여기서, 25 nm 하프 피치의 해상도로 전체 냉동 보존된 세포의 초구조를 이미지화하기 위해 냉동 소프트 X선 단층촬영(SXT)에 필요한 샘플 준비 및 데이터 수집 단계를 기술하는 프로토콜이 제시된다.
이미징 기술은 생물학적 연구 및 관련 분야에서 세포 조직 및 기계를 이해하기 위해 기본입니다. 이러한 기술 중에서 냉동 소프트 X 선 단층 촬영 (SXT)은 탄소 구조가 본질적으로 물보다 높은 흡수력을 갖는 물 창 X 선 에너지 범위 (284-543 eV)에서 전체 냉동 보존 세포를 이미징 할 수있게하여 각 복셀에 포함 된 재료의 선형 흡수 계수를 3D 재구성 할 수 있습니다. 최대 10 μm 두께의 전체 세포 수준에서 정량적 구조 정보는 25-30 nm 하프 피치까지 높은 처리량과 공간 분해능으로 이러한 방식으로 달성 할 수 있습니다. Cryo-SXT는 세포 감염 과정 (바이러스, 박테리아 또는 기생충), 질병 (예 : 열성 유전 질환)으로 인한 형태 학적 변화에 대한 3D 정보를 제공하고 세포 수준에서 약물 작용을 이해하거나 3D 세포 환경에서 특정 구조를 찾는 데 도움이되는 현재의 생물 의학 연구와 관련이 있음이 입증되었습니다. 또한, 싱크로트론 시설에서의 파장 조정 가능한 파장을 이용함으로써, 분광-현미경 또는 그의 3D 대응물, 분광-단층 촬영, 또한 생체 미네랄화 공정에서 칼슘과 같은 세포 내의 특정 원소를 이미지화하고 정량화하는 데 사용될 수 있다. Cryo-SXT는 전자 현미경, X선 형광 또는 가시광선 형광과 같은 다른 생물학적 이미징 기술에 상보적인 정보를 제공하며, 일반적으로 기능, 위치 및 형태를 연결하기 위해 극저온 조건에서 2D 또는 3D 상관 영상화를 위한 파트너 방법으로 사용됩니다.
Cryo-SXT는 수화된 전체 세포 1,2,3,4,5,6의 3D 배지 분해능(25-30nm 하프 피치) 부피를 제공하기 때문에 생물학적 이미징 연구에서 중심적인 역할을 할 수 있습니다. 물 창 에너지 범위에서, 탄소와 산소 흡수 K 가장자리 (4.4-2.3 nm) 사이에서, 탄소가 풍부한 세포 구조는 그들을 투과하고 둘러싸고있는 산소가 풍부한 매질보다 10 배 더 많이 흡수합니다. 이 에너지 범위에서 최대 10 μm 두께의 유리화 된 세포는 절편이나 염색 없이도 이미징 할 수 있으므로 정량적 인 고 흡수 대비 돌출부가 생겨 샘플 회전 기능과 결합하여 세포 구조의 단층 촬영 재구성을 허용합니다. Cryo-SXT는 다른 이미징 기술로는 쉽게 접근 할 수없는 시편 치수 및 공간 해상도 측면에서 틈새 시장을 채 웁니다.
간단히 말해서, cryo-SXT의 흡수 콘트라스트는 두께 t의 표본을 통한 광자의 감쇠가 다음과 같이 Beer-Lambert 법칙을 따르기 때문에 정량적이다: 여기서 I0은 입사 강도를 나타내고 μl은 시편의 굴절률의 파장 λ 및 허수 부분 β에 의존하는 선형 흡수 계수를 나타낸다( ). 감쇠는 이미지화되는 구조물의 생화학적 조성 및 두께의 함수이며, 각 생화학적 성분은 특정 X선 선형 흡수 계수 μl(LAC)을 갖는다. 이것은 각 단층 촬영 복셀 값이 화학 원소와 복셀7에서의 농도에 달려 있음을 의미합니다. 이것은 핵, 핵, 지질 몸체 또는 미토콘드리아와 같은 다른 소기관의 자연적 차별을 허용하거나, 단지 그들의 고유 한 LAC 값 재구성 2,8,9에 기초한 염색질의 다른 압축 상태를 허용합니다.
또한 cryo-SXT는 단층 촬영이 몇 분 안에 수집되는 높은 처리량 기술입니다. 이것은 특히 분열, 분화 및 아폽토시스와 같은 주요 시점에서뿐만 아니라 특정 약물 요법 또는 병원성 감염에 대한 화학적 노출에 의해 유도 된 것과 같은 다른 반응 상태에서도 포획 될 수있는 세포 집단의 메조 스케일 이미징을 가능하게합니다. 이러한 핵심 지점에서 수집 된 데이터는 특정 순간에 다른 세포 소기관의 공간 조직에 대한 충실한 기록과 함께 시스템의 3D 설명을 제공합니다.
보통, cryo-SXT는 3D 세포 환경 4,10,11,12,13,14,15,16, 또는 경질 X선 형광 데이터(17,18) 내에서 특정 특징, 사건 또는 거대분자를 위치시킬 수 있도록 하는 상관학적 접근법에 따르는 다른 기술들과 함께 사용된다. . 극저온 조건에서의 상관 관계 접근법은 관심 시스템에 대한 가장 완전하고 가치있는 그림을 얻기 위해 가장 중요합니다. Mistral (Alba) 및 B24 (다이아몬드) cryo-SXT 빔라인의 일반적인 워크플로우에 대한 간략한 요약이 그림 1에 스케치되어 있습니다.
더욱이, 싱크로트론 시설에서의 파장 튜닝 능력을 이용하여, 분광학적 정보는 샘플에 포함된 특정 원소의 특정 차등 흡수를 사용하는 구조적인 것 이외에 얻어질 수 있다. 이것의 예는 세포19,20,21에서 생물 미네랄화 과정에 대한 연구에서 칼슘의 위치입니다. 아래의 다른 광자 에너지(spectra) 또는 토모그램에서 그리고 관심 있는 x-레이 흡수 가장자리에서 2D 이미지를 촬영함으로써, 선택된 요소를 포함하는 픽셀 또는 복셀이 식별될 수 있다. 스펙트럼은 또한 화학적 상태를 분화시키는 것을 허용한다(즉, 이전의 생물광물화 실시예20에서와 같이 비정질 칼슘이 하이드록시아파타이트로 진화됨). 서로 다른 요소의 정량화는 2D 및 3D에서 가능합니다. 유리화된 세포의 분광학적 이미징은 전형적으로 물 윈도우에서 행해지지만, 수분 함량이 충분히 낮거나 탈수를 포함한 다른 샘플 준비 프로토콜이 사용되는 경우 다른 에너지 범위에서도 가능하다(22). 상세한 분광법 단계별 프로토콜은 본 명세서에서 프로토콜의 초점을 벗어난다.
다음 내용에서 프로토콜은 주요 샘플 준비 단계를 간략하게 요약하는 데 중점을 두지만 각 시스템은 개별 개선이 필요할 수 있지만 냉동 소프트 X 선 단층 촬영을위한 자세한 단계별 데이터 수집 절차가 뒤 따릅니다.
샘플 준비는 고품질의 부드러운 X 선 단층 촬영을 얻는 중요한 단계이며, 그 품질은 샘플 유리화의 품질과 세포가 내장되어있는 얼음층 두께에 직접적으로 달려 있습니다. 신호 대 잡음비가 높은 프로젝션은 얼음층이 얇은 지역에서 수집되어 가능한 가장 높은 분해능을 달성하는 데 필요한 방사선 선량을 최소화할 수 있습니다. 또한, 셀 컨플루언시는 또한 최종 토모그램 품질에 영향을 미치는데, 이는 회전 시 이웃 셀이 FoV에 들어가는 것을 피해야 하기 때문이다. 마지막으로, Au 신탁 마커의 올바른 분산은 프로젝션 정렬의 정확도를 결정한 다음 궁극적으로 최종 3D 재구성 볼륨의 품질을 결정합니다. 그리드에 Au 신탁을 적절히 분산하면 프로젝션 정렬 단계의 자동화가 가능하며, 이 단계가 없으면 이러한 중요한 단계에 대한 높은 전문 지식이 필요합니다.
본 명세서의 프로토콜은 단지 하나의 가능한 샘플 준비 전략을 묘사하며, 이는 냉동 전자 단층 촬영 (cryo-ET)에 사용되는 것들과 유사성을 갖는다. 두 경우 모두, 더 나은 재현성을 위해 까다로운 샘플 준비를 개선하는 프로토콜이 이러한 기술의 성공을 위한 기본이 될 것이며, 이러한 목표(29)를 향한 노력이 이루어지고 있다. 격리된 세포를 영상화하는 것 외에도, 조직을 통한 전달 신호가 높은 기울기 각도에서 충분할 것이라는 점을 제공하면 조직의 절편도 시각화될 수 있다는 것을 언급할 가치가 있다. 일반적으로 이것은 몇 미크론 (10 μm 미만)의 섹션을 의미합니다.
셀 내부의 특정 구조나 이벤트를 이미지화하려면 이 특정 기능이 틸트 시리즈의 FoV 내부에 있는지 확인해야 합니다. cryo-SXT에서 FoV는 렌즈에 따라 10 x 10 μm2 내지 15 x 15μm2로 제한되고 분해능의 픽셀 오버샘플링을 적어도 2배로 차지하므로, 종종 전체 셀 확장보다 작다(도 5에 표시된 적색 사각형 참조). 따라서 ROI를 찾고 적절하게 표시해야합니다. 이것은 일반적으로 형광 태그와 가시 광선 상관 관계 접근법을 통해 수행됩니다. 소프트 X선 투과 현미경이 통합된 온라인 가시광선 형광 현미경을 가지고 있기 때문에 에피형광을 결합하는 2D 전략은 간단하지만, 고분해능 2D 또는 3D 형광 신호에 대한 다른 접근법도 사용할 수 있습니다 4,12,13,15,16 . 이러한 경우 그리드를 초해상도 현미경과 같은 특정 장비에서 먼저 이미징해야 합니다. 가장 효율적인 상관 관계 접근법은 극저온 조건에서 데이터 수집과 관련된 접근법입니다. 이는 실온 (RT), 가시광선 형광 이미징, 및 샘플 유리화 사이의 시간 경과가 예를 들어, 시간에 맞는 세포 이벤트를 포착하는 것을 방해하기 때문이다; 또한, 유리화 절차는 RT에서 이미지화된 관심 셀을 그리드로부터 분리할 수 있다. 대부분의 상관 관계 이미징 접근법이 샘플 그리드를 조작하고 한 장비에서 다른 장비로 운반해야한다는 것을 암시 할 수 있으며, 그리드 오염 또는 손상의 위험이 증가하더라도 세포 환경 내에서 특정 사건이나 분자를 정확히 지적 할 수 있다는 보상은 분명합니다.
전체 세포 영상화가 요구될 때, 적용된 총 선량이 방사선 손상 한계를 초과하지 않는 한 상이한 단층촬영을 바느질할 수 있다. 보통, 동일한 세포 상에서 몇 개의 단층체를 수집하기 위한 기탁된 투여량은 달성 가능한 해상도(10,9 Gy)에서 한계보다 훨씬 낮으며, 따라서, 투여량을 낮추기 위해 특별한 전략이 요구되지 않지만, 이것은 샘플- 및 실험-의존적이다. 분광 단층 촬영과 같은 집중적 인 데이터 수집의 경우 실제로 복용량을 최소화해야하며 편리한 데이터 수집 및 특정 처리 전략을 적용해야합니다.
Cryo-SXT에는 몇 가지 제한 사항이 있으며 여기에서 언급해야합니다. 첫 번째는 잘 알려진 누락 된 쐐기로, 평평한 샘플 지지대를 사용하는 데 필수적입니다. 180도 회전을 허용하는 모세관 샘플 지지대는 과거에 사용되어 왔으며 일부 시설에서도 여전히 사용되었지만 유리 흡수 및 현탁액에서 세포 사용 제한으로 인한 빈곤 한 대비와 같은 단점도 있습니다. 누락 된 쐐기의 효과를 줄이는 방법은 이중 틸트 단층 촬영을 수행하는 것입니다. 이것은 실제로 요즘 미스트랄 빔 라인에서 가능합니다. 두 번째 한계는 이러한 현미경에 사용되는 프레넬 존 플레이트 렌즈에 의해 설정된다. 이 렌즈는 달성 가능한 최고의 해상도와 피사계 심도(DoF)를 설정하며, 둘 다 밀접하게 관련되어 있습니다. 이것은 해상도를 높이면 DoF가 감소하는 반면 셀의 두께는 종종 더 커질 것임을 의미합니다. 예를 들어, 40nm 렌즈는 이론적으로 3μm의 DoF와 24.4nm 하프 피치의 분해능을 가질 것이다. 따라서 해상도와 DoF 사이의 절충안은 전략적이며 렌즈의 선택은 셀30,31의 유형에 따라 달라집니다. 마지막으로, 전 세계적으로 작동하는 TXM은 이상적인 현미경과는 거리가 멀고 이론적 인 기대에 도달하기 위해 광학 시스템을 개선하기위한 노력이 이루어지고 있습니다. 마지막으로, 재구성된 볼륨의 시각화 및 세분화는 특정 소프트웨어 도구(25,32,33,34)로 수행될 수 있다.
요약하면, cryo-SXT는 중간 분해능 (25-30 nm 하프 피치) 및 통계적 수치 (하루에 수십 개의 토모그램)에서 세포를 정량적으로 이미징 할 수 있습니다. 이를 통해 특정 조건, 예를 들어 병원균 감염 또는 질병 중, 정확한 시점 또는 특정 치료 후 소기관의 조직, 분포 및 치수를 얻을 수 있습니다. 따라서, 이는 보다 일반적인 전자 및 가시광선 현미경에 유용한 상보적인 생물학적 이미징 기술이며, 이들 각각은 샘플 치수 및 분해능의 특정 범위를 다루어준다. Cryo-SXT는 가시광선 형광을 포함하는 상관관계 접근법에 자주 사용되지만, 다른 cryo 상관관계 전략도 가능하다.
The authors have nothing to disclose.
이 프로젝트는 Marie Skłodowska-Curie 보조금 계약 No 75439에 따라 유럽 집행위원회 호라이즌 2020 iNEXT-Discovery 프로젝트와 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램으로부터 자금을 지원받았습니다.
Amira | Thermo Fisher | Software for segmentation | |
Au Holey Carbon Films finder grids | (Quantifoil Micro Tools Gmb | R 2/2 Au G200F1 | Au Holey Carbon Films finder grids |
Au nanoparticles | BBI Group, Cardiff, UK | Au nanoparticles 100nm | 100 nm Au nanoparticles (NPs) at Mistral (Alba) |
Au nanoparticles | BBI Group, Cardiff, UK | Au nanoparticles 250nm | 250 nm Au nanoparticles (NPs) at B24 (Diamond) |
Axio Scope A1 | Zeiss | 430035 9060 | Fluorescence microscope |
Blotting No.1 filter paper | Whatman | WHA10010155 | Blotting filter |
Bsoft | Software for projection alignment, reconstruction and visualization (Heymann et al., 2008) | ||
Chimera | Software for segmentation (Pettersen et al. 2004) | ||
Cryo-EM Glow Discharge Set | PELCO easiGlow | 91000S | Glow Discharge Cleaning System |
Cu Holey Carbon Films finder grids | (Quantifoil Micro Tools Gmb | R 2/2Cu G200F1 | Cu Holey Carbon Films finder grids |
Fetal calf serum | Sigma | F9665 | Heat Inactivated, sterile-filtered, suitable for cell culture |
ImageJ | Software for image processing and analysis in Java (NIH & LOCI University of Wisconsin) | ||
IMOD | Software for projection alignment, reconstruction and visualization (Kremer et al., 1996) | ||
Leica EM GP Grid Plunger | Leica | 16706401 | Automatic Plunge Freezer EM |
LINKAM cryo-stage | Linkam Scientific Instruments | CMS 196 | Cryo-Correlative Microscopy Stage |
MIB | Software for segmentation (Belevich et al. 2016) | ||
P100 Petri dish | Sigma | P6106 | Treated for cell culture and sterile |
P60 Petri dish | Sigma | D8054 | Treated for cell culture and sterile |
Polylysin | Sigma | P4707 | Poly-L-lysine solution 0.01%, sterile-filtered |
Soft X-Ray microscope 0.25-1.2keV | Xradia | NCT-SB | Transmission soft X-Ray microscope |
SURVOS | Software for segmentation (Luengo et al. 2017) | ||
Tomo3d | Software for reconstruction (SIRT, WBP) (Agulleiro et al. 2011) | ||
TomoJ | Software for reconstruction (ART) (Messaoudi et al., 2007) | ||
XM Data Explorer | Zeiss | TXM software |