Inflado al aire de los pulmones murinos con fijación de perfusión vascular
Summary
Se presenta un método para la inflación del aire con fijación de perfusión vascular de los pulmones que preserva la ubicación de las células dentro de las vías respiratorias, los alvéolos y el intersticio para los análisis de estructura-función. La presión constante de las vías respiratorias se mantiene con una cámara de inflado de aire, mientras que el fijador se perfunde a través del ventrículo derecho. Los pulmones se procesan para estudios histológicos.
Abstract
La histología pulmonar se utiliza a menudo para investigar las contribuciones proporcionadas por las células del espacio aéreo durante la homeostasis pulmonar y la patogénesis de la enfermedad. Sin embargo, los métodos de fijación basados en la instilación comúnmente utilizados pueden desplazar las células del espacio aéreo y el moco en las vías respiratorias terminales y pueden alterar la morfología del tejido. En comparación, las técnicas de fijación de perfusión vascular son superiores para preservar la ubicación y la morfología de las células dentro de los espacios aéreos y el revestimiento de la mucosa. Sin embargo, si la presión positiva en las vías respiratorias no se aplica simultáneamente, las regiones de los pulmones pueden colapsar y los capilares pueden abultarse en los espacios alveolares, lo que lleva a la distorsión de la anatomía pulmonar. Aquí, describimos un método económico para la inflación del aire durante la fijación de perfusión vascular para preservar la morfología y la ubicación de las células de las vías respiratorias y alveolares y el intersticio en los pulmones murinos para estudios histológicos aguas abajo. La presión de aire constante se entrega a los pulmones a través de la tráquea desde una cámara sellada y llena de aire que mantiene la presión a través de una columna de líquido ajustable mientras que el fijador se perfunde a través del ventrículo derecho.
Introduction
La histología pulmonar representa el estándar de oro para evaluar la arquitectura pulmonar durante la salud y la enfermedad y es una de las herramientas más utilizadas por los investigadores pulmonares1. Uno de los aspectos más críticos de esta técnica es el adecuado aislamiento y preservación del tejido pulmonar, ya que la variabilidad en este paso puede conducir a una mala calidad del tejido y resultados erróneos1,2,3. En animales vivos, el volumen pulmonar está determinado por el equilibrio entre el retroceso elástico hacia adentro del pulmón y las fuerzas hacia afuera transmitidas desde la pared torácica y el diafragma por la tensión superficial. En consecuencia, cuando se ingresa al tórax, se pierden fuerzas externas y el pulmón colapsa. Las secciones histológicas preparadas a partir de pulmones colapsados tienen una apariencia abarrotada y los límites entre los compartimentos anatómicos (es decir, los espacios aéreos, la vasculatura y el intersticio) pueden ser difíciles de distinguir. Para eludir este desafío, los investigadores a menudo inflan los pulmones durante la fijación química para que se mantenga el tamaño y la arquitectura del espacio aéreo.
Los pulmones se pueden inflar con aire o líquido. La presión necesaria para inflar los pulmones al mismo volumen difiere entre la inflación de aire y líquido debido a las fuerzas intermoleculares en la interfaz aire-líquido. Se requiere una presión más alta (por ejemplo, 25 cmH2O) durante el inflado del aire que la inflación líquida (por ejemplo, 12 cmH2O) para superar la tensión superficial y abrir los alvéolos colapsado4. Una vez que los alvéolos han sido reclutados, una presión más baja puede mantener los alvéolos abiertos al mismo volumen que las mesetas de la curva presión-volumen, y las presiones se igualan en todo el pulmón de acuerdo con la ley de Pascal4,5,6,7,8.
Existen dos métodos principales de inflación y fijación pulmonar para preservar los pulmones murinos para la histología. Más comúnmente, los espacios aéreos se inculcan con líquido, a menudo conteniendo un fijador. La principal ventaja de este enfoque es que es relativamente fácil y requiere poca capacitación. Mientras que la instilación intratraqueal de fijador puede ser preferida en estudios que se centran en la vasculatura, el líquido que se instila a través de la tráquea tiende a empujar las células de las vías respiratorias proximales y las mucinas hacia regiones del espacio aéreo más distales, mientras que la inflación del aire no es1,3,4,9,10,11. Además, el desprendimiento involuntario de leucocitos del epitelio durante la inflación líquida altera su morfología, dándoles artificualmente una apariencia simple y redondeada4,10,11,12. Finalmente, la inflación de los pulmones con líquido puede comprimir involuntariamente el intersticio4,10,11. Juntos, estos factores pueden distorsionar la anatomía normal y las distribuciones celulares dentro de los pulmones preservados, limitando así la técnica.
Un método alternativo de preservación de tejidos es la fijación de perfusión vascular. En este método, el fijador se perfunde en la vasculatura pulmonar a través de la vena cava o el ventrículo derecho. Este método preserva la ubicación y la morfología de las células en la luz del espacio aéreo. Sin embargo, a menos que los pulmones se inflen durante la fijación de perfusión, es probable que el tejido pulmonar colapse.
El inflado de aire con fijación de perfusión vascular aprovecha las fortalezas de cada una de las técnicas de fijación anteriores. Aquí proporcionamos un protocolo para esta técnica. Los materiales y equipos que se requieren son relativamente baratos y se pueden obtener y ensamblar fácilmente. La configuración completa, que se muestra en la Figura 1A,proporciona presión constante de las vías respiratorias a los pulmones a través de una columna ajustable llena de líquido, mientras que una bomba peristáltica administra fijador a través del ventrículo derecho. Los pulmones con morfología preservada pueden procesarse posteriormente para análisis de estructura-función.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aunque se usan comúnmente, los métodos de fijación intratraqueales desplazan a los leucocitos de las vías respiratorias y pueden alterar la arquitectura pulmonar normal. El método de inflado de aire con fijación de perfusión vascular que se proporciona en este protocolo supera estos escollos y preserva con mayor precisión la anatomía pulmonar. Las claves para obtener tejido de alta calidad del método de fijación de perfusión vascular incluyen un monitoreo cuidadoso de las presiones de inflado de aire, evitar …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por las subvenciones HL140039 y HL130938 del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre (NHLBI). Los autores desean agradecer a Shannon Hott y Jazalle McClendon por su experiencia técnica.
Materials
| 00117XF-Stopcock 1 way 100/PK M Luer | Cole-Parmer | Mfr # VPB1000050N – Item # EW-00117-XF | Stopcock |
| BD 60 mL syringe, slip tip | BD | 309654 | Syringe used to construct the water column |
| BD PrecisionGlide Needle 25G x 5/8 | BD Biosciences | 305122 | Needle for vascular perfusion/fixation |
| Female Luer Thread Style Panel Mount 1/4-28 UNF to Male Luer | Nordson Medical | FTLLBMLRL-1 | Female Luer |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3393 | Heparin solution. |
| Luer-Stub Adapter BD Intramedic 20 Gauge | BD Biosciences | 427564 | Luer-Stub Adapter |
| Male Luer (2) to Female Luer Thread Style Tee | Nordson Medical | LT787-9 | Male Luer |
| Nalgene 180 Clear Plastic PVC Tubing | ThermoFisher Scientific | 8000-9020 | Tubing |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution – 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Fixative solution. Diluted to 4% with phosphate buffered saline |
| Permatex Ultra Blue Multipurpose RTV Silicone Gasket Maker | Permatex | 81724 | Silicone Gasket Maker for air-tight sealing of chambers |
| Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | Bottle used to construct the air-inflation chamber, and buffer used for heparin and fixative solutions |
| Sterilite Ultra Seal 16.0 cup rectangle food storage container | Sterilite | 0342 | Animal processing container |
References
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