다이아몬드 광원의 대상 시리얼 데이터 수집 수정

1. 칩 준비 및 로드 참고: 이 과정은 습도 조절환경(그림 1)내에서 발생하며, 일반적으로 80%에서 90% 이상의 상대 습도가 높으며, 단백질 결정이 건조되는 것을 방지합니다. 일단 장전되고 밀봉되면, 결정은 24 시간 이상 살아남을 수 있습니다. 그러나 이것은 결정 시스템마다 크게 다를 수 있습니다. 챔버 내에서 실리콘 칩(도 1),실리콘 칩, 폴리 에스테르 호일을 가진 칩 홀더(도 2),p200 파이펫, 200 μL 파이펫 팁, 핀셋, 필터 용지 및 단백질 크리스탈 슬러리를 보유하기 위해 적중 단계에 부착 된 저전력 진공 펌프가 필요합니다. 칩 홀더를 준비합니다. 폴리에스테르 호일 2장을 약 6cm x 6cm 의 사각형으로 자른다. 폴리에스테르 시트를 두 개의 베이스 플레이트 위에 놓습니다(크고 작은). 금속 밀봉 링을 사용하여 폴리 에스테르 시트를 제자리에 고정합니다. 조심스럽게 나중에 쉽게 시각화하고 샘플링 샘플을 중심으로 하기 위해 주름을 제거하기 위해 여분의 폴리 에스테르 호일을 당깁니다. 결정의 크기에 비해 적절한 크기의 조리개(7-30 μm)가 있는 실리콘 칩을 선택합니다. 글로우는 0.39mBar에서 25초 동안 칩을 배출하고 15mA의 전류를 사용하여 칩에 마이크로 크리스탈을 쉽게 퍼뜨릴 수 있도록 합니다. 실리콘 칩을 칩 로딩 단계에 올려 놓는 막대가 있는 핀셋을 사용하여 놓습니다. 파이펫을 사용하여 마이크로 크리스탈 슬러리의 200 μL을 칩의 평평한 면에 적용합니다. 칩의 모든 “도시 블록”을 커버하기 위해 크리스탈 슬러리를 확산. 칩이 손상된 경우, 균일 한 진공을 적용 할 수 있도록 폴리 에스테르 호일 또는 필터 파이펫 팁의 작은 조각으로 구멍을 덮어. 모든 여분의 액체가 칩을 통해 흡입 될 때까지 부드러운 진공을 적용합니다. 핀셋으로 칩 로딩 단계에서 칩을 제거합니다. 칩 밑면을 필터 용지로 조심스럽게 얼룩서 과도한 액체를 제거합니다. 로드된 칩을 칩 홀더의 더 큰 절반에 배치하여 가이드 마크 사이에 평평한 면을 표시합니다. 칩 홀더의 작은 절반을 위에 배치하여 칩을 밀봉하십시오. 칩 홀더의 두 반쪽이 제자리에 스냅됩니다. 후반부가 플러시앉아 있지 않으면 홀더 180°를 회전하여 자석을 올바르게 정렬합니다. 칩 홀더를 육사 볼트로 닫은 나사로 고정하여 칩을 제자리에 안전하게 고정시하십시오.참고: 또는, 칩 홀더(37)의폴리에스테르 호일의 두 층 사이에 끼워진 크리스탈 슬러리(~15μL)의 더 작은 부피로 유사한 방식으로 적재할 수 있거나, 또는 50μm 두께의 양면 접착제 스페이서를 사용하여 더 작은 부피를 적재할 수 있다. . 접착제 스페이서를 사용하면 여러 샘플(또는 리간드 스너브와 같은 샘플의 변형)을 각 칩리스 칩에 로드할 수 있습니다. 실리콘 칩을 로드하는 음향 낙하 배출 (ADE)을 악용하는 보완 적재 접근 방식은 다이아몬드39에서도사용할 수 있습니다. ADE를 사용하면 파이펫 하중보다 적은 양의 크리스탈 슬러리를 사용하여 칩을 로드할 수 있습니다. 그것은 특히 유용한 기술 시료가 부족 할 때, 비록 화학 조성 및 슬러리의 점도 고려 되어야 한다. 2. 빔 라인에서 GUI 및 설정 간단한 EPICS 디스플레이 관리자(edm) 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)(그림3a)를통해 데이터 수집을 위한 모든 칩 정렬 및 설정을 수행합니다. 이를 통해 빔라인 계측에 대한 포인트 앤 클릭 인터페이스를 제공하고 Python 기반 데이터 수집을 위한 입력 매개 변수를 제공합니다. 서브 윈도우는 샘플 홀더(도 3b)또는 레이저 / LED 펌프 프로브 실험(도 3c)의하위 영역에서 수집하기위한 추가 제어를 제공합니다. 3. 칩 정렬 운동 탈것을 사용하여 XYZ 단계에 로드된 칩을 빔라인(그림 4a에도시됨)에 놓습니다. 여행 방향을 따라 스테이지를 당기는 것을 피하십시오. 운동성 마운트의 자석은 매우 강하기 때문에 우연히 매우 쉽게 수행 할 수 있습니다. 마운트에 접근할 때 칩 홀더는 약간의 각도(±30°)로 유지되어야 합니다. 자석이 접촉하면 칩 홀더가 바닥 (0 °)에 평행하게 회전할 수 있으며 칩 홀더가 제자리에 클릭합니다(그림 4b). 칩을 언로드할 때 역방향 경로를 따릅니다. 칩 홀더를 멀리 당기기 전에 칩을 회전시키고 스테이지에서 멀리 각도로 향합니다. 빔라인의 축 보기 시스템과 칩 정렬 GUI를 사용하여 칩의 왼쪽 상단 을 찾습니다. 신탁은 서로 직각에서 세 개의 사각형, 두 개의 작은 하나 큰(그림 5a)입니다. 칩이 다시 켜지므로 칩이 흰색 사각형으로 조리개가 있는 어둡게 나타납니다. X, Y 및 Z(그림 5b)의신탁 0에 중심. 각각 왼쪽/오른쪽 및 위/아래로 이동하여 X와 Y를 정렬합니다. 칩을 초점 안팎으로 이동하여 Z를 정렬합니다. 신탁 0 설정을 클릭합니다. 모든 수탁자(오른쪽 상단, 그림 5c)와fiducial 2(왼쪽 아래, 그림 5d)에대해 3.2를 반복하여 모든 신탁을 X선 빔과 정렬합니다. 코-좌완 시스템을눌러 좌표 매트릭스를 생성하고, 이는 모든 후속 움직임이 칩 좌표 프레임에서 수행될 수 있도록 하는 스테이지에 비해 칩의 오프셋, 피치, 롤 및 야우를 계산합니다. 블록 확인을 클릭하여 XYZ 단계를 각 도시 블록의 첫 번째 우물로 이동하여 칩이 잘 정렬되어 있는지 시각적으로 확인합니다. X선 십자선이 조리개와 정렬되면 칩이 정렬됩니다. 그렇지 않은 경우 3.2-3.3 단계를 반복하십시오.참고: 오작동 정렬(파손된 fiducials)의 경우 칩의 다른 조리개를 “정렬 유형” 풀다운 메뉴를 사용하여 정렬에 사용할 수 있습니다. 고정 대상 데이터 수집에는 다양한 유형의 칩이 제공됩니다. 다른 칩 유형은 ‘칩 유형’풀다운 메뉴를 사용하여 수용됩니다. I24에서 사용되는 가장 일반적인 칩 유형은 ‘옥스포드’와 ‘사용자 정의’칩입니다. 칩의 조리개와 신탁의 숫자와 간격은 풀다운 메뉴를 통해 정의된 칩 사전에서 읽습니다. 커스텀 칩을 사용하면 조리개 간격을 즉석에서 정의할 수 있으며, 이는 백막 시트 온 시트 또는 크리스탈이홀더(37)에무작위로 있는 다른 ‘칩리스’ 타입 칩에 특히 유용합니다. 새로운 파이썬 GUI, 이동 – 온 – 클릭 기능과 자동화 된 칩 정렬을 제공하는 현재 개발 중이지만,이 원고의 작성 시 일상적인 사용에 대한 아직 준비가되지 않았습니다. 4. 데이터 수집 설정 참고: 데이터 수집 설정은 연구 중인 시스템과 수행할 실험에 따라 달라집니다. 이것은 간단한 SSX 실험에서 배열할 수 있습니다., 낮은 복용량 구조를 수집, 레이저 또는 빠른 혼합을 사용 하 여 시간 해결 실험에 다른 시간 지연에 여러 완전 한 데이터 집합을 필요로 하는 반응을 시작 하기 위해. 데이터 수집을 설정하려면 다음 매개 변수를 정의해야 합니다. 실험 변수: 폴더, 파일 이름, 노출 시간, 전송 시간, 검출기 거리 및 조리개당 샷 수를 적절히 입력합니다. 칩 유형: 위에서 설명한 바와 같이 칩 유형을 사용 중 칩과 일치시다. 박막 또는 ‘칩리스’ 칩을 사용하는 경우 칩 유형을 없음으로 설정합니다. GUI에서 x와 y 모두에서 단계 및 단계 크기를 정의합니다. 맵 유형 설정: 이를 통해 데이터 수집을 위해 칩의 하위 섹션을 선택할 수있습니다(그림 3b). ‘없음’은 칩의 모든 조리개에서 데이터를 수집한다는 것을 의미합니다. ‘라이트’는 칩의 선택된 도시 블록에서 데이터를 수집함을 의미합니다(그림3b). 예를 들어 칩 영역이 제대로 로드되지 않거나 비어 있는 것으로 알려진 경우에 유용할 수 있습니다. ‘Full’을 사용하면 데이터 수집을 위해 개별 조리개를 선택할 수 있습니다. 이 경우 올바르게 포맷된 텍스트 파일을 제공해야 합니다. 자세한 내용과 템플릿은 빔라인 직원으로부터 얻을 수 있습니다. 펌프 프로브: 펌프 프로브 실험 유형과 원하는 시간 지연을 선택합니다. 펌프의 트리거링(일반적으로 LED 또는 레이저)은 종종 특정 실험에 특정하므로 여기에 자세히 설명되지 않습니다. ‘짧은’ 지연은 펌프와 프로브 사이의 각 조리개에 거주할 때 실험을 참조합니다(예: 펌프, 프로브, ‘다음 샘플로 이동). 지연은 일반적으로 1초 또는 수십 밀리초의 순서로 이루어집니다. 긴 지연은 흥분을 참조하고 다시 방문 (EAVA) 전략, 여기서 조리개는 두 번 방문, 방문 사이의 정의 된 시간 지연 (즉, 펌프, 이동, 펌프, 이동, 프로브, 이동, 프로브, 프로브 등). 시간 지연은 계산되고 X선 노출시간(도 3c)이며일반적으로 ~1초 이상이다. 5. 일반적인 데이터 수집 방법 참고: 수행 중인 실험 유형을 정의하는 주요 매개 변수는 다음과 같습니다. 이 섹션에서는 프로토콜 3의 다른 설정이 “데이터 수집 설정”으로 정의되었다고 가정합니다. 시나리오 1: 저용량 데이터 수집. 샘플 홀더의 선택한 모든 조리개에서 단일 회절 이미지의 컬렉션입니다. 조리개당 샷 수를 1개로 설정합니다. 펌프 프로브를 없음으로 설정합니다. 시나리오 2: 샘플 홀더의 모든 선택된 조리개에서 순차적으로 n 이미지를 수집하는 용량 시리즈. 칩은 각 조리개에 고정되어 있으며 각 n 이미지 집합이 수집됩니다. 조리개당 샷 수를’n’으로 설정합니다. n=5, 10, 20 또는 10의 다른 배수인 경우 처리가 단순화됩니다. n 이 5를 < 경우 트렌드를 확립하기가 어렵습니다. 칩을 커버하는 데 필요한 총 시간과 n이 증가할 때 생성된 이미지 파일 수를 고려하는 것이 유용합니다. 펌프 프로브를 없음으로 설정합니다. 시나리오 3: 펌프 프로브 방법 펌프 프로브 풀다운 메뉴에서 방법을 선택하여 레이저 발산 제어 센터를 엽니다. 펌프 프로브 실험의 경우 각 조리개 옵션에서 레이저 Dwell을 채웁니다. EAVA의 경우 각 조리개와 X선 노출에서 레이저 Dwell을 채우고 계산을클릭합니다. 원하는 지연 시간에 대해 edm GUI 펌프 프로브 드롭다운 메뉴에서 적절한 반복 옵션을 선택합니다. 실험에 레이저 2 Dwell 섹션에서 사전 조명 단계 채우기가 필요한 경우. 모든 실험 변수가 정의된 후 매개 변수 설정 및 짧은 목록을 만듭니다. 이렇게 하면 실험 변수가 지오브릭 컨트롤러에 로드됩니다. 이 작업이 완료되면 시작은 검출기를 이동하고 백라이트를 이동하고 데이터 수집을 시작합니다. 데이터 수집을 설정하는 모든 지점에서 각 단계의 상태 및 결과에 대한 피드백이 인쇄되는 터미널 창을 열어 두는 것이 유용합니다. 6. 데이터 처리 참고: 피드백이 필요한 긴급성에 따라 광범위하게 말하는 데이터 처리는 세 그룹으로 나눌 수 있습니다. 빠른 피드백은 결정이 존재하는지, 그리고 만약 그렇다면 어떤 숫자로 표시해야 합니다. 이렇게 하면 데이터 수집이 계속됩니다. 데이터 수집과 비교 가능한 시간 척도에서 더 느려질 수 있지만 여전히 수행되어야 하는 데이터 인덱싱 및 통합을 수행합니다. 반사 강도를 구조 용액및 전자 밀도 맵 생성을 위한 mtz 파일로 병합 및 스케일링하면 최종 단계를 나타내며 여전히 느려질 수 있습니다. 여기서 처음 두 단계에 대한 I24의 파이프라인 시작은 실시간 피드백이 실험을 안내하는 데 필요한 만큼 논의될 것이지만, 적중률 및 크기 조정 통계와 같은 메트릭은 전자 밀도 를 검사하는 데 대체되지 않으며, 이는 리간드가 바운드되어 있거나 반응이 발생했다는 유일한 확인을 제공할 수 있습니다. 에서 결정로. 빠른 피드백 데이터 처리 모듈을 로드하려면 모듈 유형이 빔라인 워크스테이션의 터미널에 i24-ssx를 로드합니다. 히트 발견 분석 유형 i24-ssx /path/to/visit/directory/를 단말으로 실행하려면 i24-ssx/dl/i24/data/2020/mx12345-6/참고: 이 세 개의 터미널 창을 열고, 데이터가 디스크에 기록되면, 고급 광원에 대한 회절 통합 (DIALS) 40,41(그림 6a)에서발견 결과를 찾는 그래픽 표현. 기본 설정은10th 이미지마다 점수가 매기이며 몇 초마다 새로 고쳐계산 부하를 최소화합니다. 위의 명령 끝에 인수를 추가하여 기본값을 변경합니다. 예를 들어, ‘i24-ssx/dls/i24/데이터/2020/mx12345-6 2’ i24-ssx는 다른 모든 이미지에서 적중 검색이 실행됩니다. 그러나 이렇게 하면 클러스터(공유 리소스)에 과도한 부담을 주고 처리 시간을 늦출 수 있습니다. 그래프는 인덱싱이 성공할 가능성에 따라 색상으로 코딩되며, 빨간색 표시는 최소 15개의 브래그 스팟이 발견되었으며(인덱싱의 가능성이 좋음), 파란색은 유용한 회절을 거의 또는 전혀 표시하지 않습니다. 스팟 파인더 인터페이스의 스팟을 클릭하여 DIALS 이미지 뷰어에 관심 있는 회절 이미지를 봅니다. 인덱싱 및 통합 피드백참고: 회절 데이터의 인덱싱 및 통합은 dials.still_process 함수 40,41을사용하여 DIALS로 수행됩니다. 따라서 결정(예상 결정 공간 그룹, 단위 셀 및 실험 형상)과 관련된 특정 정보를 .phil 텍스트 파일에 넣어야 합니다. 터미널에서 모듈 로드 다이얼을 입력하여 다이얼을 로드합니다. 데이터 집합 유형 dials.still_process/경로// / 이미지/ /pathto/phil-file.phil. monitor_stills_process.py 입력하여 stills_monitor 스크립트를 실행하여 데이터 집합을 모두 계속 처리한 진행 상황을 모니터링할 수 있습니다(모듈 로드 i24-ssx를 수행한 후 현재 방문으로 디렉터리 변경)(그림6b). 인덱싱된 회절 데이터의 단위 셀분포(그림 7a)는명령 ctbx.xfel.plot_uc_cloud_from_experiments/경로/투/다이얼/출력/*refined.expt combine_all_input=true를 사용하여 모니터링할 수 있으며, 이는이전에 설명한 바와 같이 단위 셀 다형성을 식별하고 해결하는 데 특히 유용하다. ‘Visualzie’의 경우, 어떻게, 이 분포는 명령 파이썬 pacman.py/방문/처리/_hit_finding/chip.out을사용하여 2D플롯(도 7b)을생성하여 고정 대상에 따라 다릅니다. 다이얼스 커맨드 dials.stereographic_projection hkl=0,0,1 expand_to_P 1 =true/path/to/dials/output/*refined.expt를사용하여 모든 인덱싱된 회절 데이터(그림7c)의스테레오그래픽 프로젝션을 생성합니다.참고: Bravais 격자의 대칭이 병합된 데이터가 완벽한 쌍둥이로 나타나는 공간 그룹 대칭보다 높은 결정에서 스틸 데이터를 처리할 때 일반적인 병리학입니다. 데이터 처리 알고리즘은 이 병리학을 해결하기 위해 진화했다 43,44,45,46 하지만 사용자는 자신의 데이터를 처리하는 동안이 점을 염두에 두어야한다.