Purificación y expansión de células T asesinas naturales invariantes de ratón para estudios in vitro e in vivo
Summary
Describimos un protocolo rápido y robusto para enriquecer células T asesinas naturales invariantes (iNKT) del bazo de ratón y expandirlas in vitro a números adecuados para estudios in vitro e in vivo.
Abstract
Las células T asesinas naturales invariantes (iNKT) son linfocitos T innatos que expresan un receptor de células T semiinvariante (TCR) conservado específico para antígenos lipídicos propios o microbianos presentados por la molécula no polimórfica MHC de clase I CD1d. Los estudios preclínicos y clínicos respaldan un papel de las células iNKT en el cáncer, la autoinmunidad y las enfermedades infecciosas. Las células iNKT están muy conservadas en todas las especies y su investigación ha sido facilitada por modelos de ratón, incluidos ratones deficientes en CD1d o deficientes en iNKT, y la posibilidad de detectarlas inequívocamente en ratones y hombres con tetrámeros CD1d o mAbs específicos para el TCR semiinvariante. Sin embargo, las células iNKT son raras y necesitan ser expandidas para alcanzar números manejables para cualquier estudio. Debido a que la generación de la línea celular iNKT primaria de ratón in vitro ha demostrado ser difícil, hemos establecido un protocolo robusto para purificar y expandir las células iNKT esplénicas de los ratones transgénicos iVα14-Jα18 (iVα14Tg), en los que las células iNKT son 30 veces más frecuentes. Mostramos aquí que las células iVα14Tg iNKT esplénicas primarias se pueden enriquecer a través de un proceso de separación inmunomagnética, produciendo aproximadamente un 95-98% de células iNKT puras. Las células iNKT purificadas son estimuladas por perlas anti-CD3/CD28 más IL-2 e IL-7, lo que resulta en una expansión de 30 veces por día +14 del cultivo con una pureza del 85-99%. Las células iNKT expandidas se pueden manipular genéticamente fácilmente, proporcionando una herramienta invaluable para diseccionar los mecanismos de activación y función in vitro y, lo que es más importante, también en la transferencia adoptiva in vivo.
Introduction
Las células T asesinas naturales invariantes (células iNKT) son linfocitos T innatos que expresan un receptor de células T αβ (TCR) semiinvariante, formado en ratones por una cadena invariante Vα14-Jα18 emparejada con un conjunto limitado de diversas cadenas Vβ1,que es específico para los antígenos lipídicos presentados por la molécula relacionada con MHC clase I CD1d2. Las células iNKT se someten a un programa de selección de agonistas que resulta en la adquisición de un fenotipo efector activado/innato ya en el timo, que se produce a través de varias etapas de maduración3,4,produciendo unsubconjunto CD4+ y un subconjunto CD4.. A través de este programa, las células iNKT adquieren fenotipos efectores T auxiliares (TH),a saber, TH1 (iNKT1), TH2 (iNKT2) y TH17 (iNKT17), identificables por la expresión de los factores de transcripción T-bet, GATA3, PLZF y RORγt, respectivamente5. Las células iNKT reconocen una gama de lípidos microbianos, pero también son autorreactivas contra los lípidos endógenos que están regulados al alza en el contexto de situaciones patológicas de estrés celular y daño tisular, como el cáncer y la autoinmunidad2. Tras la activación, las células iNKT modulan las funciones de otras células efectoras inmunes innatas y adaptativas a través del contacto directo y la producción de citoquinas2.
Las investigaciones de las células iNKT han sido facilitadas por modelos de ratón, incluidos ratones deficientes en CD1d o deficientes en Jα18, y por la producción de tetrámeros CD1d cargados de antígenos más la generación de anticuerpos monoclonales (mAbs) específicos para el TCR semiinvariante humano. Sin embargo, la generación de la línea celular iNKT primaria de ratón ha resultado difícil. Para caracterizar mejor las funciones antitumorales de las células iNKT y utilizarlas para la terapia celular adoptiva, establecimos un protocolo para purificar y expandir las células iNKT esplénicas de ratones transgénicos iVα14-Jα18 (iVα14Tg)6, en el que las células iNKT son 30 veces más frecuentes que en ratones de tipo salvaje.
Las células iNKT expandidas pueden ser explotadas para ensayos in vitro, e in vivo al transferirse de nuevo a ratones. En este contexto, por ejemplo, hemos demostrado sus potentes efectos antitumorales7. Además, las células iNKT expandidas in vitro son susceptibles de modificación funcional a través de la transferencia o edición de genes antes de su inyección in vivo8,lo que permite un análisis funcional perspicaz de las vías moleculares, así como allanar el camino para terapias celulares avanzadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí mostramos un protocolo reproducible y factible para obtener millones de células iNKT listas para usar. Debido a la escasez de estas células in vivo, era muy necesario un método para expandirlas. El protocolo que proponemos no requiere ni una instrumentación particular ni un alto número de ratones. Explotamos ratones transgénicos iVα14-Jα18 a propósito para reducir el número de ratones necesarios para el procedimiento.
Otro protocolo exitoso para la expansión de células iNKT d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Paolo Dellabona y Giulia Casorati por el apoyo científico y la lectura crítica del manuscrito. También agradecemos al NIH Tetramer Core Facility por el tetrámero CD1d de ratón. El estudio fue financiado por la Fondazione Cariplo Grant 2018-0366 (a M.F.) y la beca de la Asociación Italiana para la Investigación del Cáncer (AIRC) 2019-22604 (a G.D.).
Materials
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) solution | in house | 0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4 | |
| anti-FITC Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-701 | |
| anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
| CD19 -FITC | Biolegend | 115506 | clone 6D5 |
| CD1d-tetramer -PE | NIH tetramer core facility | mouse PBS57-Cd1d-tetramers | |
| CD4 -PeCy7 | Biolegend | 100528 | clone RM4-5 |
| Fc blocker | BD Bioscience | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0186L | heat-inactivated and filtered .22 before use |
| FOXP3 Transcription factor staining buffer | eBioscience | 00-5523-00 | |
| H2 (IAb) -FITC | Biolegend | 114406 | clone AF6-120.1 |
| hrIL-2 | Chiron Corp | ||
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| LD Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS buffer (MB) | in house | 0.5% Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich) and 2Mm EDTA | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-035 | |
| Penicillin and streptomycin (Pen-Strep) | Lonza | 15140-122 | |
| PermWash | BD Bioscience | 51-2091KZ | |
| PFA | Sigma | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | EuroClone | ECB4004L | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Pre-Separation Filters (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Recombinat Mouse IL-7 | R&D System | 407-ML-025 | |
| RPMI 1640 with glutamax | Gibco | 61870-010 | |
| sodium pyruvate | Gibco | 11360-039 | |
| TCRβ -APC | Biolegend | 109212 | clone H57-597 |
| αCD3CD28 mouse T activator Dynabeads | Gibco | 11452D | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |
References
- Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. The biology of NKT cells. Annual Review of Immunology. 25, 297-336 (2007).
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature Reviews: Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
- Pellicci, D. G., et al. A natural killer T (NKT) cell developmental pathway iInvolving a thymus-dependent NK1.1(-)CD4(+) CD1d-dependent precursor stage. Journal of Experimental Medicine. 195 (7), 835-844 (2002).
- Benlagha, K., Kyin, T., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. A thymic precursor to the NK T cell lineage. Science. 296 (5567), 553-555 (2002).
- Lee, Y. J., Holzapfel, K. L., Zhu, J., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Steady-state production of IL-4 modulates immunity in mouse strains and is determined by lineage diversity of iNKT cells. Nature Immunology. 14 (11), 1146-1154 (2013).
- Griewank, K., et al. Homotypic interactions mediated by Slamf1 and Slamf6 receptors control NKT cell lineage development. Immunity. 27 (5), 751-762 (2007).
- Cortesi, F., et al. Bimodal CD40/Fas-Dependent Crosstalk between iNKT Cells and Tumor-Associated Macrophages Impairs Prostate Cancer Progression. Cell Reports. 22 (11), 3006-3020 (2018).
- Heczey, A., et al. Invariant NKT cells with chimeric antigen receptor provide a novel platform for safe and effective cancer immunotherapy. Blood. 124 (18), 2824-2833 (2014).
- Liu, Y., et al. A modified alpha-galactosyl ceramide for staining and stimulating natural killer T cells. Journal of Immunological Methods. 312 (1-2), 34-39 (2006).
- Chiba, A., et al. Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro. Immunology. 128 (3), 324-333 (2009).
- Crowe, N. Y., et al. Differential antitumor immunity mediated by NKT cell subsets in vivo. Journal of Experimental Medicine. 202 (9), 1279-1288 (2005).
- de Lalla, C., et al. Production of profibrotic cytokines by invariant NKT cells characterizes cirrhosis progression in chronic viral hepatitis. Journal of Immunology. 173 (2), 1417-1425 (2004).
- Tian, G., et al. CD62L+ NKT cells have prolonged persistence and antitumor activity in vivo. Journal of Clinical Investigation. 126 (6), 2341-2355 (2016).
- Gaya, M., et al. Initiation of Antiviral B Cell Immunity Relies on Innate Signals from Spatially Positioned NKT Cells. Cell. 172 (3), 517-533 (2018).
- Rotolo, A., et al. Enhanced Anti-lymphoma Activity of CAR19-iNKT Cells Underpinned by Dual CD19 and CD1d Targeting. Cancer Cell. 34 (4), 596-610 (2018).
- Schneidawind, D., et al. Third-party CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality. Blood. 125 (22), 3491-3500 (2015).
- Schneidawind, D., et al. CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality through expansion of donor CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells. Blood. 124 (22), 3320-3328 (2014).
- Schneidawind, D., Pierini, A., Negrin, R. S. Regulatory T cells and natural killer T cells for modulation of GVHD following allogeneic hematopoietic cell transplantation. Blood. 122 (18), 3116-3121 (2013).
- Leveson-Gower, D. B., et al. Low doses of natural killer T cells provide protection from acute graft-versus-host disease via an IL-4-dependent mechanism. Blood. 117 (11), 3220-3229 (2011).
- Coman, T., et al. Human CD4- invariant NKT lymphocytes regulate graft versus host disease. Oncoimmunology. 7 (11), 1470735 (2018).
- Xu, X., et al. NKT Cells Coexpressing a GD2-Specific Chimeric Antigen Receptor and IL15 Show Enhanced In vivo Persistence and Antitumor Activity against Neuroblastoma. Clinical Cancer Research. 25 (23), 7126-7138 (2019).
- Heczey, A., et al. Anti-GD2 CAR-NKT cells in patients with relapsed or refractory neuroblastoma: an interim analysis. Nature Medicine. 26 (11), 1686-1690 (2020).
- Exley, M. A., et al. Adoptive Transfer of Invariant NKT Cells as Immunotherapy for Advanced Melanoma: A Phase I Clinical Trial. Clinical Cancer Research. 23 (14), 3510-3519 (2017).
- Wolf, B. J., Choi, J. E., Exley, M. A. Novel Approaches to Exploiting Invariant NKT Cells in Cancer Immunotherapy. Frontiers in Immunology. 9, 384 (2018).
