혈관 관혈 -고정을 가진 뮤린 폐의 공기 인플레이션
Summary
제시는 구조 기능 분석을 위한 기도, 폐포 및 간질 내세포의 위치를 보존하는 폐의 혈관 관류 고정을 가진 공기 인플레이션을 위한 방법입니다. 지속적인 기도 압력은 공기 인플레이션 챔버로 유지되며 고정은 오른쪽 심실을 통해 퍼프됩니다. 폐는 히스토로지학 연구를 위해 처리됩니다.
Abstract
폐 조직학은 폐 항상성 및 질병 병인 동안 영공 세포에 의해 제공된 기여를 조사하기 위하여 수시로 이용됩니다. 그러나, 일반적으로 사용되는 주입 기반 고정 방법은 영공 세포와 점액을 말기 항공으로 대체할 수 있으며 조직 형태를 변경할 수 있습니다. 이에 비해 혈관 관류 고정 기술은 영공 및 점막 안대기 내의 세포의 위치와 형태를 보존하는 데 탁월합니다. 그러나, 양수기도 압력이 동시에 적용되지 않으면 폐의 영역이 붕괴될 수 있으며 모세혈관이 폐포 공간으로 팽창하여 폐 해부학의 왜곡으로 이어질 수 있다. 본명, 하류 조직학 연구를 위한 뮤린 폐내기도 및 폐포 세포 및 간질의 형태와 위치를 보존하기 위해 혈관 관류 고정 시 공기 인플레이션에 대한 저렴한 방법을 설명합니다. 일정한 기압은 고정이 오른쪽 심실을 통해 침투되는 동안 조절 가능한 액체 컬럼을 통해 압력을 유지하는 밀봉된 공기 채워진 챔버에서 기관을 통해 폐로 전달됩니다.
Introduction
폐 공증은 건강과 질병 동안 폐 건축을 평가하기위한 금 본위제이며 폐 연구자1에의해 가장 일반적으로 사용되는 도구 중 하나입니다. 이 기술의 가장 중요한 양상 중 하나는 폐 조직의 적절한 격리 및 보존이며,이 단계의 가변성은 조직 품질 저하 및 잘못된 결과1,2,3로이어질 수 있기 때문이다. 살아있는 동물에서 폐 부피는 표면 장력에 의해 흉벽과 횡격막에서 전염되는 폐의 내탄 반동과 외부 력 사이의 균형에 의해 결정됩니다. 따라서 흉부에 들어가면 바깥쪽 힘이 손실되고 폐가 붕괴됩니다. 붕괴된 폐에서 제조된 히스토로지학적 섹션은 해부학 구획(즉, 영공, 혈관 및 간질)의 경계가 혼잡하여 구별하기 어려울 수 있다. 이 도전을 우회하기 위하여는, 연구원은 수시로 영공 규모 및 건축이 유지되도록 화학 고정 도중 폐를 팽창합니다.
폐는 공기 또는 액체로 팽창할 수 있습니다. 폐를 동일한 부피로 팽창시키는 데 필요한 압력은 공기-액체 인터페이스의 분자 간 힘으로 인해 공기 및 액체 인플레이션 간에 다릅니다. 표면 장력을 극복하고 붕괴된폐포4를열기 위해서는 액체 인플레이션(예를 들어, 12cmH 2O)보다 공기 인플레이션 시 고압(예를 들어, 25cmH2O)이필요합니다. 폐포를 모집하면, 낮은 압력은 압력 볼륨 곡선 고원과 동일한 부피로 폐포를 열어 둘 수 있으며, 압력은 파스칼의 법칙4,5,6,7,8에따라 폐 전체에 걸쳐 균등화될 수 있다.
폐 인플레이션과 고정의 두 가지 주요 방법은 히스토로지에 대한 뮤린 폐를 보존하기 위해 존재한다. 가장 일반적으로, 영공은 액체로 주입됩니다 – 종종 고정을 포함. 이 방법의 주요 장점은 상대적으로 쉽고 약간의 교육이 필요하다는 것입니다. 고정제의 내내 주입은 혈관에 초점을 맞추는 연구에서 선호될 수 있지만, 기관지를 통해 주입되는 액체는 근위기도 세포와 뮤신을 더 많은 실기 영공 영역으로 밀어 넣는 경향이 있는 반면, 공기 인플레이션은1,3,4,9,10,11을하지 않는다. 더욱이, 액체 인플레이션 시 상피로부터 백혈구의 부주의하게 분리하면 형태가 변하고, 관절학적으로 단순하고 둥근외관4,10,11,12를준다. 마지막으로, 액체를 가진 폐의 인플레이션은 의도하지 않게 중간4,10,11을압축할 수 있다. 함께, 이러한 요인은 보존 된 폐 내에서 정상적인 해부학 및 세포 분포를 왜곡 할 수 있습니다, 따라서 기술을 제한.
조직 보존의 다른 방법은 혈관 관류 고정입니다. 이 방법에서, 고정은 정맥 카바 또는 오른쪽 심실을 통해 폐 혈관으로 침투된다. 이 방법은 영공 루멘에서 세포의 위치와 형태를 보존합니다. 그러나 관류 고정 중에 폐가 팽창하지 않는 한 폐 조직이 붕괴 될 가능성이 있습니다.
혈관 관류 고정을 가진 공기 인플레이션은 위의 각 고정 기술의 강점을 활용합니다. 본원에 우리는이 기술에 대한 프로토콜을 제공합니다. 필요한 재료와 장비는 상대적으로 저렴하며 쉽게 얻을 수 있고 조립할 수 있습니다. 도 1A에표시된 완성된 설정은 조절 가능한 유체 채워진 컬럼을 통해 폐에 일정한 기도 압력을 제공하며, 연동 펌프는 오른쪽 심실을 통해 고정을 제공합니다. 보존된 형태학을 가진 폐는 구조물 기능 분석을 위해 추가처리될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
일반적으로 사용되지만, 장내 기반 고정 방법은 기도에서 백혈구를 대체하고 정상적인 폐 아키텍처를 변경할 수 있습니다. 이 프로토콜에 제공되는 혈관 관류 고정을 가진 공기 인플레이션 방법은 이러한 함정을 극복하고 폐 해부학을 보다 정확하게 보존합니다. 혈관 관류 고정 방법에서 고품질 조직을 얻는 열쇠는 공기 인플레이션 압력의 주의 깊은 모니터링, 공기 누출 의 회피, 혈관에 고정의 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 심장에 의해 투자되었다, 폐, 혈액 연구소 (NHLBI) HL140039 및 HL130938을 부여. 저자는 섀넌 핫트와 자잘 맥클렌던의 기술적 전문성에 감사드립니다.
Materials
| 00117XF-Stopcock 1 way 100/PK M Luer | Cole-Parmer | Mfr # VPB1000050N – Item # EW-00117-XF | Stopcock |
| BD 60 mL syringe, slip tip | BD | 309654 | Syringe used to construct the water column |
| BD PrecisionGlide Needle 25G x 5/8 | BD Biosciences | 305122 | Needle for vascular perfusion/fixation |
| Female Luer Thread Style Panel Mount 1/4-28 UNF to Male Luer | Nordson Medical | FTLLBMLRL-1 | Female Luer |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3393 | Heparin solution. |
| Luer-Stub Adapter BD Intramedic 20 Gauge | BD Biosciences | 427564 | Luer-Stub Adapter |
| Male Luer (2) to Female Luer Thread Style Tee | Nordson Medical | LT787-9 | Male Luer |
| Nalgene 180 Clear Plastic PVC Tubing | ThermoFisher Scientific | 8000-9020 | Tubing |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution – 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Fixative solution. Diluted to 4% with phosphate buffered saline |
| Permatex Ultra Blue Multipurpose RTV Silicone Gasket Maker | Permatex | 81724 | Silicone Gasket Maker for air-tight sealing of chambers |
| Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | Bottle used to construct the air-inflation chamber, and buffer used for heparin and fixative solutions |
| Sterilite Ultra Seal 16.0 cup rectangle food storage container | Sterilite | 0342 | Animal processing container |
References
- Hsia, C. C. W., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An Official Research Policy Statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: Standards for Quantitative Assessment of Lung Structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Weibel, E. R., Limacher, W., Bachofen, H. Electron microscopy of rapidly frozen lungs: evaluation on the basis of standard criteria. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 53 (2), 516-527 (1982).
- Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 53 (2), 528-533 (1982).
- Gil, J., Bachofen, H., Gehr, P., Weibel, E. R. Alveolar volume-surface area relation in air- and saline-filled lungs fixed by vascular perfusion. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 47 (5), 990-1001 (1979).
- Harris, R. S. Pressure-Volume Curves of the Respiratory System. Respiratory Care. 50 (1), 78-99 (2005).
- Bachofen, H., Schürch, S. Alveolar surface forces and lung architecture. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 129 (1), 183-193 (2001).
- Mead, J., Takishima, T., Leith, D. Stress distribution in lungs: a model of pulmonary elasticity. Journal of Applied Physiology. 28 (5), 596-608 (1970).
- Mariano, C. A., Sattari, S., Maghsoudi-Ganjeh, M., Tartibi, M., Lo, D. D., Eskandari, M. Novel Mechanical Strain Characterization of Ventilated ex vivo Porcine and Murine Lung using Digital Image Correlation. Frontiers in Physiology. 11, 600492 (2020).
- Braber, S., Verheijden, K. a. T., Henricks, P. a. J., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), 843-851 (2010).
- Brain, J. D., Gehr, P., Kavet, R. I. Airway Macrophages. American Review of Respiratory Disease. 129 (5), 823-826 (1984).
- Wheeldon, E. B., Podolin, P. L., Mirabile, R. C. Alveolar Macrophage Distribution in a Mouse Model: The Importance of the Fixation Method. Toxicologic Pathology. 43 (8), 1162-1165 (2015).
- Matulionis, D. H. Lung deformation and macrophage displacement in smoke-exposed and normal mice (Mus musculus) following different fixation procedures. Virchows Archiv. A, Pathological Anatomy and Histopathology. 410 (1), 49-56 (1986).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (65), e3564 (2012).
- Crosfill, M. L., Widdicombe, J. G. Physical characteristics of the chest and lungs and the work of breathing in different mammalian species. The Journal of Physiology. 158 (1), 1-14 (1961).
- Ramos-Vara, J. A. Principles and Methods of Immunohistochemistry. Drug Safety Evaluation: Methods and Protocols. , 115-128 (2017).
