クライオ軟X線断層撮影による細胞の3D地図作成記述

1. サンプル調製 グリッド・サポートの準備 滅菌のために炭素膜を上に向けてグリッドにUVを3時間照射する。 オプション: セルがグリッドにアタッチされないという問題がある場合は、以下のいずれかのステップを使用します。 グリッドのプラズマ処理によって炭素支持箔を親水化して、サンプルの拡散と細胞接着を改善します。 グロー放電室装置内にカーボン側のグリッドを上にして配置し、装置に応じてグリッドをプラズマに30秒~15分間(ArまたはO2を使用)さらします。 ポリ-L-リジン(PLL)でグリッドを機能化する ペトリ皿に60 μL PLLの個々の滴を加え、炭素膜を下に向けてPLL滴の上にグリッドを置きます。37°Cで30分間インキュベートし、ろ紙を用いてPLLをブロットした。 グリッドをウシ胎児血清(FBS)で機能化します。 グリッドを一晩FBSに沈めます。グリッドを緩衝液に浸して洗浄し、グリッドをろ紙に残して余分な液体を除去します。 グリッド上の付着細胞の成長 100mmの細胞培養皿中で細胞を増殖させ、80%〜90%のコンフルエントに達する(図2A)。 P60ペトリ皿(合計3mL)のAuグリッドの上に1-5 x 105セル/ mL(システムに合わせて値を調整)をシードします。手記： 細胞懸濁液の添加は、60mmの細胞培養皿においてグリッドの炭素膜が上を向いて非常に慎重に行われなければならない。条件ごとに複数のグリッドを用意し、P60ペトリ皿ごとに1つの条件を準備します(図2B)。 グリッド上のコンフルエンシーが各メッシュ正方形の複数のセル (セル サイズに応じて 1 ~ 10) に達するまでセルが沈降するのを待ちます (セル ラインによっては、これには最大 24 時間かかることがあります)。手記： 凍結する前に、グリッドを可視光顕微鏡(VLM)でチェックし、各グリッドの炭素膜の完全性とセルコンフルエンシーを評価する必要があります(図2C)。グリッド上の適切なセル密度に達するまで待ちます。グリッドが合流しすぎたり、カーボンホイルが壊れている場合は、最初からやり直してください。 グリッド上の懸濁液中の細胞の沈着 プランジ冷凍庫からピンセットを使用して、準備したAuまたはCuグリッドを選択します(セクション1.6を参照)。 1〜5 x105 細胞懸濁液(細菌の場合の光学密度吸光度0.3)を調製し、調製した懸濁液を4 μLをグリッドに加える。 細胞の堆積を可能にするために、滴と共にグリッドを水平に数分間インキュベートし、次いで、適切な温度および湿度条件に設定した気候制御ガラス化保存チャンバ内にグリッドを保持するピンセットを置く(ステップ1.6.1)。 オプション:サンプルの蛍光タグ付け手記： 試料の一部の細胞小器官を蛍光標識することは有益であり得る。目的に応じて、蛍光タンパク質を安定に発現する特定の蛍光団または細胞、または目的のタンパク質の一過性発現のためにトランスフェクトされた細胞が使用できる。これにより、クライオエピ蛍光顕微鏡を使用して細胞を簡単に検出でき、その後のX線イメージングで目的の細胞を見つけるのに役立ちます。以下では、このプロトコルは蛍光色素の使用についてのみ詳述しています。 蛍光色素分子用の有効なソリューションを準備し(メーカーの推奨を参照)、特定のプロトコルに従います。 グリッドを含むペトリ皿に蛍光色素を加え、穏やかに混ぜる。 暗い環境でインキュベートし、インキュベーションが終了したらステップ1.6に直接進みます。注:インキュベーションが終了したら、非特異的なタグ付けとその結果の蛍光シグナルのぼやけを避けるために、ガラス化する準備ができていることが重要です。 断層図投影アライメントのためのAuナノ粒子(NP)調製 Au基準原液1mL(ミストラルで100nmまたはB24で250nm)の1つのアリコートを取り、NPをペレット化できるように低速で(凝集を避けるために)1分間遠心分離する。手記： 可能であれば、凝集を避けるために、受託者を一晩以上自然に沈降させることが好ましい。 上清を取り除きます。凍結の直前に、NPsを20μLの無血清培地または緩衝液に再懸濁して、均一な溶液を得る。手記： 超音波処理とボルテックスは、溶液を均質化するために推奨されます。 プランジ凍結グリッド警告: 液体窒素は冷やけの原因となる可能性があるため、適切な保護具(長い白衣、安全ゴーグル、手袋、長ズボン、閉じた靴)を着用する必要があります。エタンは非常に爆発性があり、火花や直火から遠ざけてください。 製造元の指示に従って、プランジ冷凍装置を準備して使用します。手記： 湿度は通常80%〜90%に設定されています。温度は細胞種に依存する(酵母は最大30°C、哺乳動物細胞は37°C、昆虫細胞は28°Cなど)。 リムのそばのペトリ皿から取り付けピンセットでグリッドを取り、グリッドを曲げないように細心の注意を払ってプランジ冷凍装置に取り付けます。セルが吸い取り紙から離れていることを確認します。 オプション:付着細胞の場合はグリッドをバッファーで3回洗浄する。 細胞の上部(チャンバーの右側の穴を通して)に1.5μLのAu NPフィデューシャルを加え、30秒間沈降させてから、グリッドを吸い取って急降下させる。手記： 懸濁液中の細胞の場合、ピンセットを取り付ける前に、水平位置に留まっている間にAu NP基準をグリッドに追加し、30秒間静止させます。ブロッティングは、高品質のグリッドにとって非常に重要です。ブロッティング距離は、開始する前に較正する必要があります。吸い取り紙の平坦性は、再現可能な吸い取りのために重要です(メーカーの指示に従ってください)。ブロッティング時間は、細胞タイプごとに評価する必要があります。 条件ごとに複数のグリッドを用意します。グリッドを転送し、ガラス化を維持するために極低温で保管します。 クライオ可視光顕微鏡によるグリッドのスクリーニング 液体窒素下のグリッドをクライオボックスから、予冷却されたクライオステージ内の標準クライオカセット(3 mm TEMグリッドの場合は3つの位置)に移します(メーカーの指示を参照)。 クライオカセットはクライオステージブリッジ上に置かれ、クライオステージは広視野落射蛍光光学顕微鏡に取り付けられます。 クライオSXTイメージングに適した細胞を見つけ、グリッドの品質(厚い氷の存在、炭素支持膜の完全性、蛍光シグナルの存在など)を評価するために、長い作動距離対物レンズ(10x、50x、100x)を使用して-196.5°Cでグリッドを画像化します。 明視野または蛍光イメージングを使用して、目的の細胞を局在化します。注:この段階で、顕微鏡にリンクカメラがある場合は、画像をキャプチャします。画像の相関に使用します。 スクリーニング後、グリッドを液体窒素貯蔵デュワー内のクライオボックスに戻します。手記：適切なサンプルが見つからない場合は、サンプル調製手順を繰り返して、パラメーターのいずれかを変更します。通常、変更が必要なパラメータは、メッシュ正方形あたりのセルが多すぎる場合の氷の厚すぎる場合や合流度の場合のブロッティング時間です。 2. 透過X線顕微鏡(TXM)への装填 移送チャンバを液体窒素で<100 Kになるまで冷却し、ワークステーションを冷却し(図3A)、ワークステーションリムのヒーターをオンにします。沸騰が止まるまで待ちます。 グリッドを含む必要なクライオボックスをワークステーション内の対応する場所に置きます(図3A)。クライオ条件下でそれらを安全に転送するように注意してください。 選択したグリッドを、以前に冷却したサンプルホルダーにロードします(図3B)。ホルダーをシャトルに積み込み、カバーで保護します(図3C)。 シャトルを<100 Kで移送チャンバにロードし、低真空にポンプで送り込みます(図3D)。 搬送チャンバをTXMに取り付け(図4A)、スクリーン上の真空手順に従って搬送チャンバからTXMにシャトルをロードします(図4B)。 シャトルがサンプルとともに内部に入ると、TXMロボットアームは一度に1つのサンプルホルダーをサンプルステージに持ち込むことができます(図4C)。 3. TXMソフトウェアを使用したイメージング 注:サンプルステージのグリッドは、X線でイメージングされる前に、まずオンライン可視光顕微鏡(VLM)を使用してグリッドをマッピングし、明視野および/または蛍光モードでグリッドをマッピングします。左上パネルの「モーションコントロール」タブに対応するジョイスティックアイコンを使用して、 モーションコントロール を開きます。 オンラインVLMによるグリッドのイメージング 明視野モザイク取得 VLMカメラ(拡大レンズ>VLM)を選択し、VLM LEDソースをオンにして明視野イメージングを行います(顕微鏡>取得>取得設定>ソース設定、送信を選択します)。 VLM対物レンズ(モーションコントロール>サンプル>サンプルθ)に対向するようにサンプルを-60度に回転させ、サンプルを予想される中心位置に移動します(モーションコントロール>サンプル、サンプルX、サンプルYを変更します)。 グリッドにほぼ焦点を合わせるために、最初に20~50μmのステップで画像を取得しながら(顕微鏡 > 取得 > 取得設定 > 取得モード > 連続 > 開始; モーションコントロール > サンプル と変更 サンプルZ)。 細胞および/またはカーボン支持フィルムの穴に焦点が合うまで、5μmまでの小さなステップで焦点を絞り込みます(顕微鏡>取得>取得設定>取得モード>連続>開始;モーションコントロール>サンプルとサンプルZの変更)を行い、明視野モードでグリッドの完全なモザイクマップの取得を開始します。モザイクのデフォルト値を使用します。(顕微鏡>の集録>取得設定>モザイク>開始>取得モード)。手記： モザイク マップは、単一の画像から作成されます。画像の数 (列の数、行数、および X と Y のステップ サイズ) を設定して、グリッド全体を視覚化する必要があります。ステップサイズは、視野(FoV)のサイズに依存する。ここではデフォルト値が使用されます。グリッドが完全なモザイクFoVに対してX-Y平面の中央に正しくない場合は、集録を停止し、サンプルのX座標とY座標を修正して集録を繰り返します。 蛍光モードモザイク取得 明視野イメージング用のVLM主導の光源(顕微鏡 > 取得 > 取得設定 > 光源設定 、 および送信の選択解除)をオフにし、所望の励起波長(赤、緑、または青)に対応するLED光源と対応する光学フィルタを手動で選択しますセットアップ。 蛍光画像(顕微鏡>取得>取得設定>連続>開始>取得モードに焦点を合わせます。モーションコントロール>サンプルおよび変更サンプルZ)を取得し、明視野モザイクから位置パラメータ(XおよびY)を保持するモザイクマップを取得します(顕微鏡>取得>取得設定>取得モード>モザイク>開始)。 LED光源をオフにする オプション:明視野および蛍光モザイクマップに基づいて、以前に特定された関心領域(ROI)または新しいROI(画像内のX−Y位置)に注釈を付ける。 X線モザイク取得 CCD X線検出器(拡大レンズ>ピクシスを選択)を選択し、サンプルを0度回転させ(モーションコントロール>サンプルとサンプルθの変更)、X線 光学系(コンデンサとゾーンプレート)を整列位置に移動します(モーションコントロール>コンデンサ>コンデンサzを変更します。 モーションコントロール>ゾーンプレートとゾーンプレートZ)を変更します。手記： イメージング前にCCDチップを-65°Cまで冷却します(顕微鏡 > カメラの温度 を ピクシス >し 、設定温度 を-65°Cに変更して [適用]をクリックします)。 サンプルを選択したROIの1つのメッシュ正方形の中心に移動し(モーションコントロール > サンプル 、 サンプルX、 サンプルYを変更します)。 ビニング2と出口スリットを5μmで使用してミストラルでの照射と1秒の露出を最小限に抑え、B24でビニング1と60μmを使用し、サンプルZ変換(顕微鏡>取得>取得設定>カメラ設定を使用してフォーカスを調整し、ビニングを変更します。モーションコントロールはXS>し、XSを変更します。顕微鏡>取得>取得設定>取得モード>連続>開始。モーションコントロール>サンプルおよび変更サンプルZ)。5 μmのステップから始めて、セルまたはカーボンホイルの穴にピントが合うまで、0.5 μmのステップまで微調整します。 メッシュ正方形のモザイクマップを取得します(顕微鏡 > 取得 > 取得設定 > 取得モード > モザイク > 開始)。手記： モザイク取得パラメータは、VLMモザイクの場合と同じ方法で決定できます(セクション3.1.1.4)。刻み幅は、ビームラインスタッフによって事前に選択された倍率に依存する。 サンプルをフラットフィールド(FF)位置(グリッド内の空の領域、好ましくはカーボンサポートの穴)に移動します(モーションコントロール > サンプル と サンプルX、 サンプルYを変更します)。 ミストラルで露光時間を1秒、B24で0.5秒(顕微鏡 > 取得 > 取得設定 > カメラ設定 、 露出時間の変更)に設定し、単一の画像を取得します(顕微鏡 > 取得 > 取得モード > シングル > スタート)。 取得したモザイクをFF画像で正規化(分割)して透過(0〜1の値)を取得し、正規化されたモザイクを保存します(画像の右側にある最初の右上隅のアイコンをクリックしてメニューを開きます>[参照]タブを選択>[単一の参照]をクリックして特定のFFを参照します)。 X線チルトシリーズを収集する準備手記： イメージ化される各関心領域の回転軸を見つけます。断層撮影を行うモザイク内の領域の選択、すなわち、X線モザイクマップ内のFoVのサイズを有する正方形の形状(画像ウィンドウの左側にある ツール をクリック)を配置することによって行う。手記： 領域を選択するときは、回転中にセルが重ならないように、境界線 (≥10 μm) と他のセルからの距離を考慮してください。さらに、細胞の状態(予想される細胞形状、氷厚、ガラス化の成功、基準広がりなど)を確認します。 回転軸上の整列の例手記： 報告された手順は反復的です。反復は±、最大回転角度(θM).アクセスできない場合は、60°±の角度をできるだけ近づけます。カメラをビニング2、露出時間1秒(顕微鏡 > 取得 > 取得設定 > カメラ設定 、 露出時間の変更、 ビニングの変更; 顕微鏡 > 取得 > 取得モード > 連続 > 開始)、出口スリットを5μmに設定します。手記： 出口スリットの最小絞りで作業することにより、線量を可能な限り最小限に抑えます。 回転を0°にして、サンプルXとサンプルYの平行移動を使用して以前に選択した領域に移動し、サンプルZの平行移動を使用して回転軸に入れるセルの特徴に焦点を合わせます(モーションコントロール > サンプル と サンプルxを変更します。 サンプル y; サンプルz)。 サンプルを+ θM(モーションコントロール>サンプルとサンプルθの変更)に回転させ、回転軸に置くセルの特徴に線(L +)を描画します(画像ウィンドウの右側にあるラインツールボタンをクリックします)。 -θM(モーションコントロール>サンプルとサンプルθの変更)に回転させ、回転軸上に置きたいセルの特徴に線(L-)を描きます(画像ウィンドウの右側にある線ツールボタンをクリックします)。 +θM または -θM では、サンプル Z 平行移動を使用して、選択したフィーチャを両方のライン間の中心位置に移動します(モーションコントロール > サンプル と変更 サンプル Z)。 ステップ 3.3.2.3 の手順を、L+ から L- までの最小距離に達するまで繰り返し繰り返します。手記： 2本の線L+とL-の間の距離は、前の反復に対して小さくなければなりません。 サンプルθ = 0(モーションコントロール>サンプルおよび変更サンプルθ)で、サンプルXを両方の線の中心に選択したフィーチャを配置するのに必要な距離の2倍移動させます(サンプル> モーションコントロールとサンプルXの変更)。ゾーンプレート(ZP)Xを移動して、フィーチャをFoVの中心に戻します(モーションコントロール>ZPとZP Xを変更します)。この手順は、グリッドごとに 1 回だけ実行します。 ZP Zフォーカルシリーズ(異なるZP Z位置の画像のコレクション、通常は0.3μmのステップで)を記録することによって、新しい回転軸に対するZP Z位置を再最適化し(顕微鏡>取得>取得設定>集録モード>フォーカルシリーズ>開始)、ZP Zをサンプルが焦点を合わせている位置に移動します(モーションコントロール>ゾーンプレートとゾーンプレートzの変更)。 チルトシリーズ集録のパラメータを設定します。手記： 最大角度範囲は、最終的にZPの焦点距離によって制限されます(平らなサンプルの場合はそれぞれ40nmまたは25nmのZPの場合は±70度または±65度)。信号対雑音比(S/N)と放射線損傷を最適化して、露光時間を定義します。断層撮影では、角度範囲ごとに異なる露光時間を使用します。 最大回転角度に達する前にシャドウイングが発生した場合に備えて、最大回転角度範囲を決定します。 カメラビニングを1に設定し(顕微鏡 > 取得 > 取得設定 > カメラ設定 と ビニングの変更)、ミストラルで出口スリットを15μmに開き(モーションコントロール > XSとXS の変更)、回転を0°に設定します(モーションコントロール > サンプル と サンプルθの変更)。 露光時間1秒の単一画像(顕微鏡 > 取得 > 取得設定 > 取得モード > シングル > スタート)を取得し、断層撮影の各傾斜角に必要な露光時間を推定します。 断層撮影の取得 負の最大角度+0.1に移動します(たとえば、ZP 25 nmの場合は-65.1°に移動します)(モーションコントロール > サンプル に移動し、 サンプルθを変更します)。 画像の数を角度の合計数(角度0の画像を考慮)と角度範囲(顕微鏡 > 取得 > 取得設定 >集 録モード > 断層撮影 で画像数を変更し、角度 開始 と 角度終了を変更)として設定します。 定義された露出時間を設定し、取得を開始します(顕微鏡 > 取得 > 取得設定 > カメラ設定 、 露出時間 を変更してから 開始をクリックします)。 FF位置に移動し(モーションコントロール>サンプルXを変更し、次にサンプルYを変更します)、10枚のFF画像を取得します(顕微鏡>取得>取得モード>平均、画像数を変更してから開始をクリックします)。手記： ミストラルでは、目的の吸収端を横切ってエネルギーをスキャンしながら投影を取得すると、分光顕微鏡またはエネルギー依存顕微鏡が可能です。最終出力は2D投影のスタックであり、各ピクセルのX線吸収スペクトル(XAS)、すなわち化学情報を含む画像を含む。分光法と断層撮影を組み合わせた3Dへの拡張は、原理的には可能です。必要な総線量は制限である可能性があり、その後、差動吸収イメージングなどの特定の戦略が必要になることがあります。 4. データ解析 注: すべてのデータ分析は、利用可能なオープンソフトウェアと自動パイプラインで開発されたスクリプトで行われます。 ミストラルにて パイプラインは、トモグラフィスタックを、必要なすべてのメタデータを用いてtxrm拡張(TXMソフトウェア拡張)からhdf5(オープンソース階層データ形式)に変換し、次いで、FF平均および機械電流によってスタックを正規化し、最後に、特定のフレネルゾーンプレート(ZP)レンズおよびエネルギー23に対する光学系の測定点像分布関数によってスタックを逆畳し、24。デコンボリューションの場合は、適切なk = 1/SNR値を求めます(サンプルの厚さによって異なります)。ミストラルで開発されたスクリプトの場合は、txrm2deconv “input tomo” “input FF” -zp=”ZP used” – e= ” energy ” – dx= ” pixel size ” – k= ” 1/SNR ” – t=-1 というコマンドを入力します。 ミストラルで開発された自動アライメント用のスクリプトには、ctalignxcorr “正規化されたデコンボルブド stack.mrc” “正規化されたスタック.hdf5” というコマンドを入力します。メモ:Au NP基準25,26を使用して、投影を共通の回転軸に整列させるために、多くのソフトウェアアプリケーションを使用できます。投影の位置合わせには、サブピクセルの精度が必要です。自動アライメントは、Au NP基準が十分であり(>7)、視野上に十分に広がっている場合にのみ満足できる。手動アライメントは、多くの場合、可能な限り高い精度を達成するために自動アライメントを修正するために事後的に必要とされる。 整列された正規化されたスタックを再構築するには、使用可能ないくつかのアルゴリズムのいずれかを使用します。注: アライメントされたスタックは、加重逆投影法 (WBP) または同時反復再構成手法 (SIRT) を使用して数分で再構築できます。しかしながら、線形吸収係数(LAC)を保存するために、代数的再構成技術(ART)は27が好ましい。ARTはより多くの計算時間を必要とするため、SIRT28 は高速自動アライメントチルトシリーズ再構築(数分で30回の反復)のために最初に行われます。アライメントが満足のいくものになると、ARTが使用されます。 B24で カスタムビルドのパイプラインは、txrm データファイルを必要なすべてのメタデータを含む標準の Tiffs に変換し、WBP、SIRT、パッチの 3 つの方法でデータセットを処理するバッチ runtomo ワークフローに送信します。