وصف رسم الخرائط 3D للخلية بواسطة التصوير المقطعي بالأشعة السينية الناعمة Cryo
Summary
هنا ، يتم تقديم بروتوكول يصف خطوات إعداد العينات وجمع البيانات المطلوبة في التصوير المقطعي بالأشعة السينية الناعمة بالتبريد (SXT) لتصوير البنية الفائقة للخلايا المحفوظة بالتبريد بالكامل بدقة 25 نانومتر نصف الملعب.
Abstract
تقنيات التصوير أساسية من أجل فهم تنظيم الخلايا والآلات في البحوث البيولوجية والمجالات ذات الصلة. من بين هذه التقنيات ، يسمح التصوير المقطعي بالأشعة السينية الناعمة بالتبريد (SXT) بتصوير الخلايا الكاملة المحفوظة بالتبريد في نطاق طاقة الأشعة السينية لنافذة الماء (284-543 eV) ، حيث تتمتع هياكل الكربون بامتصاص أعلى جوهريا من الماء ، مما يسمح بإعادة بناء 3D لمعامل الامتصاص الخطي للمادة الموجودة في كل فوكسل. ثم يمكن تحقيق المعلومات الهيكلية الكمية على مستوى الخلايا الكاملة التي يصل سمكها إلى 10 ميكرومتر بهذه الطريقة ، مع إنتاجية عالية ودقة مكانية تصل إلى 25-30 نانومتر نصف الملعب. أثبتت Cryo-SXT أنها ذات صلة بالأبحاث الطبية الحيوية الحالية ، حيث توفر معلومات 3D عن عمليات العدوى الخلوية (الفيروسات أو البكتيريا أو الطفيليات) ، والتغيرات المورفولوجية بسبب الأمراض (مثل الأمراض الوراثية المتنحية) وتساعدنا على فهم عمل الدواء على المستوى الخلوي ، أو تحديد مواقع هياكل محددة في البيئة الخلوية ثلاثية الأبعاد. بالإضافة إلى ذلك ، من خلال الاستفادة من الطول الموجي القابل للضبط في مرافق السنكروترون ، يمكن أيضا استخدام المجهر الطيفي أو نظيره 3D ، التصوير الطيفي المقطعي ، لتصوير وتحديد عناصر محددة في الخلية ، مثل الكالسيوم في عمليات التمعدن الحيوي. يوفر Cryo-SXT معلومات تكميلية لتقنيات التصوير البيولوجي الأخرى مثل المجهر الإلكتروني أو تألق الأشعة السينية أو تألق الضوء المرئي ، ويستخدم بشكل عام كطريقة شريكة للتصوير المرتبط 2D أو 3D في الظروف المبردة من أجل ربط الوظيفة والموقع والمورفولوجيا.
Introduction
يمكن أن يلعب Cryo-SXT دورا مركزيا في أبحاث التصوير البيولوجي لأنه يوفر 3D متوسطة الدقة (25-30 نانومتر نصف الملعب) أحجام من الخلايا الكاملة المائية1،2،3،4،5،6. في نطاق طاقة نافذة الماء ، بين الكربون وامتصاص الأكسجين K حواف (4.4-2.3 نانومتر) ، تمتص الهياكل الخلوية الغنية بالكربون 10 مرات أكثر من الوسط الغني بالأكسجين الذي يتخلل ويحيط بها. في نطاق الطاقة هذا ، يمكن تصوير الخلايا المزججة التي يصل سمكها إلى 10 ميكرومتر دون الحاجة إلى التقسيم أو التلطيخ ، مما يؤدي إلى إسقاطات تباين كمية عالية الامتصاص ، والتي ، جنبا إلى جنب مع قدرات دوران العينة ، تسمح بإعادة البناء المقطعي للبنية الخلوية. يملأ Cryo-SXT مكانة من حيث أبعاد العينات والدقة المكانية التي لا يمكن الوصول إليها بسهولة بواسطة أي تقنية تصوير أخرى.
باختصار ، يكون تباين امتصاص cryo-SXT كميا ، حيث أن توهين الفوتونات من خلال عينة السماكة t يطيع قانون Beer-Lambert على النحو التالي: 
، حيث يمثل I0 شدة الحادث μl معامل الامتصاص الخطي ، والذي يعتمد على الطول الموجي λ والجزء التخيلي β من معامل الانكسار للعينة (
). التوهين هو دالة للتركيب الكيميائي الحيوي وسماكة الهياكل التي يتم تصويرها ، مع كل مكون كيميائي حيوي له معامل امتصاص خطي محدد للأشعة السينية μلتر (LAC). وهذا يعني أن كل قيمة فوكسل التصوير المقطعي تعتمد على العناصر الكيميائية وتركيزها في فوكسل7. هذا يسمح بالتمييز الطبيعي للعضيات المختلفة مثل النوى أو النواة أو الأجسام الدهنية أو الميتوكوندريا ، أو حالات الضغط المختلفة للكروماتين فقط بناء على قيم LAC المتأصلة التي أعيد بناؤها2،8،9.
بالإضافة إلى ذلك ، فإن cryo-SXT هي تقنية عالية الإنتاجية مع جمع الصور المقطعية في بضع دقائق. وهذا يتيح على وجه التحديد التصوير المتوسط النطاق لمجموعات الخلايا التي يمكن التقاطها في نقاط زمنية رئيسية مثل الانقسام والتمايز وموت الخلايا المبرمج ، ولكن أيضا في حالات استجابة مختلفة مثل تلك الناجمة عن التعرض الكيميائي لعلاجات دوائية محددة أو للعدوى المسببة للأمراض. البيانات التي تم جمعها في تلك النقاط الرئيسية سوف تقدم وصفا 3D للنظام مع سجل أمين للتنظيم المكاني للعضيات الخلوية المختلفة في تلك اللحظات المحددة.
عادة ، يتم استخدام cryo-SXT بالاشتراك مع تقنيات أخرى تتبع النهج المترابطة التي تسمح بتحديد موقع ميزات أو أحداث أو جزيئات كبيرة محددة داخل البيئة الخلوية ثلاثية الأبعاد4،10،11،12،13،14،15،16 ، أو بيانات تألق الأشعة السينية الصلبة17،18 . النهج المترابطة في الظروف المبردة لها أهمية قصوى من أجل الحصول على الصورة الأكثر اكتمالا وقيمة لنظام الاهتمام. يتم رسم ملخص موجز لسير العمل النموذجي في خطوط الحزم المبردة Mistral (Alba) و B24 (Diamond) في الشكل 1.
وعلاوة على ذلك، وبالاستفادة من قدرة ضبط الطول الموجي في مرافق السنكروترون، يمكن الحصول على المعلومات الطيفية بالإضافة إلى المعلومات الهيكلية باستخدام الامتصاص التفاضلي المحدد لعناصر معينة واردة في العينة. مثال على ذلك هو موقع الكالسيوم في دراسة عمليات التمعدن الحيوي في الخلايا19،20،21. من خلال التقاط صور 2D في طاقات فوتونية مختلفة (أطياف) أو صور مقطعية أدناه وعند حافة امتصاص الأشعة السينية المثيرة للاهتمام ، يمكن تحديد وحدات البكسل أو voxels التي تحتوي على العنصر المحدد. تسمح الأطياف أيضا بالتمييز بين الحالات الكيميائية (أي تطور الكالسيوم غير المتبلور إلى هيدروكسيباتيت كما في مثال التمعدن الحيوي السابق20). القياس الكمي للعناصر المختلفة ممكن في 2D و 3D. عادة ما يتم التصوير الطيفي للخلايا المزججة في نافذة الماء ، ولكنه ممكن أيضا في نطاقات الطاقة الأخرى إذا كان محتوى الماء منخفضا بما فيه الكفاية أو إذا تم استخدام بروتوكولات تحضير العينات الأخرى ، بما في ذلك الجفاف ،22. إن بروتوكول التحليل الطيفي المفصل خطوة بخطوة يتجاوز تركيز البروتوكول الوارد هنا.
في ما يلي ، يركز البروتوكول على تلخيص موجز لخطوات إعداد العينات الرئيسية ، على الرغم من أن كل نظام قد يحتاج إلى تحسين فردي ، يليه إجراء مفصل لجمع البيانات خطوة بخطوة للتصوير المقطعي بالأشعة السينية الناعمة بالتبريد.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد تحضير العينة خطوة حاسمة للحصول على صور مقطعية ناعمة عالية الجودة بالأشعة السينية ، حيث تعتمد جودتها بشكل مباشر على جودة تزجيج العينة وسماكة طبقة الجليد التي يتم تضمين الخلية فيها. سيتم جمع الإسقاطات ذات نسبة الإشارة إلى الضوضاء العالية في المناطق ذات الطبقة الجليدية الرقيقة ، مما يسمح بتقليل جرعة الإشعاع المطلوبة لتحقيق أعلى دقة ممكنة. بالإضافة إلى ذلك ، سيؤثر التقاء الخلايا أيضا على جودة التصوير المقطعي النهائي ، حيث يجب على المرء تجنب دخول الخلايا المجاورة إلى FoV عند الدوران. أخيرا ، سيحدد التشتت الصحيح للعلامات الائتمانية Au دقة محاذاة الإسقاط ثم يحدد في النهاية جودة الحجم النهائي 3D المعاد بناؤه. لاحظ أن الانتشار السليم لائتمانات Au على الشبكة يمكن من أتمتة خطوة محاذاة الإسقاط ، والتي بدونها تكون هناك حاجة إلى خبرة عالية لمثل هذه الخطوة الحرجة.
يصور البروتوكول الوارد هنا استراتيجية واحدة ممكنة لإعداد العينات فقط، والتي لها أوجه تشابه مع تلك المستخدمة في التصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد (cryo-ET). وفي كلتا الحالتين، ستكون البروتوكولات التي تحسن إعداد العينات المطلوبة من أجل تحسين قابلية الاستنساخ أساسية لنجاح هذه التقنيات، وتبذل الجهود لتحقيق هذا الهدف29. تجدر الإشارة إلى أنه بالإضافة إلى تصوير الخلايا المعزولة ، يمكن أيضا تصور أجزاء من الأنسجة بشرط أن تكون إشارة الإرسال عبر القسم كافية بزوايا إمالة عالية. عادة ، سيعني هذا أجزاء من عدد قليل من الميكرونات (أقل من 10 ميكرومتر).
لتصوير بنية أو حدث معين داخل خلية ، يحتاج المرء إلى التأكد من أن هذه الميزة المحددة موجودة داخل FoV لسلسلة الإمالة. نظرا لأن FoV في cryo-SXT يقتصر على 10 × 10 ميكرومتر 2 إلى 15 × 15 ميكرومتر 2 اعتمادا على العدسة ويمثل أخذ عينات زائدة من البكسل للدقة إلى عامل2 على الأقل ، فإنه غالبا ما يكون أصغر من امتداد الخلية الكامل (انظر المربعات الحمراء المشار إليها في الشكل 5). لذلك ، يجب العثور على عائد الاستثمار وتصنيفه بشكل صحيح. وعادة ما يتم ذلك عن طريق علامات الفلورسنت والنهج المرتبطة بالضوء المرئي. استراتيجيات 2D التي تجمع بين epifluorescence واضحة حيث أن مجهر نقل الأشعة السينية الناعم يحتوي على مجهر مشرق الضوء المرئي المتكامل عبر الإنترنت ، ولكن هناك طرق أخرى لإشارة التألق 2D أو 3D عالية الدقة متوفرة أيضا 4,12,13,15,16 . في هذه الحالات ، يجب تصوير الشبكة أولا في أدوات محددة مثل المجاهر فائقة الدقة. لاحظ أن النهج الأكثر كفاءة هي تلك التي تنطوي على جمع البيانات في الظروف المبردة. وذلك لأن الفاصل الزمني بين درجة حرارة الغرفة (RT) ، والتصوير الفلوري للضوء المرئي ، وتزجيج العينات ، على سبيل المثال ، سيعيق التقاط الحدث الخلوي الصحيح في الوقت المحدد ؛ بالإضافة إلى ذلك ، قد يؤدي إجراء التزجيج إلى فصل خلية الاهتمام التي تم تصويرها في RT عن الشبكة. حتى لو كانت معظم أساليب التصوير المترابطة قد تعني ضمنا أنه يجب التعامل مع شبكات العينات ونقلها من أداة إلى أخرى ، وعلى الرغم من زيادة خطر تلوث الشبكة أو تلف هذا ، فإن المكافأة واضحة: أن تكون قادرا على تحديد أحداث أو جزيئات معينة داخل المشهد الخلوي.
عندما تكون هناك حاجة إلى تصوير الخلية بأكملها ، يمكن خياطة صور مقطعية مختلفة بشرط ألا تتجاوز الجرعة الإجمالية المطبقة حد الضرر الإشعاعي. عادة ما تكون الجرعة المودعة لجمع عدد قليل من الصور المقطعية على نفس الخلية أقل بكثير من الحد الأقصى عند الدقة القابلة للتحقيق (109 Gy) ، وبالتالي ، لا توجد حاجة إلى استراتيجية محددة لخفض الجرعة ، على الرغم من أن هذا يعتمد على العينة والتجربة. وفي حالة الجمع المكثف للبيانات مثل التصوير المقطعي الطيفي، ستكون هناك حاجة بالفعل إلى تقليل الجرعة إلى أدنى حد ممكن وسيلزم تطبيق استراتيجيات ملائمة لجمع البيانات ومعالجة محددة.
يحتوي Cryo-SXT على العديد من القيود ، والتي يجب ذكرها هنا. الأول هو الوتد المفقود المعروف ، وهو أمر جوهري لاستخدام دعامات العينات المسطحة. تم استخدام دعامات العينات الشعرية التي تسمح بدوران 180 درجة في الماضي ولا تزال تستخدم في بعض المرافق ، ولكنها تقدم أيضا عيوبا مثل التباين الفقير بسبب امتصاص الزجاج وتقييد استخدام الخلايا في التعليق. طريقة لتقليل تأثير الوتد المفقود هي عن طريق إجراء التصوير المقطعي المزدوج الإمالة. هذا ممكن بالفعل في خط شعاع ميسترال في الوقت الحاضر. يتم تعيين القيد الثاني بواسطة عدسة لوحة منطقة فريسنل المستخدمة في مثل هذه المجاهر. تحدد هذه العدسة الدقة القصوى التي يمكن تحقيقها وعمق المجال (DoF) ، وكلاهما مرتبط ارتباطا وثيقا. وهذا يعني أن زيادة الدقة ستقلل من وزارة المالية في حين أن سمك الخلية غالبا ما يكون أكبر. على سبيل المثال ، سيكون لعدسة 40 نانومتر من الناحية النظرية DoF من 3 ميكرومتر ودقة 24.4 نانومتر نصف الملعب. وبالتالي فإن الحل الوسط بين الدقة ووزارة المالية استراتيجي وسيعتمد اختيار العدسة على نوع الخلية30,31. وأخيرا، فإن أجهزة TXM التشغيلية في جميع أنحاء العالم بعيدة كل البعد عن أن تكون مجاهر مثالية، وتبذل جهود لتحسين الأنظمة البصرية للوصول إلى التوقعات النظرية. أخيرا ، يمكن إجراء تصور وتجزئة المجلدات المعاد بناؤها باستخدام أدوات برمجية محددة25،32،33،34.
باختصار ، يسمح cryo-SXT بتصوير الخلايا كميا بدقة متوسطة (25-30 نانومتر نصف الملعب) وبأرقام إحصائية (بضع عشرات من التصوير المقطعي يوميا). وهذا يسمح بالحصول على تنظيم وتوزيع وأبعاد العضيات في ظروف محددة ، على سبيل المثال ، أثناء العدوى أو الأمراض المسببة للأمراض ، في نقاط زمنية دقيقة أو بعد علاجات معينة. ولذلك، فهي تقنية تصوير بيولوجي تكميلية مفيدة للمجهر الإلكتروني والضوء المرئي الأكثر شيوعا، حيث يتناول كل منها نطاقا محددا من أبعاد العينات ودقتها. يستخدم Cryo-SXT بشكل متكرر في النهج المترابطة التي تنطوي على تألق الضوء المرئي ، ولكن الاستراتيجيات الأخرى المرتبطة بالتبريد ممكنة أيضا.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تلقى هذا المشروع تمويلا من مشروع iNEXT-Discovery التابع للمفوضية الأوروبية Horizon 2020 وبرنامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاقية منحة Marie Skłodowska-Curie رقم 75439.
Materials
| Amira | Thermo Fisher | Software for segmentation | |
| Au Holey Carbon Films finder grids | (Quantifoil Micro Tools Gmb | R 2/2 Au G200F1 | Au Holey Carbon Films finder grids |
| Au nanoparticles | BBI Group, Cardiff, UK | Au nanoparticles 100nm | 100 nm Au nanoparticles (NPs) at Mistral (Alba) |
| Au nanoparticles | BBI Group, Cardiff, UK | Au nanoparticles 250nm | 250 nm Au nanoparticles (NPs) at B24 (Diamond) |
| Axio Scope A1 | Zeiss | 430035 9060 | Fluorescence microscope |
| Blotting No.1 filter paper | Whatman | WHA10010155 | Blotting filter |
| Bsoft | Software for projection alignment, reconstruction and visualization (Heymann et al., 2008) | ||
| Chimera | Software for segmentation (Pettersen et al. 2004) | ||
| Cryo-EM Glow Discharge Set | PELCO easiGlow | 91000S | Glow Discharge Cleaning System |
| Cu Holey Carbon Films finder grids | (Quantifoil Micro Tools Gmb | R 2/2Cu G200F1 | Cu Holey Carbon Films finder grids |
| Fetal calf serum | Sigma | F9665 | Heat Inactivated, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| ImageJ | Software for image processing and analysis in Java (NIH & LOCI University of Wisconsin) | ||
| IMOD | Software for projection alignment, reconstruction and visualization (Kremer et al., 1996) | ||
| Leica EM GP Grid Plunger | Leica | 16706401 | Automatic Plunge Freezer EM |
| LINKAM cryo-stage | Linkam Scientific Instruments | CMS 196 | Cryo-Correlative Microscopy Stage |
| MIB | Software for segmentation (Belevich et al. 2016) | ||
| P100 Petri dish | Sigma | P6106 | Treated for cell culture and sterile |
| P60 Petri dish | Sigma | D8054 | Treated for cell culture and sterile |
| Polylysin | Sigma | P4707 | Poly-L-lysine solution 0.01%, sterile-filtered |
| Soft X-Ray microscope 0.25-1.2keV | Xradia | NCT-SB | Transmission soft X-Ray microscope |
| SURVOS | Software for segmentation (Luengo et al. 2017) | ||
| Tomo3d | Software for reconstruction (SIRT, WBP) (Agulleiro et al. 2011) | ||
| TomoJ | Software for reconstruction (ART) (Messaoudi et al., 2007) | ||
| XM Data Explorer | Zeiss | TXM software |
References
- Carrascosa, J. L., et al. Cryo X-ray tomography of vaccinia virus membranes and inner compartments. Journal of Structural Biology. 168, 234-239 (2009).
- Uchida, M., et al. Soft X-ray tomography of phenotypic switching and the cellular response to antifungal peptoids in Candida albicans. PNAS. 106, 19375-19380 (2009).
- Schneider, G., et al. Three-dimensional cellular ultrastructure resolved by X-ray microscopy. Nature Methods. 10, 1-3 (2010).
- Chichón, F. J., et al. Cryo nano-tomography of vaccinia virus infected cells. Journal of Structural Biology. 177, 202-211 (2012).
- Groen, J., Conesa, J. J., Valcárcel, R., Pereiro, E. The cellular landscape by soft X-ray tomography. Biophysical Reviews. 11, 611-619 (2019).
- Kepsutlu, B., et al. Cells undergo major changes in the quantity of cytoplasmic organelles after uptake of gold nanoparticles with biologically relevant surface coatings. ACS Nano. 14, 2248-2264 (2020).
- Natterer, F. . The mathematics of computerized tomography. , (1986).
- Weiss, D., et al. Computed tomography of cryogenic biological specimens based on X-ray microscopic images. Ultramicroscopy. 84, 185-197 (2000).
- Clowney, E. J., et al. Nuclear aggregation of olfactory receptor genes governs their monogenic expression. Cell. 151, 724-737 (2012).
- Duke, E. M. H., et al. Imaging endosomes and autophagosomes in whole mammalian cells using correlative cryo-fluorescence and cryo-soft X-ray microscopy (cryo-CLXM). Ultramicroscopy. 143, 77-87 (2014).
- Cinquin, B., et al. Putting molecules in their place. Journal of Cellular Biochemistry. 115, 209-216 (2014).
- Hagen, C., et al. Multimodal nanoparticles as alignment and correlation markers in fluorescence/soft X-ray cryo-microscopy/tomography of nucleoplasmic reticulum and apoptosis in mammalian cells. Ultramicroscopy. 146, 46-54 (2014).
- Pérez-Berná, A. J., et al. Structural changes in cells images by soft X-ray cryo-tomography during Hepatitis C virus infection. ACS Nano. 10, 6597-6611 (2016).
- Chiappi, M., et al. Cryo-soft X-ray tomography as a quantitative three-dimensional tool to model nanoparticle:cell interaction. Journal of Nanobiotechnology. 14, 15 (2016).
- Varsano, N., et al. Development of correlative cryo-soft X-ray tomography and stochastic reconstruction microscopy. A study of cholesterol crystal early formation in cells. Journal of the American Chemical Society. 138, 14931-14940 (2016).
- Kounatidis, I., et al. Correlative cryo-structured illumination fluorescence microscopy and soft X-ray tomography elucidates reovirus intracellular release pathway. Cell. 182, 1-16 (2020).
- Kapishnikov, S., et al. Mode of action of quinoline antimalarial drugs in red blood cells infected by Plasmodium falciparum revealed in vivo. PNAS. 116 (46), 22946-22952 (2019).
- Conesa, J. J., et al. Unambiguous intracellular localization and quantification of a potent iridium anticancer compound by correlative 3D cryo X-ray imaging. Angewandte Chemie International Edition. 59, 1270-1278 (2020).
- Gal, A., et al. Native-state imaging of calcifying and noncalcifying microalgae reveals similarities in their calcium storage organelles. PNAS. 115 (43), 11000-11005 (2018).
- Procopio, A., et al. Chemical fingerprint of Zn-hydroxyapatite in the early stages of osteogenic differentiation. ACS Central Science. 5, 1449-1460 (2019).
- Kahil, K., et al. Cellular pathways of calcium transport and concentration toward mineral formation in sea urchin larvae. PNAS. 117 (49), 30957-30965 (2020).
- Conesa, J. J., et al. Intracellular nanoparticles mass quantification by near-edge absorption soft X-ray nanotomography. Scientific Reports. 6, 22354 (2016).
- Otón, J., Sorzano, C. O. S., Maribini, R., Pereiro, E., Carazo, J. M. Measurement of the modulation transfer function of an X-ray microscope based on multiple Fourier orders analysis of a Siemens star. Optics Express. 23 (8), 9567-9572 (2015).
- Otón, J., et al. Characterization of transfer function, resolution and depth of field of a soft X-ray microscope applied to tomography enhancement by Wiener deconvolution. Biomedical Optics Express. 7, 5092-5103 (2016).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).
- Heymann, J. B., Cardone, G., Winkler, D. C., Steven, A. C. Computational resources for cryo-electron tomography in Bsoft. Journal of Structural Biology. 161, 232-242 (2008).
- Messaoudi, C., et al. Three-dimensional chemical mapping by EFTEM-TomoJ including improvement of SNR by PCA and ART reconstruction of volume by noise supression. Microscopy Microanalysis. 19, 1669-1677 (2013).
- Agulleiro, J. I., Fernández, J. J. Fast tomographic reconstruction on multicore computers. Bioinformatics. 27, 582-583 (2011).
- Toro-Nahuelpan, M., et al. Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies. Nature Methods. 17, 50-54 (2020).
- Attwood, D. . Soft X-rays and Extreme Ultraviolet Radiation. Principles and Applications. , (2000).
- Howells, M., Jacobsen, C., Warwick, T. . Principles and Applications of Zone Plate X-ray. Microscopes. Science of Microscopy. , (2007).
- Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera–a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25, 1605-1612 (2004).
- Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy image browser: a platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets. PLOS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).
- Luengo, I., et al. SuRVoS: Super-region volume segmentation workbench. Journal of Structural Biology. 198, 43-53 (2017).
