behoud van de locatie en morfologie van cellen in luchtruimen en de mucosale bekleding. Als positieve luchtwegdruk echter niet tegelijkertijd wordt toegepast, kunnen delen van de longen instorten en kunnen haarvaten uitpuilen in de alveolaire ruimtes, wat leidt tot vervorming van de longanatomie. Hierin beschrijven we een goedkope methode voor luchtinflatie tijdens vasculaire perfusie-fixatie om de morfologie en locatie van luchtweg- en alveolaire cellen en interstitium in muizenlongen te behouden voor downstream histologische studies. Constante luchtdruk wordt via de luchtpijp aan de longen afgegeven vanuit een afgesloten, met lucht gevulde kamer die de druk handhaaft via een instelbare vloeistofkolom terwijl het fixatief door de rechter ventrikel wordt geperfundeerd.
Introduction
Longhestologie vertegenwoordigt de gouden standaard voor het beoordelen van longarchitectuur tijdens gezondheid en ziekte en is een van de meest gebruikte hulpmiddelen door longonderzoekers1. Een van de meest kritische aspecten van deze techniek is de juiste isolatie en behoud van longweefsel, omdat variabiliteit in deze stap kan leiden tot slechte weefselkwaliteit en onjuiste resultaten1,2,3. Bij levende dieren wordt het longvolume bepaald door de balans tussen de naar binnen gerichte elastische terugslag van de long en de naar buiten gerichte krachten die door de borstwand en het middenrif worden overgedragen door oppervlaktespanning. Dienovereenkomstig, wanneer de thorax wordt binnengegaan, gaan de uiterlijke krachten verloren en klapt de long in. Histologische secties bereid uit ingeklapte longen hebben een druk uiterlijk en grenzen tussen anatomische compartimenten (d.w.z. luchtruimen, vasculatuur en interstitium) kunnen moeilijk te onderscheiden zijn. Om deze uitdaging te omzeilen, blazen onderzoekers vaak de longen op tijdens chemische fixatie, zodat de grootte en architectuur van het luchtruim behouden blijven.
Longen kunnen worden opgeblazen met lucht of vloeistof. De druk die nodig is om de longen tot hetzelfde volume op te blazen, verschilt tussen lucht- en vloeistofinflatie als gevolg van intermoleculaire krachten op het lucht-vloeistofinterface. Hogere druk (bijv. 25 cmH2O) is vereist tijdens luchtinflatie dan vloeistofinflatie (bijv. 12 cmH2O) om oppervlaktespanning te overwinnen en de ingeklapte longblaasjes te openen4. Zodra longblaasjes zijn gerekruteerd, kan een lagere druk de longblaasjes openhouden tot hetzelfde volume als de druk-volumecurveplateaus, en de druk egaliseert in de hele long volgens de wet van Pascal4,5,6,7,8.
Er bestaan twee belangrijke methoden voor longinflatie en fixatie om muizenlongen te behouden voor histologie. Meestal zijn de luchtruimen doordrongen van vloeistof – vaak met een fixatief. Het grote voordeel van deze aanpak is dat het relatief eenvoudig is en weinig training vereist. Hoewel intratracheale instillatie van fixatief de voorkeur kan hebben in studies die zich richten op de vasculatuur, heeft vloeistof die via de luchtpijp wordt ingebracht de neiging om proximale luchtwegcellen en mucines in meer distale luchtruimgebieden te duwen, terwijl luchtinflatie niet1,3,4,9,10,11. Bovendien verandert onbedoelde onthechting van leukocyten van het epitheel tijdens vloeibare inflatie hun morfologie, waardoor ze artefactueel een eenvoudig, afgerond uiterlijk krijgen4,10,11,12. Ten slotte kan inflatie van de longen met vloeistof onbedoeld het interstitium4,10,11comprimeren. Samen kunnen deze factoren de normale anatomie en cellulaire verdelingen in de bewaarde longen verstoren, waardoor de techniek wordt beperkt.
Een alternatieve methode voor weefselbehoud is vasculaire perfusie-fixatie. Bij deze methode wordt fixatief via de vena cava of de rechter ventrikel in de pulmonale vasculatuur geperfundeerd. Deze methode behoudt de locatie en morfologie van cellen in het luchtruim lumen. Tenzij de longen echter worden opgeblazen tijdens perfusiefixatie, zal het longweefsel waarschijnlijk instorten.
Luchtinflatie met vasculaire perfusie-fixatie maakt gebruik van sterke punten van elk van de bovenstaande fixatietechnieken. Hierin geven we een protocol voor deze techniek. De benodigde materialen en apparatuur zijn relatief goedkoop en kunnen eenvoudig worden verkregen en gemonteerd. De voltooide opstelling, weergegeven in figuur 1A,zorgt voor een constante luchtwegdruk op de longen door middel van een verstelbare, met vloeistof gevulde kolom, terwijl een peristaltische pomp fixatief levert via de rechter ventrikel. Longen met geconserveerde morfologie kunnen dan verder worden verwerkt voor structuur-functieanalyses.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hoewel vaak gebruikt, verdringen intratracheale fixatiemethoden leukocyten uit de luchtwegen en kunnen ze de normale longarchitectuur veranderen. De methode van luchtinflatie met vasculaire perfusie-fixatie die in dit protocol wordt gegeven, overwint deze valkuilen en behoudt nauwkeuriger de longanatomie. De sleutels tot het verkrijgen van hoogwaardig weefsel uit de vasculaire perfusie-fixatiemethode omvatten zorgvuldige monitoring van luchtinflatiedrukken, het vermijden van luchtlekken en het zorgen voor een adequate pe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door de National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) subsidies HL140039 en HL130938. De auteurs willen Shannon Hott en Jazalle McClendon bedanken voor hun technische expertise.
Materials
| 00117XF-Stopcock 1 way 100/PK M Luer | Cole-Parmer | Mfr # VPB1000050N – Item # EW-00117-XF | Stopcock |
| BD 60 mL syringe, slip tip | BD | 309654 | Syringe used to construct the water column |
| BD PrecisionGlide Needle 25G x 5/8 | BD Biosciences | 305122 | Needle for vascular perfusion/fixation |
| Female Luer Thread Style Panel Mount 1/4-28 UNF to Male Luer | Nordson Medical | FTLLBMLRL-1 | Female Luer |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3393 | Heparin solution. |
| Luer-Stub Adapter BD Intramedic 20 Gauge | BD Biosciences | 427564 | Luer-Stub Adapter |
| Male Luer (2) to Female Luer Thread Style Tee | Nordson Medical | LT787-9 | Male Luer |
| Nalgene 180 Clear Plastic PVC Tubing | ThermoFisher Scientific | 8000-9020 | Tubing |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution – 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Fixative solution. Diluted to 4% with phosphate buffered saline |
| Permatex Ultra Blue Multipurpose RTV Silicone Gasket Maker | Permatex | 81724 | Silicone Gasket Maker for air-tight sealing of chambers |
| Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | Bottle used to construct the air-inflation chamber, and buffer used for heparin and fixative solutions |
| Sterilite Ultra Seal 16.0 cup rectangle food storage container | Sterilite | 0342 | Animal processing container |
References
- Hsia, C. C. W., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An Official Research Policy Statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: Standards for Quantitative Assessment of Lung Structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Weibel, E. R., Limacher, W., Bachofen, H. Electron microscopy of rapidly frozen lungs: evaluation on the basis of standard criteria. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 53 (2), 516-527 (1982).
- Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 53 (2), 528-533 (1982).
- Gil, J., Bachofen, H., Gehr, P., Weibel, E. R. Alveolar volume-surface area relation in air- and saline-filled lungs fixed by vascular perfusion. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 47 (5), 990-1001 (1979).
- Harris, R. S. Pressure-Volume Curves of the Respiratory System. Respiratory Care. 50 (1), 78-99 (2005).
- Bachofen, H., Schürch, S. Alveolar surface forces and lung architecture. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 129 (1), 183-193 (2001).
- Mead, J., Takishima, T., Leith, D. Stress distribution in lungs: a model of pulmonary elasticity. Journal of Applied Physiology. 28 (5), 596-608 (1970).
- Mariano, C. A., Sattari, S., Maghsoudi-Ganjeh, M., Tartibi, M., Lo, D. D., Eskandari, M. Novel Mechanical Strain Characterization of Ventilated ex vivo Porcine and Murine Lung using Digital Image Correlation. Frontiers in Physiology. 11, 600492 (2020).
- Braber, S., Verheijden, K. a. T., Henricks, P. a. J., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), 843-851 (2010).
- Brain, J. D., Gehr, P., Kavet, R. I. Airway Macrophages. American Review of Respiratory Disease. 129 (5), 823-826 (1984).
- Wheeldon, E. B., Podolin, P. L., Mirabile, R. C. Alveolar Macrophage Distribution in a Mouse Model: The Importance of the Fixation Method. Toxicologic Pathology. 43 (8), 1162-1165 (2015).
- Matulionis, D. H. Lung deformation and macrophage displacement in smoke-exposed and normal mice (Mus musculus) following different fixation procedures. Virchows Archiv. A, Pathological Anatomy and Histopathology. 410 (1), 49-56 (1986).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (65), e3564 (2012).
- Crosfill, M. L., Widdicombe, J. G. Physical characteristics of the chest and lungs and the work of breathing in different mammalian species. The Journal of Physiology. 158 (1), 1-14 (1961).
- Ramos-Vara, J. A. Principles and Methods of Immunohistochemistry. Drug Safety Evaluation: Methods and Protocols. , 115-128 (2017).
