Cryo Soft X-ray Tomografisi ile Hücrenin 3D Kartografik Açıklaması
Summary
Burada, kriyo yumuşak X-ışını tomografisinde (SXT) kriyo-korunmuş hücrelerin ultrayapısını 25 nm yarım perde çözünürlükte görüntülemek için gerekli numune hazırlama ve veri toplama adımlarını açıklayan bir protokol sunulmaktadır.
Abstract
Görüntüleme teknikleri, biyolojik araştırmalarda ve ilgili alanlarda hücre organizasyonunu ve makinelerini anlamak için temeldir. Bu teknikler arasında, kriyo yumuşak X-ışını tomografisi (SXT), karbon yapılarının sudan doğal olarak daha yüksek emilime sahip olduğu su penceresi X-ışını enerji aralığındaki (284-543 eV) tüm kriyo korunmuş hücrelerin görüntülenmesini sağlar ve her vokelde bulunan malzemenin doğrusal absorpsiyon katsayısının 3D rekonstrüksiyonuna izin verir. 10 μm kalınlığa kadar tüm hücreler seviyesindeki nicel yapısal bilgi, 25-30 nm yarım perdeye kadar yüksek verim ve uzamsal çözünürlük ile bu şekilde elde edilebilir. Cryo-SXT, hücresel enfeksiyon süreçleri (virüs, bakteri veya parazitler), hastalıklara bağlı morfolojik değişiklikler (resesif genetik hastalıklar gibi) hakkında 3D bilgi sağlayarak ve hücresel düzeyde ilaç etkisini anlamamıza yardımcı olarak veya 3D hücresel ortamdaki belirli yapıları konumlandırmamıza yardımcı olarak mevcut biyomedikal araştırmalarla ilgili olduğunu kanıtlamıştır. Ek olarak, senkrotron tesislerindeki ayarlanabilir dalga boyundan yararlanarak, spektro-mikroskopi veya 3D muadili spektro-tomografi, biyomineralizasyon işlemlerinde kalsiyum gibi hücredeki spesifik elementleri görüntülemek ve ölçmek için de kullanılabilir. Kriyo-SXT, elektron mikroskobu, X-ışını floresansı veya görünür ışık floresansı gibi diğer biyolojik görüntüleme tekniklerine tamamlayıcı bilgiler sağlar ve genellikle fonksiyon, konum ve morfolojiyi birbirine bağlamak için kriyojenik koşullarda 2D veya 3D korelasyon görüntüleme için ortak bir yöntem olarak kullanılır.
Introduction
Cryo-SXT, hidratlanmış bütün hücrelerin 1,2,3,4,5,6 hacimlerini 3D orta çözünürlüklü (25-30 nm yarım perde) sağladığı için biyolojik görüntüleme araştırmalarında merkezi bir rol oynayabilir. Su penceresi enerji aralığında, karbon ve oksijen absorpsiyonu K kenarları (4.4-2.3 nm) arasında, karbon bakımından zengin hücresel yapılar, onlara nüfuz eden ve onları çevreleyen oksijen bakımından zengin ortamdan 10 kat daha fazla emer. Bu enerji aralığında, 10 μm kalınlığa kadar vitrifiye hücreler, kesitleme veya boyama işlemine gerek kalmadan görüntülenebilir, bu da numune rotasyon yetenekleriyle birleştiğinde, hücresel yapının tomografik rekonstrüksiyonuna izin veren nicel yüksek absorpsiyon kontrast projeksiyonlarına yol açar. Cryo-SXT, numune boyutları ve uzamsal çözünürlük açısından başka herhangi bir görüntüleme tekniği tarafından kolayca erişilemeyen bir boşluğu doldurur.
Kısacası, kriyo-SXT’nin absorpsiyon kontrastı nicelikseldir, çünkü fotonların t kalınlığı örneği boyunca zayıflaması Beer-Lambert yasasına aşağıdaki gibi uyar: 
Burada I0, olay yoğunluğunu temsil eder ve μl λ dalga boyuna ve numunenin kırılma indisinin hayali kısmına bağlı olan doğrusal absorpsiyon katsayısı β (
). Zayıflama, biyokimyasal bileşimin ve görüntülenen yapıların kalınlığının bir fonksiyonudur ve her biyokimyasal bileşen, l’μ (LAC) belirli bir X-ışını doğrusal absorpsiyon katsayısına sahiptir. Bu, her tomografi voksel değerinin kimyasal elementlere ve bunların voksel7’deki konsantrasyonlarına bağlı olduğu anlamına gelir. Bu, çekirdekler, nükleoller, lipit cisimleri veya mitokondri gibi farklı organellerin doğal ayrımcılığına veya kromatinin farklı sıkıştırma durumlarına, yalnızca doğal LAC değerlerine dayanarak yeniden yapılandırılmasına izin verir 2,8,9.
Ek olarak, kriyo-SXT, tomogramların birkaç dakika içinde toplanmasıyla yüksek verimli bir tekniktir. Bu, özellikle bölünme, farklılaşma ve apoptoz gibi kilit zaman noktalarında, aynı zamanda spesifik ilaç tedavilerine veya patojenik enfeksiyonlara kimyasal maruziyetin neden olduğu gibi farklı yanıt durumlarında yakalanabilen hücre popülasyonlarının mezoölçekli görüntülenmesini sağlar. Bu kilit noktalarda toplanan veriler, bu belirli anlarda farklı hücresel organellerin mekansal organizasyonunun sadık bir kaydı ile sistemin 3D tanımını sunacaktır.
Genellikle, kriyo-SXT, 3D hücresel ortam 4,10,11,12,13,14,15,16 veya sert X-ışını floresan verileri 17,18 içinde belirli özelliklerin, olayların veya makromoleküllerin bulunmasına izin veren korelasyon yaklaşımlarını izleyen diğer tekniklerle birlikte kullanılır. . Kriyojenik koşullardaki korelasyon yaklaşımları, ilgilenilen sistemin en eksiksiz ve değerli resmini elde etmek için büyük önem taşımaktadır. Mistral (Alba) ve B24 (Diamond) kriyo-SXT ışın hatlarındaki tipik iş akışının kısa bir özeti Şekil 1’de çizilmiştir.
Ayrıca, senkrotron tesislerindeki dalga boyu ayarlama yeteneğinden yararlanarak, numunede bulunan belirli elemanların spesifik diferansiyel absorpsiyonu kullanılarak yapısal olana ek olarak spektroskopik bilgi elde edilebilir. Bunun bir örneği, 19,20,21 hücrelerindeki biyomineralizasyon işlemlerinin incelenmesinde kalsiyumun yeri olabilir. Farklı foton enerjilerinde (spektrumlar) veya tomogramlarda ve ilgilenilen x-ışını absorpsiyon kenarında 2D görüntüler çekerek, seçilen elemanı içeren pikseller veya vokseller tanımlanabilir. Spektrumlar ayrıca kimyasal durumların farklılaşmasına izin verir (yani, önceki biyomineralizasyon örneği20’de olduğu gibi amorf kalsiyumun hidroksiapatit’e evrimi). Farklı elemanların nicelleştirilmesi 2D ve 3D olarak mümkündür. Vitrifiye hücrelerin spektroskopik görüntülemesi tipik olarak su penceresinde yapılır, ancak su içeriği yeterince düşükse veya dehidrasyon da dahil olmak üzere diğer numune hazırlama protokolleri kullanılıyorsa diğer enerji aralıklarında da mümkündür22. Ayrıntılı bir spektroskopi adım adım protokolü, buradaki protokolün odağının ötesindedir.
Bundan sonra, protokol ana numune hazırlama adımlarını kısaca özetlemeye odaklanır, ancak her sistem bireysel iyileştirmeye ihtiyaç duyabilir, ardından kriyo yumuşak X-ışını tomografisi için ayrıntılı bir adım adım veri toplama prosedürü izler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Numune hazırlama, yüksek kaliteli yumuşak X-ışını tomogramları elde etmek için kritik bir adımdır, çünkü kaliteleri doğrudan numune vitrifikasyonunun kalitesine ve hücrenin gömülü olduğu buz tabakası kalınlığına bağlıdır. Yüksek sinyal-gürültü oranına sahip projeksiyonlar, ince buz tabakasına sahip bölgelerde toplanacak ve mümkün olan en yüksek çözünürlüğü elde etmek için gereken radyasyon dozunu en aza indirmeye izin verecektir. Ek olarak, hücre akıcılığı son tomogram kalitesini de etkileyecektir, çünkü komşu hücrelerin rotasyon sırasında FoV’ye girmesinden kaçınılmalıdır. Son olarak, Au fiducial işaretleyicilerin doğru dağılımı, projeksiyon hizalamasının doğruluğunu belirleyecek ve daha sonra nihai 3D yeniden yapılandırılmış hacmin kalitesini belirleyecektir. Au referanslarının ızgaraya düzgün bir şekilde yayılmasının, projeksiyon hizalama adımının otomatikleştirilmesini sağladığını ve bu olmadan böyle kritik bir adım için yüksek bir uzmanlığa ihtiyaç duyulduğunu unutmayın.
Buradaki protokol, kriyoelektron tomografisinde (kriyo-ET) kullanılanlarla benzerlikleri olan yalnızca bir olası numune hazırlama stratejisini göstermektedir. Her iki durumda da, daha iyi tekrarlanabilirlik için zorlu numune hazırlığını geliştiren protokoller, bu tekniklerin başarısı için temel olacaktır ve bu hedefe yönelik çabalar sarf edilmektedir29. İzole edilmiş hücrelerin görüntülenmesine ek olarak, bölümden geçen iletim sinyalinin yüksek eğim açılarında yeterli olması koşuluyla doku bölümlerinin de görselleştirilebileceğini belirtmekte fayda var. Tipik olarak, bu birkaç mikronluk bölümler anlamına gelir (10 μm’nin altında).
Bir hücrenin içindeki belirli bir yapıyı veya olayı görüntülemek için, bu özelliğin tilt serisinin FoV’sinde olduğundan emin olunması gerekir. Kriyo-SXT’deki FoV, lense bağlı olarak 10 x 10 μm 2 ila 15 x 15 μm 2 ile sınırlı olduğundan ve çözünürlüğün en az2 faktörüne kadar bir piksel aşırı örneklemesini hesaba kattığından, genellikle tam hücre uzantısından daha küçüktür (Şekil 5’te belirtilen kırmızı karelere bakın). Bu nedenle, yatırım getirisi bulunmalı ve uygun şekilde etiketlenmelidir. Bu genellikle floresan etiketler ve görünür ışık bağıntılı yaklaşımlar aracılığıyla yapılır. Epifloresanı birleştiren 2D stratejileri, yumuşak X-ışını iletim mikroskobunun entegre bir çevrimiçi görünür ışık floresan mikroskobuna sahip olması nedeniyle basittir, ancak yüksek çözünürlüklü 2D veya 3D floresan sinyali için diğer yaklaşımlar da mevcuttur 4,12,13,15,16 . Bu gibi durumlarda, ızgaranın önce süper çözünürlüklü mikroskoplar gibi belirli cihazlarda görüntülenmesi gerekir. En etkili korelasyon yaklaşımlarının, kriyojenik koşullarda veri toplamayı içerenler olduğunu unutmayın. Bunun nedeni, oda sıcaklığı (RT), görünür ışık floresan görüntüleme ve numune vitrifikasyonu arasındaki zaman atlamasının, örneğin, doğru hücresel olayın zamanında yakalanmasını engelleyeceğidir; Ek olarak, vitrifikasyon prosedürü, RT’de görüntülenen ilgili hücreyi ızgaradan ayırabilir. Çoğu korelasyonel görüntüleme yaklaşımı, numune ızgaralarının manipüle edilmesi ve bir cihazdan diğerine taşınması gerektiği anlamına gelse bile ve bunun ortaya çıkardığı ızgara kontaminasyonu veya hasar riskinin artmasına rağmen, ödül açıktır: hücresel manzara içindeki belirli olayları veya molekülleri belirleyebilmek.
Tüm hücre görüntülemesi gerektiğinde, uygulanan toplam dozun radyasyon hasarı sınırını aşmaması koşuluyla farklı tomogramların dikilmesi mümkündür. Genellikle, aynı hücrede birkaç tomogram toplamak için biriken doz, ulaşılabilir çözünürlükteki (109 Gy) sınırın çok altındadır ve bu nedenle, numune ve deneye bağlı olmasına rağmen, dozu düşürmek için spesifik bir strateji gerekmez. Spektro-tomografi gibi yoğun veri toplama durumunda, dozun en aza indirilmesi gerçekten gerekli olacaktır ve uygun veri toplama ve spesifik işleme stratejilerinin uygulanması gerekecektir.
Cryo-SXT’nin burada belirtilmesi gereken birkaç sınırlaması vardır. Birincisi, düz numune desteklerinin kullanılmasına özgü olan iyi bilinen eksik kamadır. 180 derecelik rotasyona izin veren kılcal numune destekleri geçmişte kullanılmış ve hala bazı tesislerde kullanılmaktadır, ancak cam emilimi ve süspansiyonda hücrelerin kullanılmasının kısıtlanması nedeniyle fakirleşmiş bir kontrast gibi dezavantajlar da sunmaktadırlar. Eksik kamanın etkisini azaltmanın bir yolu da dual tilt tomografi yapmaktır. Bu, günümüzde Mistral ışın hattında gerçekten mümkündür. İkinci sınırlama, bu tür mikroskoplarda kullanılan Fresnel bölgesi plaka lensi tarafından belirlenir. Bu lens, her ikisi de sıkı sıkıya ilişkili olan elde edilebilir nihai çözünürlüğü ve alan derinliğini (DoF) ayarlar. Bu, çözünürlüğün arttırılmasının DoF’u azaltacağı, hücrenin kalınlığının ise genellikle daha büyük olacağı anlamına gelir. Örneğin, 40 nm lens, teoride 3 μm’lik bir DoF’ye ve 24.4 nm yarım perdelik bir çözünürlüğe sahip olacaktır. Bu nedenle çözünürlük ve DoF arasındaki uzlaşma stratejiktir ve lensin seçimi30,31 hücresinin tipine bağlı olacaktır. Son olarak, dünya çapında operasyonel TXM’ler ideal mikroskoplar olmaktan uzaktır ve teorik beklentilere ulaşmak için optik sistemleri geliştirmek için çaba sarf edilmektedir. Son olarak, yeniden yapılandırılan hacimlerin görselleştirilmesi ve segmentasyonu, belirli yazılım araçları25,32,33,34 ile gerçekleştirilebilir.
Özetle, kriyo-SXT, görüntüleme hücrelerine kantitatif olarak orta çözünürlükte (25-30 nm yarım perde) ve istatistiksel sayılarda (günde birkaç on tomogram) izin verir. Bu, organellerin organizasyonunu, dağılımını ve boyutunu, örneğin patojen enfeksiyonu veya hastalıkları sırasında, kesin zaman noktalarında veya belirli tedavilerden sonra belirli koşullarda elde etmeyi sağlar. Bu nedenle, her biri belirli bir numune boyutu ve çözünürlüğü aralığını ele alan daha yaygın elektron ve görünür ışık mikroskopileri için yararlı bir tamamlayıcı biyolojik görüntüleme tekniğidir. Kriyo-SXT, görünür ışık floresansını içeren korelasyon yaklaşımlarında sıklıkla kullanılır, ancak diğer kriyo korelasyon stratejileri de mümkündür.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu proje, Marie Skłodowska-Curie hibe anlaşması No 75439 kapsamında Avrupa Komisyonu Horizon 2020 iNEXT-Discovery projesinden ve Avrupa Birliği’nin Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programından finansman almıştır.
Materials
| Amira | Thermo Fisher | Software for segmentation | |
| Au Holey Carbon Films finder grids | (Quantifoil Micro Tools Gmb | R 2/2 Au G200F1 | Au Holey Carbon Films finder grids |
| Au nanoparticles | BBI Group, Cardiff, UK | Au nanoparticles 100nm | 100 nm Au nanoparticles (NPs) at Mistral (Alba) |
| Au nanoparticles | BBI Group, Cardiff, UK | Au nanoparticles 250nm | 250 nm Au nanoparticles (NPs) at B24 (Diamond) |
| Axio Scope A1 | Zeiss | 430035 9060 | Fluorescence microscope |
| Blotting No.1 filter paper | Whatman | WHA10010155 | Blotting filter |
| Bsoft | Software for projection alignment, reconstruction and visualization (Heymann et al., 2008) | ||
| Chimera | Software for segmentation (Pettersen et al. 2004) | ||
| Cryo-EM Glow Discharge Set | PELCO easiGlow | 91000S | Glow Discharge Cleaning System |
| Cu Holey Carbon Films finder grids | (Quantifoil Micro Tools Gmb | R 2/2Cu G200F1 | Cu Holey Carbon Films finder grids |
| Fetal calf serum | Sigma | F9665 | Heat Inactivated, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| ImageJ | Software for image processing and analysis in Java (NIH & LOCI University of Wisconsin) | ||
| IMOD | Software for projection alignment, reconstruction and visualization (Kremer et al., 1996) | ||
| Leica EM GP Grid Plunger | Leica | 16706401 | Automatic Plunge Freezer EM |
| LINKAM cryo-stage | Linkam Scientific Instruments | CMS 196 | Cryo-Correlative Microscopy Stage |
| MIB | Software for segmentation (Belevich et al. 2016) | ||
| P100 Petri dish | Sigma | P6106 | Treated for cell culture and sterile |
| P60 Petri dish | Sigma | D8054 | Treated for cell culture and sterile |
| Polylysin | Sigma | P4707 | Poly-L-lysine solution 0.01%, sterile-filtered |
| Soft X-Ray microscope 0.25-1.2keV | Xradia | NCT-SB | Transmission soft X-Ray microscope |
| SURVOS | Software for segmentation (Luengo et al. 2017) | ||
| Tomo3d | Software for reconstruction (SIRT, WBP) (Agulleiro et al. 2011) | ||
| TomoJ | Software for reconstruction (ART) (Messaoudi et al., 2007) | ||
| XM Data Explorer | Zeiss | TXM software |
References
- Carrascosa, J. L., et al. Cryo X-ray tomography of vaccinia virus membranes and inner compartments. Journal of Structural Biology. 168, 234-239 (2009).
- Uchida, M., et al. Soft X-ray tomography of phenotypic switching and the cellular response to antifungal peptoids in Candida albicans. PNAS. 106, 19375-19380 (2009).
- Schneider, G., et al. Three-dimensional cellular ultrastructure resolved by X-ray microscopy. Nature Methods. 10, 1-3 (2010).
- Chichón, F. J., et al. Cryo nano-tomography of vaccinia virus infected cells. Journal of Structural Biology. 177, 202-211 (2012).
- Groen, J., Conesa, J. J., Valcárcel, R., Pereiro, E. The cellular landscape by soft X-ray tomography. Biophysical Reviews. 11, 611-619 (2019).
- Kepsutlu, B., et al. Cells undergo major changes in the quantity of cytoplasmic organelles after uptake of gold nanoparticles with biologically relevant surface coatings. ACS Nano. 14, 2248-2264 (2020).
- Natterer, F. . The mathematics of computerized tomography. , (1986).
- Weiss, D., et al. Computed tomography of cryogenic biological specimens based on X-ray microscopic images. Ultramicroscopy. 84, 185-197 (2000).
- Clowney, E. J., et al. Nuclear aggregation of olfactory receptor genes governs their monogenic expression. Cell. 151, 724-737 (2012).
- Duke, E. M. H., et al. Imaging endosomes and autophagosomes in whole mammalian cells using correlative cryo-fluorescence and cryo-soft X-ray microscopy (cryo-CLXM). Ultramicroscopy. 143, 77-87 (2014).
- Cinquin, B., et al. Putting molecules in their place. Journal of Cellular Biochemistry. 115, 209-216 (2014).
- Hagen, C., et al. Multimodal nanoparticles as alignment and correlation markers in fluorescence/soft X-ray cryo-microscopy/tomography of nucleoplasmic reticulum and apoptosis in mammalian cells. Ultramicroscopy. 146, 46-54 (2014).
- Pérez-Berná, A. J., et al. Structural changes in cells images by soft X-ray cryo-tomography during Hepatitis C virus infection. ACS Nano. 10, 6597-6611 (2016).
- Chiappi, M., et al. Cryo-soft X-ray tomography as a quantitative three-dimensional tool to model nanoparticle:cell interaction. Journal of Nanobiotechnology. 14, 15 (2016).
- Varsano, N., et al. Development of correlative cryo-soft X-ray tomography and stochastic reconstruction microscopy. A study of cholesterol crystal early formation in cells. Journal of the American Chemical Society. 138, 14931-14940 (2016).
- Kounatidis, I., et al. Correlative cryo-structured illumination fluorescence microscopy and soft X-ray tomography elucidates reovirus intracellular release pathway. Cell. 182, 1-16 (2020).
- Kapishnikov, S., et al. Mode of action of quinoline antimalarial drugs in red blood cells infected by Plasmodium falciparum revealed in vivo. PNAS. 116 (46), 22946-22952 (2019).
- Conesa, J. J., et al. Unambiguous intracellular localization and quantification of a potent iridium anticancer compound by correlative 3D cryo X-ray imaging. Angewandte Chemie International Edition. 59, 1270-1278 (2020).
- Gal, A., et al. Native-state imaging of calcifying and noncalcifying microalgae reveals similarities in their calcium storage organelles. PNAS. 115 (43), 11000-11005 (2018).
- Procopio, A., et al. Chemical fingerprint of Zn-hydroxyapatite in the early stages of osteogenic differentiation. ACS Central Science. 5, 1449-1460 (2019).
- Kahil, K., et al. Cellular pathways of calcium transport and concentration toward mineral formation in sea urchin larvae. PNAS. 117 (49), 30957-30965 (2020).
- Conesa, J. J., et al. Intracellular nanoparticles mass quantification by near-edge absorption soft X-ray nanotomography. Scientific Reports. 6, 22354 (2016).
- Otón, J., Sorzano, C. O. S., Maribini, R., Pereiro, E., Carazo, J. M. Measurement of the modulation transfer function of an X-ray microscope based on multiple Fourier orders analysis of a Siemens star. Optics Express. 23 (8), 9567-9572 (2015).
- Otón, J., et al. Characterization of transfer function, resolution and depth of field of a soft X-ray microscope applied to tomography enhancement by Wiener deconvolution. Biomedical Optics Express. 7, 5092-5103 (2016).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).
- Heymann, J. B., Cardone, G., Winkler, D. C., Steven, A. C. Computational resources for cryo-electron tomography in Bsoft. Journal of Structural Biology. 161, 232-242 (2008).
- Messaoudi, C., et al. Three-dimensional chemical mapping by EFTEM-TomoJ including improvement of SNR by PCA and ART reconstruction of volume by noise supression. Microscopy Microanalysis. 19, 1669-1677 (2013).
- Agulleiro, J. I., Fernández, J. J. Fast tomographic reconstruction on multicore computers. Bioinformatics. 27, 582-583 (2011).
- Toro-Nahuelpan, M., et al. Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies. Nature Methods. 17, 50-54 (2020).
- Attwood, D. . Soft X-rays and Extreme Ultraviolet Radiation. Principles and Applications. , (2000).
- Howells, M., Jacobsen, C., Warwick, T. . Principles and Applications of Zone Plate X-ray. Microscopes. Science of Microscopy. , (2007).
- Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera–a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25, 1605-1612 (2004).
- Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy image browser: a platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets. PLOS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).
- Luengo, I., et al. SuRVoS: Super-region volume segmentation workbench. Journal of Structural Biology. 198, 43-53 (2017).
