小鼠膝盖外展肌肉功能的体内测量

所有实验程序都得到了肯塔基大学机构动物护理和使用委员会的批准。 1. 设备设置 确认机器是按制造商规格连接的。 如果尚未到位，将带膝部伸展装置的 300D-305C-FP 电机连接到 809C 动物平台。 打开水泵至 37 °C，开始加热平台。 如果计算机尚未打开，则打开计算机，然后打开大功率双相刺激器和 2 通道双模杆系统。 将异黄素倒入蒸发器中，以达到最大填充线。 2. 软件设置 打开软件（ 材料表中提供的详细信息）。 要与实时数据监视器一起使用即时刺激功能来优化探头放置（步骤 4），请选择 准备实验 ，然后选择 配置即时刺激 （图 1）。将 脉冲频率 （Hz） 设置为 125， 脉冲宽度 （ms） 设置为 0.2， 脉冲数量 设置为 1， 将列车频率 （Hz） 设置为 0.5，将 运行时间 （s）设置为 120。 选择 文件 并打开 实时数据监视器。 要执行抽搐（第 5 步）和扭矩频率（第 6 步）实验，请选择以前编程的研究，其中包括适当的抽搐和膝关节延伸扭矩频率实验（详见下一步 5 和第 6 步）。 选择合适的实验鼠标或 添加新动物 ，并输入相应的鼠标信息，以存储扭矩数据。 选择 下一个实验 或 以前的实验 ，从抽搐协议过渡到扭矩频率序列。 3. 鼠标设置 将单个鼠标放入麻醉室。 释放氧气罐阀，将氧气流量设定为 1 L/min，含 2.5% 异黄素。 确保鼠标保持在腔室中，盖子牢固地关闭，直到完全失去知觉。确认完全失去知觉缺乏脚反射与脚趾捏。 将麻醉小鼠置于超音速位置，头部在加热平台的鼻锥中，氧气流动速率为 1 L/min，异黄素为 2.5%。 使用电动剪子从右后肢剃头发。用酒精擦拭和小真空从剃须区取下头发。清洁去除的头发远离后肢和平台。 牢牢地夹住上后肢，后肢夹在膝盖上（图2）。注意：确保膝盖的运动范围不受阻碍。 将下肢放入膝盖延长装置中，前头骨轻轻触摸可调节塑料片（ 通道阅读力 应读取 0 至 -1.0 mN*m）。根据小鼠下肢的大小，手术胶带可能包裹在可调节塑料片的底部，使腿部能够安全地休息。注：定制塑料片的详细图像和尺寸显示在 补充图1中。 调整平台上的旋钮，确保膝盖在 60°下弯曲。 轻轻将一块胶带放在鼠标躯干上，以防止以最大膝盖伸展进行补偿性运动。 4. 电极放置 将电极皮下皮2-4毫米近在膝盖正上方的四头肌/膝盖扩展肌肉（图2）。电极应相距约1-2毫米。 要确定电极的最佳位置，使用实时数据监视器的即时刺激功能。将安培/电流设置为 50 mA，用于重复抽搐以确认膝盖延长（膝盖扩张器将产生负抽搐曲线）。在即时刺激期间调整探头，以实现实时数据监视器窗口中测量的最大膝盖延长抽搐扭矩。注： 图3 显示具有代表性的 即时刺激 输出，确认膝盖延长。 补充视频 1 和 补充视频 2 显示实时和慢动作膝盖扩张抽搐没有电机臂到位，允许对膝盖延伸的视觉确认。 在反复抽搐与 即时刺激，味觉膝盖屈肌与食指确认没有激活拮抗性肌肉。为了最大限度地刺激膝盖外显子，根据小鼠的身体组成和股骨神经和膝盖扩展肌肉运动点的确切位置的细微解剖差异，可能需要重新定位探针。注：肌肉运动点是神经运动分支进入肌肉腹部的位置，是电导率抵抗力最低的点，随后对电刺激的反应最高。14，15。在使用电刺激的临床应用中，通过用笔电极扫描来识别这一点，以找到肌肉抽搐发生位置，注射电流最低为 14，15。肌肉运动点的识别对于促进最佳神经肌肉电刺激至关重要。在人体临床试验中，在肌肉的半部中发现了四头肌的肌肉运动点。为了在小鼠中实现最佳的膝部扩展刺激，该技术使用电极放置与即时刺激进行重新概括，以最接近的肌肉运动点位置，通常发现在膝盖扩展器的半部分。电极放置（从相对浅到深）存在一些变异性，从而产生最大扭矩，即时刺激功能可促进最佳电极放置。 5. 确定最佳电流 确定最佳探头位置后，执行一系列渐进式抽搐，以确定用于扭矩频率实验的最佳放大器/电流，目标是确定最低电流，以实现最大抽搐扭矩输出。从 50 mA 的电流开始，选择 运行实验 以产生单个抽搐。选择 分析结果 以显示扭矩输出。记录 在最大力 下显示的抽搐扭矩，并减去基线。注：选择反转 力通道 的选项，将测量值从负扭矩转换为正转。 将电流增加到 60-70 mA 并重复抽搐实验。记录 在最大力 下显示的抽搐扭矩，并减去基线。 继续以这种方式进行一系列抽搐实验（每次进展增加约10-20mA），直到抽搐扭矩不再增加（或开始减少）。抽搐系列示例显示在表 1中。 记录实现最高抽搐扭矩的最低电流。此电流将在即将到来的力频实验中使用并保持恒定。 图 4 显示一个具有代表性的峰值抽搐。 6. 扭矩频率实验，以确定峰值等轴破伤风扭矩 在软件中（参见 材料表），选择预先编程的扭矩频率实验，以确保膝盖延伸，确保设置如下。刺激持续时间： 0.35 s， 频率序列： 10 Hz， 40 Hz， 120 Hz， 150 Hz， 180 Hz， 200 Hz， 脉冲/收缩之间的休息时间： 120 s注：采样速率为 10，000 Hz（默认设置）。 运行实验， 分析结果，并手动记录在最大力下显示的扭矩，并减去基线（确保力通道倒置，因为膝盖扩展收缩将产生负扭矩）在每个频率。请注意，最高最大力值为峰值等轴测量破伤风扭矩。扭矩频率数据示例显示在 表 2 中， 图 5 显示了在 120 Hz 下实现的峰值等轴破伤风扭矩输出的代表性破伤风曲线。 7. 终止实验 完成扭矩频率实验后，执行后续抽搐，并在同一电流下与初始峰值抽搐进行比较，以评估损伤/疲劳。注：在一些损伤和疾病模型中，骨骼肌的脂肪性有望增加，并且不构成实验设置或小鼠的问题。 完成所有扭矩测量后，轻轻取下电极探头，解开膝盖。 关闭异黄素，将鼠标从鼻锥中取出。 将鼠标放回放置在加热垫顶部的适当笼子中。当鼠标恢复并恢复意识时，进行监视。注意：鼠标应有意识，并在 2-3 分钟内移动。 8. 数据分析 从分析软件中提取实验后的数据（见 材料表）。 打开分析软件。 从软件中 选择获取数据 。 选择进行实验的日期和适当的鼠标代码。 选择兴趣频率（所有抽搐实验和扭矩频率实验的每个频率将列出）。 选择 肌肉分析。 确认 已检查使用基线校正 。注：基线扭矩由软件计算为从绝对最大扭矩值中取样和减去的前 100 点的平均值。 记录最大 值下列出的扭矩值。注：此处提供的数据未经过滤：但是，如果需要，可以在软件中选择筛选器。 或者，如上文第 6.2 步所述，通过分析结果窗口，手动记录在 Max Force下实时显示的扭矩输出。”每个扭矩频率点/收缩”。 确认基线被减去，力通道倒置。 将数据输入电子表格，用于体重正常化计算（扭矩/体重（克）和感兴趣的图形和统计分析。统计软件用于绘制扭矩频率曲线和计算曲线下的面积。注：扭矩数据以 mN .m（毫新米）表示。 要生成破伤风曲线，从分析软件中导出每个频率的完整数据。 重复步骤 8.1.1-8.1.4 以上。 选择 出口数据。 选择 原始过滤数据 ，并保存在选择的位置。MATLAB 可用于从导出的文本文件生成破伤风曲线和/或进行进一步分析。注：应要求，可使用 MATLAB 代码从文本文件生成破伤风曲线。 9. 双模杆系统校准 在初始使用之前校准系统以确保准确可靠的数据，并定期使用数据收集软件和已知权重重复校准。 打开数据收集软件。 单击 “设置”选项卡 并选择 “通道设置”。 选择在我的仪器下列出的305C-FP。 单击 校准选择 以打开 校准编辑器 窗口。 要校准长度，输入一系列测试电压，包括负电压和正电压（例如 -3、-2、-1、0、1、2、3 V）。 单击 第 一行设置。 单击 “阅读”。 测量杠杆臂的确切长度毫米，并输入到相应的框中。 重复下一个电压。 记录所有电压后，单击 计算卡尔因子 （记录在毫米/伏特）。 要校准力，利用一组已知重量在线性进展中增加。 调整电机，使其位于长凳或桌子的边缘，将操纵臂平行于台面，并悬在边缘，使重量悬空。 使用橡皮筋将第一重量从操纵杆臂上悬挂。在 应用力下，输入已知重量的克占橡皮筋的质量。 选择 阅读。 重复至少 3 个已知重量。 选择 计算卡尔因子。 要验证计算，图标定数据和曲线适合通过选择 情节卡尔。 要校准力，请输入校准电压（最高 10 伏） 单击设置直接在校准电压旁边。 重复每个电压线。 用手指轻轻地向杠杆臂施加压力，直到 力出 停止改变，电机臂开始移动。 保持此位置。选择 阅读。 重复每个电压线。 选择 计算卡尔因子。