תיאור קרטוגרפי תלת-ממדי של התא על ידי טומוגרפיה של קרני רנטגן רכות של Cryo
Summary
כאן, מוצג פרוטוקול המתאר את שלבי הכנת הדגימה ואיסוף הנתונים הנדרשים בטומוגרפיה של קרני רנטגן רכות של cryo (SXT) כדי לדמות את מבנה האולטרה-מבנה של תאים שלמים שהשתמרו בקריו ברזולוציה של 25 ננומטר חצי גובה.
Abstract
טכניקות הדמיה הן בסיסיות על מנת להבין את ארגון התאים והמנגנונים במחקר הביולוגי ובתחומים הקשורים אליו. בין הטכניקות הללו, טומוגרפיה של קרני רנטגן רכות של קריו (SXT) מאפשרת הדמיה של תאים שלמים שהשתמרו בקריו בטווח אנרגיית קרני הרנטגן של חלון המים (284-543 eV), שבה למבני פחמן יש ספיגה גבוהה יותר במהותה מאשר למים, מה שמאפשר שחזור תלת-ממדי של מקדם הקליטה הליניארי של החומר הכלול בכל ווקסל. מידע מבני כמותי ברמה של תאים שלמים בעובי של עד 10 מיקרומטר ניתן להשגה בדרך זו, עם תפוקה גבוהה ורזולוציה מרחבית עד לחצי גובה הצליל של 25-30 ננומטר. Cryo-SXT הוכיחה את עצמה כרלוונטית למחקר הביו-רפואי הנוכחי, מספקת מידע תלת-ממדי על תהליכי זיהום תאיים (וירוסים, חיידקים או טפילים), שינויים מורפולוגיים עקב מחלות (כגון מחלות גנטיות רצסיביות) ומסייעת לנו להבין את פעולת התרופה ברמה התאית, או איתור מבנים ספציפיים בסביבה התאית התלת-ממדית. בנוסף, על ידי ניצול אורך הגל הניתן לכוונון במתקני סינכרוטרון, ספקטרו-מיקרוסקופיה או מקבילתה התלת-ממדית, ספקטרו-טומוגרפיה, יכולה לשמש גם כדי לדמות ולכמת אלמנטים ספציפיים בתא, כגון סידן בתהליכי ביו-מינרליזציה. Cryo-SXT מספק מידע משלים לטכניקות הדמיה ביולוגיות אחרות כגון מיקרוסקופיית אלקטרונים, פלואורסצנציה של קרני רנטגן או פלואורסצנציה של אור נראה, והוא משמש בדרך כלל כשיטה שותפה להדמיה מתאמית דו-ממדית או תלת-ממדית בתנאים קריוגניים על מנת לקשר בין תפקוד, מיקום ומורפולוגיה.
Introduction
Cryo-SXT יכול למלא תפקיד מרכזי במחקר ההדמיה הביולוגית מכיוון שהוא מספק נפחים ברזולוציה בינונית תלת-ממדית (25-30 ננומטר חצי גובה הצליל) של תאים שלמים מיובשים 1,2,3,4,5,6. בטווח האנרגיה של חלון המים, בין קצוות K של ספיגת הפחמן והחמצן (4.4-2.3 ננומטר), מבנים תאיים עשירים בפחמן סופגים פי 10 יותר מהתווך העשיר בחמצן המחלחל ומקיף אותם. בטווח אנרגיה זה, ניתן לצלם תאים בעלי עובי של עד 10 מיקרומטר ללא צורך בחתך או בכתמה, מה שמוביל להקרנות ניגודיות ספיגה גבוהות כמותיות, אשר בשילוב עם יכולות סיבוב הדגימה, מאפשרות שחזור טומוגרפי של מבנה התא. Cryo-SXT ממלא נישה במונחים של ממדי דגימה ורזולוציה מרחבית שאינה נגישה בקלות על ידי שום טכניקת הדמיה אחרת.
בקצרה, ניגודיות הקליטה של cryo-SXT היא כמותית, שכן הנחתת הפוטונים באמצעות דגימת העובי t מצייתת לחוק באר-למברט באופן הבא: 
, כאשר I0 מייצג את עוצמת האירוע μl מקדם הקליטה הליניארי, התלוי באורך הגל λ ובחלק הדמיוני β של מקדם השבירה של הדגימה (
). הנחתה היא פונקציה של ההרכב הביוכימי ועובי המבנים המצולמים, כאשר לכל רכיב ביוכימי יש מקדם ספיגה ליניארי ספציפי של קרני רנטגן μl (LAC). משמעות הדבר היא שכל ערך ווקסל טומוגרפיה תלוי ביסודות הכימיים ובריכוזם באותו ווקסל7. זה מאפשר אפליה טבעית של אברונים שונים כגון גרעינים, גרעין, גופי שומנים או מיטוכונדריה, או מצבי דחיסה שונים של כרומטין אך ורק על סמך ערכי LAC הטבועים בהם משוחזרים 2,8,9.
בנוסף, cryo-SXT היא טכניקת תפוקה גבוהה עם טומוגרמות שנאספות תוך מספר דקות. זה מאפשר באופן ספציפי הדמיה מזוקלית של אוכלוסיות תאים שניתן ללכוד בנקודות זמן מרכזיות כגון חלוקה, התמיינות ואפופטוזיס, אך גם במצבי תגובה שונים כגון אלה המושרים על ידי חשיפה כימית לטיפולים תרופתיים ספציפיים או לזיהומים פתוגניים. נתונים שנאספו בנקודות מפתח אלה יספקו תיאור תלת-ממדי של המערכת עם תיעוד נאמן של הארגון המרחבי של האברונים התאיים השונים באותם רגעים ספציפיים.
בדרך כלל, cryo-SXT משמש בשילוב עם טכניקות אחרות בעקבות גישות מתאמות המאפשרות איתור תכונות ספציפיות, אירועים או מקרומולקולות בתוך הסביבה התאית התלת-ממדית 4,10,11,12,13,14,15,16, או נתוני פלואורסצנציה של קרני רנטגן קשיחות 17,18 . גישות קורלטיביות בתנאים קריוגניים הן בעלות חשיבות עליונה על מנת לקבל את התמונה השלמה והיקרה ביותר של מערכת העניין. סיכום תמציתי של זרימת העבודה האופיינית בקווי הקרן של מיסטרל (אלבה) ו-B24 (יהלום) משורטט באיור 1.
יתר על כן, תוך ניצול יכולת כוונון אורכי הגל במתקני סינכרוטרון, ניתן לקבל מידע ספקטרוסקופי בנוסף למבנה באמצעות הקליטה הדיפרנציאלית הספציפית של אלמנטים מסוימים הכלולים בדגימה. דוגמה לכך תהיה המיקום של סידן בחקר תהליכי ביומינרליזציה בתאים 19,20,21. על ידי צילום תמונות דו-ממדיות באנרגיות פוטונים שונות (ספקטרה) או טומוגרמות מתחת ובקצה העניין של בליעת קרני הרנטגן, ניתן לזהות את הפיקסלים או הווקסלים המכילים את האלמנט שנבחר. ספקטרה גם מאפשרת הבחנה בין מצבים כימיים (כלומר, אבולוציה של סידן אמורפי להידרוקסיאפטיט כמו בדוגמה הקודמת של ביו-מינרליזציה20). כימות של אלמנטים שונים אפשרי בדו-ממד ובתלת-ממד. הדמיה ספקטרוסקופית של תאים מרוטשים נעשית בדרך כלל בחלון המים, אך היא אפשרית גם בטווחי אנרגיה אחרים אם תכולת המים נמוכה מספיק או אם נעשה שימוש בפרוטוקולים אחרים להכנת דגימה, כולל התייבשות,22. פרוטוקול ספקטרוסקופי מפורט שלב אחר שלב הוא מעבר למוקד הפרוטוקול כאן.
בהמשך, הפרוטוקול מתמקד בסיכום קצר של שלבי הכנת הדגימה העיקריים, אם כי כל מערכת עשויה להזדקק לעידון אישי, ולאחר מכן הליך איסוף נתונים מפורט שלב אחר שלב עבור טומוגרפיה של קרני רנטגן רכות cryo.
Protocol
Representative Results
Discussion
הכנת הדגימה היא צעד קריטי להשגת טומוגרמות רנטגן רכות באיכות גבוהה, שכן איכותן תלויה ישירות באיכות הוויטריפיקציה של הדגימה ובעובי שכבת הקרח שבה מוטבע התא. תחזיות עם יחס אות לרעש גבוה ייאספו באזורים עם שכבת קרח דקה, מה שיאפשר למזער את מינון הקרינה הנדרש כדי להשיג את הרזולוציה הגבוהה ביותר האפשרית. בנוסף, מפגש התאים ישפיע גם על איכות הטומוגרמה הסופית, שכן יש להימנע מכך שתאים שכנים ייכנסו ל-FoV בעת הסיבוב. לבסוף, הפיזור הנכון של סמני Au fiducial יקבע את הדיוק של יישור ההקרנה ולאחר מכן יקבע בסופו של דבר את האיכות של הנפח המשוחזר התלת-ממדי הסופי. שים לב כי התפשטות נכונה של Au fiducials על הרשת מאפשרת אוטומטיזציה של שלב יישור ההקרנה, שבלעדיו נדרשת מומחיות גבוהה לצעד כה קריטי.
הפרוטוקול כאן מתאר רק אסטרטגיית הכנת דגימה אפשרית אחת, שיש לה קווי דמיון לאלה המשמשים בטומוגרפיה של אלקטרוני קריו (cryo-ET). בשני המקרים, פרוטוקולים המשפרים את הכנת המדגם התובענית לשכפול טוב יותר יהיו בסיסיים להצלחתן של טכניקות אלה, ונעשים מאמצים לקראת מטרה זו29. ראוי להזכיר כי בנוסף להדמיה של תאים מבודדים, ניתן גם לדמיין קטעי רקמות בתנאי שאות השידור דרך הקטע יספיק בזוויות הטיה גבוהות. בדרך כלל, זה מרמז על קטעים של כמה מיקרונים (מתחת ל-10 מיקרומטר).
כדי לדמות מבנה או אירוע מסוים בתוך תא מסוים, יש לוודא שתכונה מסוימת זו נמצאת בתוך ה-FoV של סדרת ההטיה. מכיוון שה-FoV ב-cryo-SXT מוגבל ל-10 x 10 μm2 עד 15 x 15 μm2 בהתאם לעדשה ומביא בחשבון דגימת יתר של פיקסלים של הרזולוציה לפחות לגורם של 2, הוא לעתים קרובות קטן יותר מהרחבת התא המלאה (ראו את הריבועים האדומים המצוינים באיור 5). לכן, יש למצוא את ההחזר על ההשקעה ולתייג אותו כראוי. זה נעשה בדרך כלל באמצעות תגים פלואורסצנטיים וגישות קורלטיביות של אור נראה. אסטרטגיות דו-ממדיות המשלבות אפיפלואורסצנציה הן פשוטות מכיוון שלמיקרוסקופ העברת קרני הרנטגן הרך יש מיקרוסקופ פלואורסצנטי משולב של אור נראה בקו, אך גישות אחרות לאות פלואורסצנטי דו-ממדי או תלת-ממדי ברזולוציה גבוהה זמינות גםהן 4,12,13,15,16 . במקרים אלה, יש לצלם את הרשת תחילה במכשירים ספציפיים כגון מיקרוסקופים ברזולוציה גבוהה במיוחד. שים לב שהגישות המתאמות היעילות ביותר הן אלה הכרוכות באיסוף נתונים בתנאים קריוגניים. הסיבה לכך היא שהפסקת הזמן בין טמפרטורת החדר (RT), הדמיה פלואורסצנטית של אור נראה, לבין ויטריפיקציה של דגימה, למשל, תעכב את תפיסת האירוע הסלולרי הנכון בזמן; בנוסף, הליך הוויטריפיקציה עשוי לנתק את תא העניין שצולם ב-RT מהרשת. גם אם רוב גישות ההדמיה המתאמות עשויות לרמוז שיש לתמרן את רשתות הדגימה ולהעביר אותן ממכשיר אחד למשנהו, ולמרות הסיכון המוגבר לזיהום ברשת או לנזק שזה גורם, התגמול ברור: כדי להיות מסוגל לאתר אירועים או מולקולות ספציפיים בתוך הנוף התאי.
כאשר נדרשת הדמיית תאים שלמים, תפירת טומוגרמות שונות אפשרית בתנאי שהמינון הכולל המיושם אינו חורג ממגבלת הנזק לקרינה. בדרך כלל, המינון שהופקד לאיסוף מעט טומוגרמות על אותו תא הוא הרבה מתחת לגבול ברזולוציה הניתנת להשגה (109 Gy), ולכן, אין צורך באסטרטגיה ספציפית כדי להוריד את המינון, אם כי זה תלוי מדגם וניסוי. במקרה של איסוף נתונים אינטנסיבי כגון ספקטרו-טומוגרפיה, אכן יידרש מזעור המינון ויהיה צורך ליישם איסוף נתונים נוח ואסטרטגיות עיבוד ספציפיות.
Cryo-SXT יש כמה מגבלות, אשר צריך להיות מוזכר כאן. הראשון הוא הטריז החסר הידוע, שהוא מהותי לשימוש בתמיכות מדגם שטוחות. תמיכות דגימה נימיות המאפשרות סיבוב של 180 מעלות שימשו בעבר ועדיין נעשה בהן שימוש במתקנים מסוימים, אך הן גם מציגות חסרונות כגון ניגודיות מרוששת בשל ספיגת הזכוכית והגבלת השימוש בתאים בהשעיה. דרך להפחית את ההשפעה של הטריז החסר היא על ידי ביצוע טומוגרפיה של הטיה כפולה. זה אכן אפשרי בקו הקרן של מיסטרל בימינו. המגבלה השנייה נקבעת על ידי עדשת לוחית אזור פרנל המשמשת במיקרוסקופים כאלה. עדשה זו קובעת את הרזולוציה האולטימטיבית הניתנת להשגה ואת עומק השדה (DoF), שניהם קשורים זה לזה באופן הדוק. משמעות הדבר היא שהגדלת הרזולוציה תפחית את ה-DoF בעוד שעובי התא יהיה לעתים קרובות גדול יותר. לדוגמה, עדשה של 40 ננומטר תהיה בתיאוריה DoF של 3 μm ורזולוציה של 24.4 ננומטר חצי גובה. הפשרה בין רזולוציה ל-DoF היא אפוא אסטרטגית ובחירת העדשה תהיה תלויה בסוג התא 30,31. לבסוף, TXMs תפעוליים ברחבי העולם רחוקים מלהיות מיקרוסקופים אידיאליים ונעשים מאמצים לשפר את המערכות האופטיות כדי להגיע לציפיות התיאורטיות. לבסוף, ניתן לבצע את ההדמיה והפילוח של הכרכים המשוחזרים עם כלי תוכנה ספציפיים 25,32,33,34.
לסיכום, cryo-SXT מאפשר הדמיה של תאים באופן כמותי ברזולוציה בינונית (25-30 ננומטר חצי גובה) ובמספרים סטטיסטיים (כמה עשרות טומוגרמות ביום). זה מאפשר להשיג את הארגון, ההפצה והממד של אברונים בתנאים ספציפיים, למשל, במהלך זיהום פתוגנים או מחלות, בנקודות זמן מדויקות או לאחר טיפולים מסוימים. זוהי, אם כן, טכניקת הדמיה ביולוגית משלימה שימושית למיקרוסקופיות האלקטרונים והאור הנראה הנפוצות יותר, שכל אחת מהן מתמודדת עם טווח מסוים של ממדי דגימה ורזולוציה. Cryo-SXT משמש לעתים קרובות בגישות קורלטיביות המערבות פלואורסצנציה של אור נראה, אך אסטרטגיות קורלטיביות אחרות של cryo אפשריות גם כן.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרויקט זה קיבל מימון מפרויקט ה-iNEXT-Discovery של הנציבות האירופית Horizon 2020 ומתוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם המענק של מארי סקלודובסקה-קירי מס’ 75439.
Materials
| Amira | Thermo Fisher | Software for segmentation | |
| Au Holey Carbon Films finder grids | (Quantifoil Micro Tools Gmb | R 2/2 Au G200F1 | Au Holey Carbon Films finder grids |
| Au nanoparticles | BBI Group, Cardiff, UK | Au nanoparticles 100nm | 100 nm Au nanoparticles (NPs) at Mistral (Alba) |
| Au nanoparticles | BBI Group, Cardiff, UK | Au nanoparticles 250nm | 250 nm Au nanoparticles (NPs) at B24 (Diamond) |
| Axio Scope A1 | Zeiss | 430035 9060 | Fluorescence microscope |
| Blotting No.1 filter paper | Whatman | WHA10010155 | Blotting filter |
| Bsoft | Software for projection alignment, reconstruction and visualization (Heymann et al., 2008) | ||
| Chimera | Software for segmentation (Pettersen et al. 2004) | ||
| Cryo-EM Glow Discharge Set | PELCO easiGlow | 91000S | Glow Discharge Cleaning System |
| Cu Holey Carbon Films finder grids | (Quantifoil Micro Tools Gmb | R 2/2Cu G200F1 | Cu Holey Carbon Films finder grids |
| Fetal calf serum | Sigma | F9665 | Heat Inactivated, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| ImageJ | Software for image processing and analysis in Java (NIH & LOCI University of Wisconsin) | ||
| IMOD | Software for projection alignment, reconstruction and visualization (Kremer et al., 1996) | ||
| Leica EM GP Grid Plunger | Leica | 16706401 | Automatic Plunge Freezer EM |
| LINKAM cryo-stage | Linkam Scientific Instruments | CMS 196 | Cryo-Correlative Microscopy Stage |
| MIB | Software for segmentation (Belevich et al. 2016) | ||
| P100 Petri dish | Sigma | P6106 | Treated for cell culture and sterile |
| P60 Petri dish | Sigma | D8054 | Treated for cell culture and sterile |
| Polylysin | Sigma | P4707 | Poly-L-lysine solution 0.01%, sterile-filtered |
| Soft X-Ray microscope 0.25-1.2keV | Xradia | NCT-SB | Transmission soft X-Ray microscope |
| SURVOS | Software for segmentation (Luengo et al. 2017) | ||
| Tomo3d | Software for reconstruction (SIRT, WBP) (Agulleiro et al. 2011) | ||
| TomoJ | Software for reconstruction (ART) (Messaoudi et al., 2007) | ||
| XM Data Explorer | Zeiss | TXM software |
References
- Carrascosa, J. L., et al. Cryo X-ray tomography of vaccinia virus membranes and inner compartments. Journal of Structural Biology. 168, 234-239 (2009).
- Uchida, M., et al. Soft X-ray tomography of phenotypic switching and the cellular response to antifungal peptoids in Candida albicans. PNAS. 106, 19375-19380 (2009).
- Schneider, G., et al. Three-dimensional cellular ultrastructure resolved by X-ray microscopy. Nature Methods. 10, 1-3 (2010).
- Chichón, F. J., et al. Cryo nano-tomography of vaccinia virus infected cells. Journal of Structural Biology. 177, 202-211 (2012).
- Groen, J., Conesa, J. J., Valcárcel, R., Pereiro, E. The cellular landscape by soft X-ray tomography. Biophysical Reviews. 11, 611-619 (2019).
- Kepsutlu, B., et al. Cells undergo major changes in the quantity of cytoplasmic organelles after uptake of gold nanoparticles with biologically relevant surface coatings. ACS Nano. 14, 2248-2264 (2020).
- Natterer, F. . The mathematics of computerized tomography. , (1986).
- Weiss, D., et al. Computed tomography of cryogenic biological specimens based on X-ray microscopic images. Ultramicroscopy. 84, 185-197 (2000).
- Clowney, E. J., et al. Nuclear aggregation of olfactory receptor genes governs their monogenic expression. Cell. 151, 724-737 (2012).
- Duke, E. M. H., et al. Imaging endosomes and autophagosomes in whole mammalian cells using correlative cryo-fluorescence and cryo-soft X-ray microscopy (cryo-CLXM). Ultramicroscopy. 143, 77-87 (2014).
- Cinquin, B., et al. Putting molecules in their place. Journal of Cellular Biochemistry. 115, 209-216 (2014).
- Hagen, C., et al. Multimodal nanoparticles as alignment and correlation markers in fluorescence/soft X-ray cryo-microscopy/tomography of nucleoplasmic reticulum and apoptosis in mammalian cells. Ultramicroscopy. 146, 46-54 (2014).
- Pérez-Berná, A. J., et al. Structural changes in cells images by soft X-ray cryo-tomography during Hepatitis C virus infection. ACS Nano. 10, 6597-6611 (2016).
- Chiappi, M., et al. Cryo-soft X-ray tomography as a quantitative three-dimensional tool to model nanoparticle:cell interaction. Journal of Nanobiotechnology. 14, 15 (2016).
- Varsano, N., et al. Development of correlative cryo-soft X-ray tomography and stochastic reconstruction microscopy. A study of cholesterol crystal early formation in cells. Journal of the American Chemical Society. 138, 14931-14940 (2016).
- Kounatidis, I., et al. Correlative cryo-structured illumination fluorescence microscopy and soft X-ray tomography elucidates reovirus intracellular release pathway. Cell. 182, 1-16 (2020).
- Kapishnikov, S., et al. Mode of action of quinoline antimalarial drugs in red blood cells infected by Plasmodium falciparum revealed in vivo. PNAS. 116 (46), 22946-22952 (2019).
- Conesa, J. J., et al. Unambiguous intracellular localization and quantification of a potent iridium anticancer compound by correlative 3D cryo X-ray imaging. Angewandte Chemie International Edition. 59, 1270-1278 (2020).
- Gal, A., et al. Native-state imaging of calcifying and noncalcifying microalgae reveals similarities in their calcium storage organelles. PNAS. 115 (43), 11000-11005 (2018).
- Procopio, A., et al. Chemical fingerprint of Zn-hydroxyapatite in the early stages of osteogenic differentiation. ACS Central Science. 5, 1449-1460 (2019).
- Kahil, K., et al. Cellular pathways of calcium transport and concentration toward mineral formation in sea urchin larvae. PNAS. 117 (49), 30957-30965 (2020).
- Conesa, J. J., et al. Intracellular nanoparticles mass quantification by near-edge absorption soft X-ray nanotomography. Scientific Reports. 6, 22354 (2016).
- Otón, J., Sorzano, C. O. S., Maribini, R., Pereiro, E., Carazo, J. M. Measurement of the modulation transfer function of an X-ray microscope based on multiple Fourier orders analysis of a Siemens star. Optics Express. 23 (8), 9567-9572 (2015).
- Otón, J., et al. Characterization of transfer function, resolution and depth of field of a soft X-ray microscope applied to tomography enhancement by Wiener deconvolution. Biomedical Optics Express. 7, 5092-5103 (2016).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).
- Heymann, J. B., Cardone, G., Winkler, D. C., Steven, A. C. Computational resources for cryo-electron tomography in Bsoft. Journal of Structural Biology. 161, 232-242 (2008).
- Messaoudi, C., et al. Three-dimensional chemical mapping by EFTEM-TomoJ including improvement of SNR by PCA and ART reconstruction of volume by noise supression. Microscopy Microanalysis. 19, 1669-1677 (2013).
- Agulleiro, J. I., Fernández, J. J. Fast tomographic reconstruction on multicore computers. Bioinformatics. 27, 582-583 (2011).
- Toro-Nahuelpan, M., et al. Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies. Nature Methods. 17, 50-54 (2020).
- Attwood, D. . Soft X-rays and Extreme Ultraviolet Radiation. Principles and Applications. , (2000).
- Howells, M., Jacobsen, C., Warwick, T. . Principles and Applications of Zone Plate X-ray. Microscopes. Science of Microscopy. , (2007).
- Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera–a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25, 1605-1612 (2004).
- Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy image browser: a platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets. PLOS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).
- Luengo, I., et al. SuRVoS: Super-region volume segmentation workbench. Journal of Structural Biology. 198, 43-53 (2017).
