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免疫与感染

Teste de Eficácia de Antibióticos em um Modelo Ex vivo de Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus Biofilms no Pulmão da Fibrose Cística

Published: January 22, 2021
doi:
10.3791/62187
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1School of Life Science,University of Warwick, 2Institute of Microbiology and Infection,University of Birmingham, 3Warwick Antimicrobial Screening Facility, School of Life Science,University of Warwick

Summary

Este fluxo de trabalho pode ser usado para realizar testes de suscetibilidade a antibióticos usando um modelo ex vivo estabelecido de biofilme bacteriano nos pulmões de indivíduos com fibrose cística. O uso deste modelo poderia aumentar a validade clínica dos ensaios de IMC (concentração mínima de erradicação de biofilmes).

Abstract

A prescrição eficaz de antibióticos para os biofilmes bacterianos presentes nos pulmões de indivíduos com fibrose cística (CF) é limitada por uma correlação ruim entre os resultados dos testes de suscetibilidade de antibióticos (AST) utilizando métodos de diagnóstico padrão (por exemplo, microdiluição de caldo, difusão de disco ou Etest) e desfechos clínicos após o tratamento com antibióticos. As tentativas de melhorar o AST com o uso de plataformas de crescimento de biofilm fora da prateleira mostram pouca melhora nos resultados. A capacidade limitada de sistemas de biofilme in vitro para imitar o ambiente físico-químico do pulmão CF e, portanto, a fisiologia bacteriana e a arquitetura de biofilm, também atua como um freio na descoberta de novas terapias para infecção por CF. Aqui, apresentamos um protocolo para realizar patógenos AST de CF cultivados como biofilmes maduros, in vivo-like em um modelo pulmonar ex vivo CF composto por tecido bronquiolar de porco e escarro CF sintético (ex vivo pig lung, EVPL).

Existem vários ensaios in vitro para testes de suscetibilidade de biofilm, utilizando meio de laboratório padrão ou várias formulações de escarro CF sintético em placas de microtúter. Tanto o substrato de crescimento médio quanto o biofilme (placa de poliestireno vs. tecido bronquiolar) provavelmente afetarão a tolerância a antibióticos de biofilme. Mostramos maior tolerância dos pseudomonas clínicos aeruginosa e Staphylococcus aureus isolados no modelo ex vivo; os efeitos do tratamento antibiótico de biofilmes não estão correlacionados com a concentração inibitória mínima (MIC) em ensaios de microdilução padrão ou uma classificação sensível/resistente em ensaios de difusão de disco.

A plataforma ex vivo poderia ser usada para biofilme sob medida AST de amostras de pacientes e como uma plataforma de teste aprimorada para potenciais agentes antibiofilm durante a pesquisa e desenvolvimento farmacêutico. Melhorar a prescrição ou aceleração da descoberta de medicamentos antibiofilm através do uso de plataformas de testes mais in vivo poderia melhorar drasticamente os resultados de saúde para indivíduos com CF, bem como reduzir os custos de tratamento clínico e pesquisa de descoberta.

Introduction

Infecções crônicas por biofilmes afetam indivíduos cujas defesas imunológicas normais estão comprometidas. Os grupos de risco incluem aqueles com a condição genética fibrose cística (CF)1. A colonização do muco adesivo anormalmente espesso no trato respiratório na primeira infância leva a infecções de biofilme intratáveis dos brônquios2,3. O crescimento de bactérias como extensos biofilmes encapsulados por matriz é um fator que distingue infecções crônicas de pessoas imunocomprometidas de infecções agudas de hospedeiros saudáveis e o estado do biofilme protege as bactérias da exposição a antibióticos (devido à redução da difusão através da matriz) e diminui sua suscetibilidade a antibióticos (por exemplo, por indução de quiescência ou regulação de bombas de efflux)4,5. No entanto, alterações específicas da doença na fisiologia e química do tecido hospedeiro alteram ainda mais a fisiologia bacteriana da observada em infecções agudas ou em condições padrão de crescimento laboratorial. Os principais exemplos na CF incluem o uso de fontes de carbono incomuns, como ácidos graxos e aminoácidos liberados do surfactante pulmonar e produzidos pela degradação microbiana da mucina, a liberação de micronutrientes, como o ferro de tecidos danificados, e microaerobiose6,7,8.

As condições físicas específicas em um contexto específico de infecção por biofilm podem, portanto, influenciar as respostas aos antibióticos. Em primeiro lugar, a estrutura e a profundidade da matriz extracelular dependem das condições ambientais locais, como nutrientes ou forças de tesoura. Em segundo lugar, as pistas ambientais podem desencadear a expressão de genes específicos de resistência a antibióticos. Por exemplo, o patógeno CF Pseudomonas aeruginosa mostra maior expressão de uma beta-lactamase e expressão reduzida de porínas em escarro CF versus in vitro9, enquanto outro patógeno CF, Birkholderia cenocepacia,aumenta as bombas beta-lactamases e efflux quando cultivado em escarro CF10. Em terceiro lugar, as condições in-host podem sinalizar uma mudança fisiológica ou genética para fenótipos tolerantes a antibióticos, que são difíceis de recapitular in vitro. Estes incluem pequenas variantes de colônia do patógeno CF Staphylococcus aureus11,12.

Todos esses dados indicam que quando os laboratórios de diagnóstico isolam clones individuais de biofilme patogênico e realizam AST em culturas cultivadas em placas de álticas ou de ágar em mídias de laboratório padrão (microdilução de caldo, difusão de disco ou Etest), os resultados muitas vezes não prevêem quais antibióticos realmente funcionarão in vivo. Mesmo que sejam utilizados ensaios de biofilme in vitro, eles podem não sinalizar um fenótipo de biofilme in vivo devido a diferenças na superfície média e de fixação utilizadas, de modo que os ensaios usando células de fluxo ou plataformas de microplacão de alto rendimento podem superestimar a sensibilidade aantibióticos 13. O mesmo problema se aplica a pesquisadores da academia e da indústria que buscam desenvolver novos agentes antibiofilm: testar o potencial de drogas usando plataformas in vitro como células de fluxo, placas de microtítiter ou reatores biofilm do Center for Disease Control podem definir a barra de eficácia do biofilm muito baixa e produzir falsos positivos na pesquisa, pipeline de desenvolvimento.

A baixa correlação entre os resultados da AST e o desfecho clínico após o tratamento com antibióticos em CF é bem conhecida. Muitos médicos simplesmente ignoram o laboratório de diagnóstico AST, pois não há diretrizes uniformes, específicas da CF para interpretar esses resultados e, em vez disso, tomam decisões caso a caso para prescrição. Foram feitas tentativas de melhorar o CF AST usando o dispositivo biofilme de Calgary, que usa biofilmes cultivados na superfície de pinos plásticos colocados dentro dos poços de uma microplaca contendo meio AST padrão (por exemplo, caldo Muller-Hinton ajustado por cation)14,15. Este ensaio não faz melhor em prever quais antibióticos funcionarão in vivo do que o padrão planktônico AST16. O impacto nos pacientes com CF é gritante. Apesar da administração repetida de antibióticos (antibióticos inalados regulares e uma mediana de 27 dias/ano recebendo antibióticos intravenosos para indivíduos com CF no Reino Unido)17, episódios frequentes e imprevisíveis de exacerbação pulmonar aguda levam a danos pulmonares progressivos e, em aproximadamente 90% dos casos, morte por insuficiência respiratória. Em uma análise recente, a infecção pulmonar bacteriana foi o mais forte preditor dos custos de medicamentos em CF, adicionando em média € 3,6 Mil/paciente/ano aos custos diretos de saúde18,19.

Para infecções agudas de indivíduos saudáveis, a pesquisa atual e a política com foco na AST rápida com base, por exemplo, na previsão genômica do ponto de cuidado éideal 20. Mas no caso de infecções crônicas de CF, é evidente que uma abordagem diferente é necessária: a implementação do AST em modelos de imitação de hospedeiros que melhor recapitulem o ambiente in vivo e o estado metabólico do patógeno e permitam a formação de estrutura biofilme realista.

Desenvolvemos anteriormente um modelo de biofilme CF que compreende seções de brônquio de porco incubada em escarro CF sintética e infectada com P. aeruginosa ou S. aureus. O EVPL não infectado mantém a histopatologia normal por 7 dias, mas os isolados laboratoriais ou clínicos de P. aeruginosa e S. aureus formam-se reproduzivelmente em agregados vivos ao redor do tecido, imitando a etiologia da infecção por CF21,22,23. Apresentamos um protocolo para o uso deste modelo de alta validade e alta produtividade como uma plataforma AST de biofilme sob medida para CF e apresentamos resultados exemplares mostrando a alta tolerância de biofilmes de patógenos a antibióticos clinicamente utilizados quando cultivados no modelo. O modelo poderia ser facilmente incorporado em pesquisa, pipelines de desenvolvimento para a gestão ou prevenção da formação de biofilmes e potencialmente em AST diagnóstico. A maioria dos equipamentos utilizados (ver Tabela de Materiais) pode ser facilmente encontrada em um laboratório típico de microbiologia, embora um batedor de contas seja essencial, e descobrimos a partir do trabalho com colaboradores que um armário germicidal ultravioleta adequado também pode precisar ser adquirido. Como os pulmões são provenientes de açougueiros comerciais ou matadouros, o modelo não apresenta preocupações éticas.

Protocol

Este protocolo usa pulmões de porco provenientes de um matadouro comercial que fornece carne para consumo humano. De acordo com a legislação britânica, o uso de restos de tecido de animais abatidos para carne não requer aprovação ética; aconselhamos os leitores a verificar as leis locais relevantes e as diretrizes institucionais antes de iniciar o trabalho. 1. Preparação de Mídia sintética cf sputum (SCFM) Para fazer SCFM para uso com tecido EVPL, siga a receita delineada por Palmer et al.24 com a modificação de que a glicose é removida da receita.NOTA: A receita de Palmer et al. contém aminoácidos, cára, ânions e lactato gratuitos em concentrações representativas das concentrações médias encontradas em uma seleção de amostras de escarro de pacientes cf. Mostrou-se que as vias comparáveis de uso de carbono e a expressão de sinais de detecção de quórum por P. aeruginosa PA14 para o crescimento em médio feito de escarro de paciente liofilizado24. Uma receita de 1 L modificado SCFM é fornecida na Tabela S1. O filtro esteriliza o SCFM imediatamente após a preparação e armazena a 4 °C por até 1 mês. 2. Dissecção e infecção do tecido ex vivo pig lung (EVPL) Antes da dissecção, prepare uma placa de ágar/s de cepa bacteriana/s necessária para infecção usando qualquer ágar padrão no laboratório para P. aeruginosa/S. aureus (por exemplo, caldo de lysogeny + 1,2% ágar). Calcule quantas peças de tecido bronquiolar suínos são necessárias para o experimento, incluindo pedaços de tecido de controle não infectados. Multiplique este número por dois para repetir o experimento em dois pulmões de réplica para confirmar a repetibilidade dos resultados. Multiplique o número total de peças de tecido exigidas por 0,5 para determinar o volume de agarose SCFM (mL) necessário para fazer almofadas de agarose para fazer o meio suficiente para 400 μL/peça de tecido mais ágar SCFM sobressalente para explicar quaisquer erros de pipetação ou evaporação durante a preparação. Adicione 0,12 g de agarose a cada 15 mL de SCFM necessário para fazer o volume total desejado de SCFM com 0,8% de peso/volume agarose. Aqueça a solução de agarose scfm até que a ágarose esteja totalmente dissolvida. Recomenda-se um micro-ondas doméstico com baixa potência. O tempo necessário depende da potência do micro-ondas. Deixe a agarose esfriar a aproximadamente 50 °C (quente ao toque, mas confortável de segurar). Não deixe esfriar mais. Usando uma pipeta, adicione 400 μL do SCFM agarose a um poço de uma placa de 24 poços por peça de tecido necessária. Esterilize a placa/s contendo 24 poços de scfm sob luz ultravioleta por 10 minutos. Prepare três lavagens de réplica para cada pulmão intacto sendo dissecado usando 20 mL de médio águia modificado (DMEM) modificado de Dulbecco mais 20 mL de estéril Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado com 50 μg/mL ampicillin. Faça uma alíquota de 40 mL SCFM como uma lavagem final para cada pulmão intacto sendo dissecado. Todas as lavagens podem ser armazenadas durante a noite a 4 °C ou usadas imediatamente. Obtenha pulmões da fonte designada o mais rápido possível após o abate, garantindo que eles sejam mantidos frios transportando para o laboratório em uma caixa de resfriamento doméstica.NOTA: Os pulmões mais próximos do dia do abate mostram menos hematomas do armazenamento, mas o tecido mantido em armazenamento frio por até 4 dias após o abate também pode ser usado. Como a geladeira precisa ser levada para o açougue ou abatedouro, ela deve ser descontaminada seguindo as diretrizes do laboratório local após cada uso e armazenada fora do laboratório de microbiologia quando não estiver em uso, para reduzir o risco de contaminação e uma quebra de contenção. Trabalhando em uma superfície esterilizada e sob uma chama, coloque os pulmões em uma tábua de corte de plástico limpa coberta com papel alumínio autoclavado. Verifique se os brônquios permanecem intactos. Se houve algum dano no matadouro ou durante o transporte, os pulmões não são adequados para uso. Aqueça uma faca de paleta sob uma chama e toque brevemente a faca na área do pulmão ao redor do brônquio para esterilizar a superfície do tecido. Corte o tecido superficial ao redor do brônquio usando uma lâmina de barbear montada estéril. Faça incisões paralelas ao brônquio para evitar qualquer dano. Uma vez exposto o brônquio, faça uma incisão transversal através do brônquio no ponto mais alto visível para libertar o brônquio. Usando fórceps estéreis, segure levemente a extremidade livre do brônquio e corte qualquer tecido indesejado restante usando uma lâmina de barbear montada estéril. Faça uma incisão transversal final através do brônquio antes que qualquer ramificação seja visível para remover o brônquio dos pulmões. Coloque o brônquio na primeira lavagem DMEM/RPMI 1640. Deixe o brônquio na lavagem e repita as etapas 2.11-2.14 para colher seções adicionais de bronquio do mesmo pulmão necessários para produzir seções de tecido suficientes para o experimento planejado. Coloque quaisquer seções adicionais de bronquiolar do mesmo pulmão na lavagem (passo 2.16). Deixe na lavagem por pelo menos 2 minutos. Remova os brônquios da primeira lavagem DMEM/RPMI 1640 e coloque as amostras em uma placa de Petri estéril. Segure cada brônquio levemente usando fórceps estéreis, certificando-se de não danificar o tecido. Remova o máximo de tecido mole restante possível e corte o tecido em tiras de ~5 mm de largura usando uma tesoura de dissecção estéril. Coloque todas as tiras de tecido bronquiolar na segunda lavagem DMEM/RPMI 1640. Deixe na lavagem por pelo menos 2 minutos. Remova as tiras de tecido da segunda lavagem usando fórceps estéreis, tomando cuidado para não danificar o tecido. Coloque o tecido em uma placa de Petri limpa e estéril. Remova qualquer tecido mole restante preso ao brônquio e corte as tiras em quadrados (~5 mm x 5 mm) usando uma tesoura de dissecção estéril. Adicione a terceira lavagem DMEM/RPMI 1640 na placa de Petri. Misture levemente os pedaços de tecido na lavagem girando o prato. Despeje a terceira lavagem da placa de Petri sem remover os pedaços de tecido. Adicione a lavagem final do SCFM à placa de Petri contendo tecido, garantindo que todos os pedaços de tecido estejam cobertos. Esterilize os pedaços de tecido em SCFM sob luz UV por 5 minutos. Use fórceps estéreis para transferir cada peça de tecido bronquiolar esterilizado em poços individuais de uma placa/s de 24 poços contendo almofadas de agarose SCFM. Para infectar cada peça de tecido com a cepa bacteriana desejada, toque uma colônia cultivada em uma placa de ágar com a ponta de uma agulha de 29 G presa a uma seringa de insulina estéril de 0,5 mL. Em seguida, toque a colônia na peça de tecido, picando suavemente a superfície do tecido.NOTA: O uso de uma seringa de insulina equipada com uma agulha de 29 G permite que a agulha seja mantida com precisão e conforto, mantendo os dedos a uma distância segura da agulha e do tecido pulmonar. É possível realizar esta etapa usando agulhas de 29 G que não estão presas a uma seringa, mas isso requer maior destreza e aumenta o risco de uma lesão de agulha. Seringas de insulina estão prontamente disponíveis. Para os controles não infectados, pique suavemente a superfície de cada uma das peças de tecido com a ponta de uma agulha de 29 G presa a uma seringa de insulina estéril de 0,5 mL. Use uma pipeta para adicionar 500 μL de SCFM a cada poço. Esterilize uma membrana de vedação respirável para cada placa de 24 poços sob luz ultravioleta por 10 min (Tabela de Materiais). Retire a tampa/s da placa/s de 24 poços e substitua pela membrana respirável. Incubar as placas a 37 °C para o tempo desejado de incubação (infecção) sem tremer. Verifique se não há crescimento visível do patógeno inoculado nas peças de controle não infectadas (controle de contaminação).NOTA: Se desejar, a ampicillina pode ser adicionada às almofadas de agarose SCFM na etapa 2.5 e cobrindo o SCFM na etapa 2.30 para uma concentração final de 20 μg/mL. Isso suprimirá o crescimento da maioria das bactérias endógenas nos pulmões sem afetar o crescimento de P. aeruginosa ou S. aureus, mas, como a presença de ampicillina pode afetar a suscetibilidade a outros antibióticos, o leitor é deixado para fazer essa escolha dependendo das cepas e antibióticos que deseja testar. 3. Determinação da eficácia do antibiótico NOTA: Um esquema detalhando as etapas deste ensaio é fornecido na Figura S1. Para medir a tolerância a antibióticos de biofilmes formados em EVPL, a replicação de conjuntos de peças pulmonares, de pelo menos dois pulmões independentes, deve ser criada durante a dissecção e infecção. Um conjunto de peças é necessário para um controle negativo (sem tratamento antibiótico), e um conjunto é necessário para que cada concentração de antibiótico seja testada. Após 48 horas de incubação, inspecione visualmente os pedaços de tecido não infectados. Alguns crescimentos de bactérias endógenas para o pulmão de porco podem ter ocorrido, levando o SCFM em torno dessas seções a ser turva. Se o crescimento típico das espécies de estudo selecionadas for observado (por exemplo, diagnóstico de pigmentação azul-esverdeada de P. aeruginosa), reinicie o experimento com pulmões frescos. Se as seções de tecido não infectadas apresentarem nenhum ou apenas crescimento bacteriano mínimo, prepare uma placa de lavagem de 24 poços e uma placa de tratamento de 24 poços, cada uma contendo 500 μL de SCFM fresco sem antibióticos ou com o antibiótico de interesse por bem por pedaço de tecido pulmonar. Remova cada peça de tecido infectado da placa de incubação com fórceps esterilizados por chamas, gire brevemente em um poço fresco da placa de lavagem para remover quaisquer células bacterianas não associadas ao biofilme e transfira para o poço apropriado da placa de tratamento. Sele as placas de tratamento com membrana respirável fresca. Incubar a placa de tratamento/s a 37 °C sem tremer durante 18-24 h. Utilizando fórceps esterilizados de chama, remova cada peça pulmonar da placa de 24 poços e coloque em um tubo de homogeneização estéril de 2 mL contendo 1 mL de soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) e 1 g de contas metálicas(Tabela de Materiais). Bead bateu por 40 segundos a 4 m/s.NOTA: Bater de contas com as contas específicas e homogeneizador sugerido na Tabela de Materiais não causa lise significativa de bactérias, mas cada laboratório que utiliza o protocolo deve verificar os efeitos de suas contas escolhidas e homogeneizador antes de iniciar os ensaios AST. Diluir o pulmão em forma de homogeneizar o pulmão usando PBS e placa no ágar lysogeny Broth (LB) para determinar as unidades de formação da colônia (UFC) em peças de tecido não tratadas e tratadas com antibióticos de acordo com os métodos padrão de revestimento.NOTA: Opcional: Preparar placas duplicadas em mídia seletiva para confirmar identidades de colônias; por exemplo, usando ágar de sal mannitol para S. aureus.

Representative Results

O modelo EVPL fornece uma plataforma de ensaio de alto rendimento, possibilitando a triagem de um grande número de isolados bacterianos para suscetibilidade a antibióticos de uma só vez(Figuras 1 e 2) ou para tela de cepas contra uma série de concentrações de antibióticos em um experimento(Figura 3). Com a prática, descobrimos que aproximadamente 200 seções de tecido bronquiolar podem ser preparadas a partir dos pulmões em 2 horas. Todo o experimento para AST pode ser concluído dentro do horário normal de trabalho. O crescimento de Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus isola e o estabelecimento de biofilme de 48h no modelo é confiável e, quando monitorado por contagem de células viáveis, produz cargas bacterianas consistentes(Figuras 1 e 2). Podem ser encontradas imagens de biofilmes associados a tecidos de Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus cultivados em EVPL, juntamente com protocolos de preparação para microscopia leve e coloração histológica, em nossas publicações21,23. No entanto, a reprodutibilidade das contagens de UFC varia para diferentes espécies bacterianas. Isso pode ser quantificado usando cálculos de repetibilidade padrão após a ANOVA25; descobrimos que há tipicamente maior variação entre a UFC em amostras pulmonares de replicação para S. aureus do que para P. aeruginosa. Recomendamos que, na adoção do modelo por laboratório, sejam realizados cálculos repetidos em experimentos piloto para otimizar técnicas experimentais e determinar tamanhos de amostras a serem usados em experimentos finais (um exemplo disso pode ser encontrado no suplemento de dados para Sweeney et al26). Quando cultivados no EVPL, os biofilmes de P. aeruginosa e S. aureus demonstram maior tolerância a antibióticos em comparação com a suscetibilidade no padrão, o caldo aprovado pela indústria MIC(Figura 1) e os ensaios discais utilizando mídia padrão(Figura 2). Os vários efeitos de diferentes antibióticos no biofilme estabelecido pela EVPL são distinguíveis, por exemplo, a morte de P. aeruginosa é alcançada em EVPL com ciprofloxacina MIC 4-16X, mas não com clororamfenicol 4-8X MIC(Figura 1). Uma dose duas vezes por dia de 600 mg de linezolid atinge uma concentração de soro acima do MIC90 para patógenos suscetíveis (4 μg/mL)27 e é considerada como exposição adequada sem efeitos colaterais adversos28. Dados apresentados na Figura 2 mostram que as populações de S. aureus, suscetíveis à linhazolide no ensaio discal, são capazes de sobreviver às concentrações de soro alvo, e maiores (12 μg/mL), em EVPL. Não há uma correlação clara entre os efeitos mic e antibióticos em biofilmes cultivados em EVPL para P. aeruginosa (Figura 1). Obter uma medida mais precisa da tolerância a antibióticos in vivo é importante porque a dosagem sub-ideal de antibióticos poderia aumentar o risco de seleção para resistência em infecções crônicas. É sabido que o modo de crescimento do biofilme pode reduzir significativamente a suscetibilidade bacteriana aos antibióticos. Isso levou ao desenvolvimento de muitos ensaios de biofilme in vitro e ao uso de concentração mínima de erradicação de biofilm (MBEC)14,15 em vez de MIC como um preditor mais preciso de suscetibilidade em infecção crônica. O uso de SCFM (em formulações variadas) também foi recomendado para uso no teste MIC ou MBEC29. Aqui mostramos que mesmo um ensaio in vitro otimizado não pode prever com precisão a suscetibilidade de P. aeruginosa à colistina no EVPL. A quantidade de antibiótico necessária para alcançar 3 log10 mortes de bactérias cultivadas por EVPL é muitas vezes significativamente maior do que o MIC ou o MBEC calculado a partir de ensaios in vitro padrão, mesmo quando o SCFM é usado para estes ensaios(Figura 3). Isso é consistente com uma revisão de Cochrane que informou que as implementações atuais de testes de suscetibilidade de biofilm in vitro não fornecem qualquer poder preditivo aumentado para prescrição de antibióticos em CF em comparação com o teste de suscetibilidade padrão16. Também é simples usar o modelo para avaliar o impacto de antibióticos em bactérias biofilmas ao longo do tempo, pois pedaços de réplica suficientes do pulmão podem ser inoculados para permitir a amostragem destrutiva. Além de distinguir diferenças entre agentes antimicrobianos, o modelo pode destacar mudanças na suscetibilidade em diferentes estágios de crescimento bacteriano ou idade do biofilme e para diferentes intervalos de dosagem de antibióticos. A Figura 4 ilustra a crescente tolerância dos biofilmes de P. aeruginosa ao meropenem à medida que amadurecem. Isso pode ser útil para determinar a eficácia de novos agentes, por exemplo, se eles são mais eficazes durante a divisão rápida celular. Também pode ser uma consideração importante ao definir as restrições de um experimento, pois pode ser necessário padronizar e validar a idade do biofilme para evitar que a idade tenha influência nos resultados. Na Figura 5, A s. aureus sobrevida foi medida em 4h e 24 h pós exposição à flucloxacilina e foi possível observar diferenças na redução da contagem de células bacterianas ao longo do tempo e entre isolados. Isso pode ser útil para o desenvolvimento de medicamentos, por exemplo, ao definir parâmetros farmacocinéticos e farmacodinâmicos ou quando elucidar o modo de ação de um novo agente. Variações na carga bacteriana muitas vezes aumentam com tempos de cultura prolongados. Isso pode ser visto no controle não tratado na Figura 5 após o desenvolvimento de biofilmes de 48 h e uma exposição adicional de 24 horas para explicar o intervalo de dosagem de antibióticos. A variação é intrínseca ao modelo; cada amostra pulmonar é independente de outros e reflete a variação natural dos pulmões. É, portanto, importante garantir que um número suficiente de réplicas seja incluído para permitir a validação e uma interpretação precisa dos resultados. Encaminhamos o leitor de volta à nossa recomendação de realizar cálculos repetidos sobre os dados para permitir a seleção de tamanhos amostrais robustos. Para simplificar, apresentamos dados representativos extraídos de seções de tecido replicado adquiridas a partir de um único par de pulmões em cada experimento, mas na prática é necessário realizar experimentos repetidos em seções de tecido retiradas de animais de replicação. Isso deve ser feito para explicar qualquer variação biológica entre os suínos individuais, e encaminhamos o leitor ao nosso trabalho publicado, por exemplo, como os resultados podem ser consistentes entre os tecidos retirados dos suínos de replicação e como essa variação é contabilizada na análise estatística dos dados utilizando a análise de variância (ANOVA)/modelos lineares gerais (GLM)21,26. Figura 1. CfU total de 11 CF Pseudomonas aeruginosa isolados clínicos recuperados do modelo EVPL após o tratamento com antibióticos. Resultados representativos do tratamento antibiótico de P. aeruginosa no modelo EVPL. Cada cepa foi cultivada no tecido EVPL por 48 h e depois transferida para antibiótico (triângulos) ou PBS como um controle (círculos) por 18 h e a UFC/pulmão determinada. O MIC para o antibiótico apropriado determinado no MHB ajustado por cation padrão é mostrado em suportes próximos a cada cepa (x-eixo). As cepas são ordenadas pelo aumento dos valores mic. Os dados foram analisados utilizando-se testes t quando apropriados e testes de Mann-Whitney U para conjuntos de dados não paramétricos. Diferenças significativas entre antibióticos tratados e tecidos não tratados são denotadas por asteriscos(P < 0,05). A. Recuperado contagens viáveis de biofilmes P. aeruginosa cultivados no modelo EVPL e tratados com 64 μg/mL chloramphenicol (maior valor MIC registrado). Para cada isolado, a diferença média padronizada na UFC entre as seções de tecido tratados com clorofenicol e não tratadas foi calculada utilizando-se o d de Cohen. Não houve correlação entre o valor mic no teste padrão e a diminuição dos números de células viáveis no modelo EVPL medidos pela d de Cohen (correlação de grau de Spearman, rs = 0,45, p = 0,16) B. Resultados de biofilmes P. aeruginosa cultivados no modelo EVPL e tratados com ciprofloxacina de 64 μg/mL (maior valor mic registrado). Os valores abaixo da linha tracejada estavam abaixo do limite de detecção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2. CfU total de 8 isolados clínicos Staphylococcus aureus CF recuperados do modelo EVPL após o tratamento com linezolid. Cada cepa foi cultivada no tecido EVPL por 48 h e depois transferida para linezolid (triângulos) por 24 h ou não foram tratadas como controle (círculos). Todas as cepas foram consideradas sensíveis à linhazolide usando o ensaio de difusão de disco padrão seguindo as diretrizes do EUCAST30 (zona de inibição > 21 mm). Os dados foram analisados utilizando-se testes t-test quando apropriados e testes de Mann-Whitney U para conjuntos de dados não paramétricos (P < 0,05). Não foram encontradas diferenças significativas entre antibióticos tratados e não tratados para nenhuma das cepas. Os valores abaixo da linha tracejada estavam abaixo do limite de detecção. A. Resultados de biofilmes S. aureus no modelo EVPL tratados com linezolid de 4 μg/mL (ponto de ruptura clínico para sensível/resistente de acordo com a classificação EUCAST31). B. Resultados de biofilmes S. aureus no modelo EVPL tratados com linezolid de 12 μg/mL (dados reproduzidos a partir de Sweeney et al23). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3. As células de Pseudomonas aeruginosa viáveis contam com a cepa laboratorial PA14 e 4 CF de isolados clínicos recuperados do modelo EVPL após o tratamento com concentrações crescentes de colistina. Cada cepa foi cultivada no tecido EVPL por 48 h e depois exposta à colistina por 18 h. O MIC determinado no meio MHB ajustado por cation padrão é mostrado em suportes próximos a cada nome de tensão. As linhas verticais mostram o valor MBEC determinado em MHB (sólido) e SCFM (tracejado), com exceção do SED6, no qual o valor foi o mesmo em ambas as mídias. Os pontos de dados não preenchidos representam a menor concentração de colistina testada que resultou em ≥ redução de 3 log10 na UFC/pulmão em comparação com as amostras não tratadas (0 μg/mL colistina) (dados reproduzidos de Sweeney et al26). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4. A célula pseudomonas aeruginosa representável conta a partir de um curso de tempo de crescimento no modelo EVPL acima de 24 h, e tratamento subsequente com 64 μg/mL meropenem. A cepa de laboratório P. aeruginosa PA14 e 3 CF foram cultivadas no tecido EVPL para o tempo mostrado no eixo x, depois transferidas para meropenem (triângulos) por 24h ou deixadas sem tratamento como controle (círculos). A UFC/pulmão foi então determinada. O MIC determinado no meio MHB ajustado por cation é mostrado em suportes próximos a cada nome de tensão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5. A célula Staphylococcus aureus representável conta após o crescimento no modelo EVPL e depois tratada com flucloxacillina de 5 μg/mL ao longo de um curso de tempo de 24 horas. A cepa de controle ATCC29213 e dois isolados clínicos de CF foram cultivados no tecido EVPL por 48 h e depois transferidos para flucloxicilina (triângulos) ou deixados sem tratamento como controle (círculos) por 4h e 24 h, antes da CFU/pulmão ser determinada (dados reproduzidos de Sweeney et al23). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura S1. Clique aqui para baixar este número.   Tabela S1. Clique aqui para baixar esta tabela.  

Discussion

O modelo ex vivo lung é de alto rendimento e barato e, por usar resíduos pós-consumo da indústria da carne, não apresenta preocupações éticas. Ele foi projetado para imitar vias aéreas cf humanas infectadas cronicamente melhor do que as plataformas AST in vitro disponíveis atualmente. Os resultados apresentados aqui mostram que ele pode prever com mais precisão a suscetibilidade de antibióticos nessas circunstâncias.

Etapas críticas do protocolo, que garantirão resultados confiáveis e reprodutíveis incluem os seguintes:

  1. Use métodos consistentes de tempo e armazenamento entre abate, coleta e processamento de amostras pulmonares. É importante usar os pulmões o mais rápido possível após o abate e manter o potencial de contaminação ao mínimo. Diferenças na capacidade das culturas experimentais de crescer em pulmões se não forem tão frescas quanto possível foram observadas.
  2. Manter a esterilidade na produção de SCFM e dissecção de peças pulmonares é essencial. Pulmões saudáveis não são estéreis e, portanto, a presença de bactérias commensais pode refletir um ambiente “natural” para infecção crônica. No entanto, como observado anteriormente, as interações bacterianas dentro de populações multiespécies podem alterar os resultados e a suscetibilidade aos antibióticos, por isso a contaminação deve ser evitada e os pulmões devem ser esterilizados antes do uso. Defendemos o uso da esterilização UV, pois não parece causar alterações na integridade do tecido de lata e, se necessário, lavações adicionais de antibióticos. No entanto, os antibióticos devem ser usados com cautela, pois podem influenciar os resultados introduzindo pressões seletivas e podem alterar a expressão genética em populações bacterianas de teste.
  3. Use amostras de tecido de controle simulado, negativas e placas de contagem de células cultivadas em um meio não seletivo e rico para destacar o crescimento de qualquer bactéria contaminante ou commensal que não tenha sido removida durante a esterilização. Isso é essencial para mitigar qualquer impacto dessas bactérias no AST. Também é útil produzir ágar duplicado, seletivo, placas de contagem de células específicas do organismo de interesse, pois placas duplicadas aceleram a identificação da colônia e a enumeração celular.
  4. Realize experimentos piloto ao usar o modelo pela primeira vez e ao usá-lo com novas cepas ou genótipo de bactérias para avaliar variações de CFU de biofilme entre seções teciduais, permitindo a seleção de tamanhos amostrais experimentais ideais (por exemplo, quantas seções de tecido replicam para adquirir a partir de quantos pulmões replicam) através do uso de cálculos de energia.
  5. O ensaio utiliza um inóculo não padronizado, pois permite a inoculação rápida após 48 horas de incubação e a formação de cargas de biofilmes relativamente consistentes (especialmente para P. aeruginosa). Para avaliar a eficácia antibacteriana nos estágios iniciais de crescimento do biofilme, considere inocular com uma UFC padronizada de bactérias cultivadas em colônia suspensas em ASM. Não recomendamos a inoculação com bactérias planctônicas: experimentos piloto precoces mostraram que isso leva a um crescimento agudo e invasivo, não à formação confiável de biofilmes.

Este protocolo produz um modelo robusto de protótipo para uso com P. aeruginosa, com um grande potencial de desenvolvimento para uso com S. aureus,mas tem algumas limitações que precisarão ser abordadas para determinadas aplicações no futuro. O tecido foi inoculado de colônias únicas para permitir o desenvolvimento de populações clonais. Os resultados mostram que, para P. aeruginosa,isso tem pouco impacto nos números de células às 48 h. No entanto, observou-se maior variabilidade na carga bacteriana para S. aureus e, dado que diferentes bactérias podem crescer de forma diferente dentro do modelo, um inóculo inicial padronizado e uma produção rigorosa de amostras de tecido de tamanho e peso idênticos podem depender do organismo de estudo. Também pode haver diferenças entre os laboratórios devido a diferenças nas técnicas precisas de dissecção/infecção ou raça/raça/terra local. Para avaliar a reprodutibilidade das populações bacterianas para implementações individuais do modelo, sugerimos o uso de cálculos de repetibilidade como parte da análise estatística dos resultados25 e o uso de cálculos de repetibilidade/potência com base em experimentos piloto para calcular o tamanho ideal da amostra para seu uso em experimentos finais.

Uma das principais vantagens do EVPL em relação aos ensaios tradicionais da placa é que, em vez de testar bactérias crescendo plânctonicamente ou em superfícies abióticas, permite a estruturação espacial de biofilmes bacterianos dentro de um ambiente hospedeiro e com diferenciação celular. Isso tem implicações importantes para considerar o impacto dos gradientes fisioquímicos e nutrientes na atividade de agentes antimicrobianos, bem como o parto e disponibilidade de terapias ativas em diferentes microambientes dentro de uma infecção crônica e interação célula-celular entre bactérias. Este último ponto é particularmente significativo, uma vez que as infecções multiespécies são rotineiramente observadas na CF e estão se tornando cada vez mais importantes para infecções associadas a outras condições respiratórias, como asma e doença pulmonar obstrutiva crônica. Há potencial para desenvolver esse modelo para o AST para amostragem individualizada de escarro do paciente nos diagnósticos clínicos. Um estudo análogo já está em andamento usando um modelo in vitro imitador de feridas para crescimento e AST de biofilme desbridado de feridas crônicas (Southwest Regional Wound Care Center em Lubbock, Texas, Dr. R. Wolcott).

Além disso, o modelo usa tecido pós-morte, de modo que a influência da resposta imune do hospedeiro na suscetibilidade a antibióticos é limitada. Os modelos in vitro atuais também não contabilizam as respostas imunes do host, por isso não vemos isso como uma barreira para o uso futuro do modelo em aplicações AST. No entanto, a resposta imune é levada em consideração quando parâmetros farmacocinéticos e farmacodinâmicos e diretrizes de dosagem de antibióticos são determinados. Embora nossos estudos tenham mostrado evidências de células imunes residuais e respostas dentro do tecido23 (e S. Azimi, comunicação pessoal), esta é uma área privilegiada para maior otimização e desenvolvimento do modelo se um maior match com as condições in vivo for desejado.

Fornecer um AST mais clinicamente válido para CF ajudará a atender a uma recomendação fundamental da Uk Health, Social Care Act 2008, de que “os procedimentos devem estar em vigor para garantir a prescrição prudente e a administração antimicrobiana”. Acreditamos que o EVPL é um modelo ideal para ajudar a suprir essa necessidade.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a todos os nossos coautores pelos trabalhos originais dos quais tivemos resultados exemplares. O trabalho foi financiado por uma Bolsa de Pesquisa de Novos Investigadores da MRC (número de subvenção MR/R001898/1) concedida à ESF; por estudantes de doutorado da Parceria de Formação integrativa de biociências do BBSRC Midlands (MIBTP) concedida ao NEH e à IA; e pelo prêmio do Programa de Apoio à Pesquisa de Graduação da Universidade de Warwick à FA para realizar um projeto de pesquisa de férias de verão. Agradecemos a Steve Quigley, Sons (Cubbington, Warwickshire) e John Taylor, Son (Earlsden, Coventry) por fornecerem pulmões. Gostaríamos também de reconhecer a ajuda do Centro de Preparação de Mídia na Escola de Ciências da Vida da Universidade de Warwick, com agradecimentos especiais a Cerith Harries e Caroline Stewart, e a ajuda de Anita Catherwood no Warwick Antimicrobial Screening Facility.

Materials

0.5 mL insulin syringes with 29G needle attached
24-well culture plates
70% ethanol or similar for surface sterilizaton and flamin gof dissection equipment
Agar plates to prepare streaks of P. aeruginosa/S. aureus (any suitable medium)
Agarose
Aluminum foil – pre-sterilised by autoclaving – to cover the chopping board on whcih you wil dissect lungs.
Bead beater designed to take 2 mL tubes MP Biomedicals 116004500 FastPrep-24 Classic bead beating grinder and lysis system
Breathe-easy or Breathe-easier sealing membrane for multiwell plates Diversified Biotech BEM-1 or BERM-2000
Bunsen burner 
Chopping board – we recommend a plastic board to allow for easy decontamination with alcohol.
Coolbox to transport lungs to lab
Dissection scissors in different sizes
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) 
Fisherbrand 2 mL reinforced tubes  Thermo Fisher 15545809
Fisherbrand 2.38 mm metal beads Thermo Fisher 15505809
Germicidal UV cabinet
Insulin syringes -  0.5 mL with 29G needle attached. VWR BDAM324892
Large pallet knife
LB agar plates to assess CFU in lung biofilm homogenate
Mounted razor blades
Nalgene RapidFlow PES 75 mm x 0.1 µm x 500 ml sterile filter unit Thermo Fisher 10474415 For filter-sterilizing SCFM
Petri dishes
Phosphate-buffered saline
Plastic chopping board and aluminium foil to create a sterile and cleanable dissection surface
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium
SCFM ingredients as listed in Table S1
Selection of forceps (blunt tips recommended)
Selective agar plates to specifically assess P. aeruginosa / S. aureus CFU in lung biofilm homogenate, if required.
Suitable containers for disposing of contaminated sharps and pig ung tissue, according to your institution's health & safety policies.
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References

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Harrington, N. E., Sweeney, E., Alav, I., Allen, F., Moat, J., Harrison, F. Antibiotic Efficacy Testing in an Ex vivo Model of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Biofilms in the Cystic Fibrosis Lung. J. Vis. Exp. (167), e62187, doi:10.3791/62187 (2021).
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