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免疫与感染

Pruebas de Eficacia De Antibióticos En Un Modelo Ex vivo De Pseudomonas aeruginosa Y Biopelículas De Staphylococcus aureus En El Pulmón De Fibrosis Quística

Published: January 22, 2021
doi:
10.3791/62187
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1School of Life Science,University of Warwick, 2Institute of Microbiology and Infection,University of Birmingham, 3Warwick Antimicrobial Screening Facility, School of Life Science,University of Warwick

Summary

Este flujo de trabajo se puede utilizar para realizar pruebas de susceptibilidad a los antibióticos utilizando un modelo ex vivo establecido de biopelícula bacteriana en los pulmones de individuos con fibrosis quística. El uso de este modelo podría mejorar la validez clínica de los ensayos de MBEC (concentración mínima de erradicación de biopelículas).

Abstract

La prescripción efectiva de antibióticos para las biopelículas bacterianas presentes en los pulmones de los individuos con fibrosis quística (FQ) está limitada por una mala correlación entre los resultados de las pruebas de susceptibilidad a los antibióticos (AST) utilizando métodos de diagnóstico estándar (por ejemplo, microdilución de caldo, difusión de discos o Etest) y los resultados clínicos después del tratamiento con antibióticos. Los intentos de mejorar el AST mediante el uso de plataformas de crecimiento de biopelículas listas para usar muestran poca mejora en los resultados. La capacidad limitada de los sistemas de biopelículas in vitro para imitar el entorno fisicoquímico del pulmón de FQ y, por lo tanto, la fisiología bacteriana y la arquitectura de la biopelícula, también actúa como un freno en el descubrimiento de nuevas terapias para la infección por FQ. Aquí, presentamos un protocolo para realizar AST de patógenos de FQ cultivados como maduros, in vivo-como biopelículas en un modelo de pulmón de FQ ex vivo compuesto de tejido bronquiolar de cerdo y esputo sintético de FQ (pulmón de cerdo ex vivo, EVPL).

Existen varios ensayos in vitro para las pruebas de susceptibilidad a las biopelículas, utilizando un medio de laboratorio estándar o varias formulaciones de esputo FQ sintético en placas de microtíter. Es probable que tanto el medio de crecimiento como el sustrato de biopelícula (placa de poliestireno frente a tejido bronquiolar) afecten la tolerancia a los antibióticos de la biopelícula. Mostramos tolerancia aumentada de los aeruginosa clínicos de las pseudomonas y de los aislantes áureos del estafilococo en el modelo ex vivo; los efectos del tratamiento antibiótico de las biopelículas no se correlacionan con la concentración inhibitoria mínima (MIC) en los ensayos de microdilución estándar o una clasificación sensible/resistente en los ensayos de difusión de discos.

La plataforma ex vivo podría utilizarse para el AST de biopelícula a medida de muestras de pacientes y como una plataforma de pruebas mejorada para posibles agentes antibiopelícula durante la investigación y el desarrollo farmacéuticos. Mejorar la prescripción o aceleración del descubrimiento de fármacos antibiofilm a través del uso de plataformas de pruebas más in vivo podría mejorar drásticamente los resultados de salud para las personas con FQ, así como reducir los costos del tratamiento clínico y la investigación de descubrimiento.

Introduction

Las infecciones crónicas del biofilm afectan a los individuos cuyas defensas inmunes normales se comprometen. Los grupos de riesgo incluyen aquellos con la condición genética fibrosis quística (FQ)1. La colonización del moco anormalmente grueso y adhesivo en las vías respiratorias en la primera infancia conduce a infecciones intratables por biopelículas de los bronquiolos2,3. El crecimiento de bacterias como biopelículas extensas encapsuladas en matriz es un factor que distingue las infecciones crónicas de las personas inmunodeprimidas de las infecciones agudas de huéspedes sanos y el estado de la biopelícula protege a las bacterias de la exposición a los antibióticos (debido a la difusión reducida a través de la matriz) y disminuye su susceptibilidad a los antibióticos (por ejemplo, a través de la inducción de la quietud o la regulación al alza de las bombas de eflujo)4,5. Sin embargo, las alteraciones enfermedad-específicas en fisiología y química del tejido del anfitrión alteran más lejos la fisiología bacteriana de ésa observada en infecciones agudas o en condiciones estándar del crecimiento del laboratorio. Los ejemplos clave en la FQ incluyen el uso de fuentes de carbono inusuales, como los ácidos grasos y aminoácidos liberados del surfactante pulmonar y producidos por la degradación microbiana de la mucina, la liberación de micronutrientes, como el hierro de los tejidos dañados, y la microaerobiosis6,7,8.

Por lo tanto, las condiciones fisicoquímicas específicas en un contexto particular de infección por biopelículas pueden influir en las respuestas a los antibióticos. En primer lugar, la estructura y profundidad de la matriz extracelular depende de las condiciones ambientales locales, como los nutrientes o las fuerzas de cizalladura. En segundo lugar, las señales ambientales pueden desencadenar la expresión de genes específicos de resistencia a los antibióticos. Por ejemplo, el patógeno de FQ Pseudomonas aeruginosa muestra una mayor expresión de una beta-lactamasa y una expresión reducida de porinas en el esputo de FQ frente a9in vitro, mientras que otro patógeno de FQ, Burkholderia cenocepacia,regula al alza las beta-lactamasas y las bombas de eflujo cuando se cultiva en esputoFQ 10. En tercer lugar, las condiciones en el huésped pueden indicar un cambio fisiológico o genético a fenotipos tolerantes a los antibióticos, que son difíciles de recapitular in vitro. Estos incluyen pequeñas variantes de colonias del patógeno cf Staphylococcus aureus11,12.

Todos estos datos indican que cuando los laboratorios de diagnóstico aíslan clones individuales de biopelícula patógena y realizan AST en cultivos planctónicos o de placa de agar en medios de laboratorio estándar (microdilución de caldo, difusión de disco o Etest), los resultados a menudo no predicen qué antibióticos funcionarán realmente in vivo. Incluso si se utilizan ensayos de biopelículas in vitro, es posible que no señalen un fenotipo de biopelícula in vivo debido a las diferencias en el medio y la superficie de fijación utilizada, por lo que los ensayos que utilizan células de flujo o plataformas de microplacas de alto rendimiento pueden sobreestimar la sensibilidad a los antibióticos13. El mismo problema se aplica a los investigadores en el mundo académico y la industria que buscan desarrollar nuevos agentes antibiofilm: probar el potencial de fármacos utilizando plataformas in vitro como células de flujo, placas de microter o reactores de biopelícula del Centro para el Control de Enfermedades puede establecer la barra de eficacia de la biopelícula demasiado baja y producir falsos positivos en la línea de investigación y desarrollo.

La correlación pobre entre los resultados del AST y el resultado clínico después del tratamiento antibiótico en cf es bien sabido. Muchos médicos simplemente ignoran el laboratorio de diagnóstico AST, ya que no hay pautas uniformes específicas de la CF para interpretar estos resultados y, en su lugar, toman decisiones caso por caso para la prescripción. Se han hecho intentos de mejorar el CF AST mediante el uso del dispositivo de biopelícula de Calgary, que utiliza biopelículas cultivadas en la superficie de clavijas de plástico establecidas dentro de los pozos de una microplaca que contiene el medio AST estándar (por ejemplo, caldo Muller-Hinton ajustado por cationes)14,15. Este ensayo no hace mejor en la predicción de qué antibióticos funcionarán in vivo que el planctónico estándar AST16. El impacto en los pacientes con FQ es marcado. A pesar de la administración repetida de antibióticos (antibióticos inhalados regulares y una mediana de 27 días/año que reciben antibióticos intravenosos para individuos con FQ en el Reino Unido)17,los episodios frecuentes e impredecibles de exacerbación pulmonar aguda conducen a daño pulmonar progresivo y, en aproximadamente el 90% de los casos, a la muerte por insuficiencia respiratoria. En un análisis reciente, la infección pulmonar bacteriana fue el predictor más fuerte de los costos de medicamentos en la FQ, agregando en promedio € 3.6K / paciente / año para dirigir los costos de atención médica18,19.

Para las infecciones agudas de individuos sanos, la investigación y la política actuales centradas en el AST rápido basadas, por ejemplo, en la predicción genómica en el punto de atención sonideales 20. Pero en el caso de las infecciones crónicas por FQ, está claro que se necesita un enfoque diferente: la implementación de AST en modelos que imitan al huésped que recapitulan mejor el entorno in vivo y el estado metabólico del patógeno y permiten la formación de una estructura realista de la biopelícula.

Hemos desarrollado previamente un modelo de biofilm de FQ que comprende secciones de bronquiolo de cerdo incubadas en esputo sintético de FQ e infectadas con P. aeruginosa o S. aureus. La EVE no infectada conserva la histopatología normal durante 7 días, pero los aislados clínicos o de laboratorio de P. aeruginosa y S. aureus se forman reproduciblemente agregados in vivo alrededor del tejido, imitando la etiología de la infección por FQ21,22,23. Presentamos un protocolo para el uso de este modelo de alta validez y alto rendimiento como una plataforma AST de biopelículas a medida para la FQ y presentamos resultados ejemplares que muestran la alta tolerancia de las biopelículas de patógenos a los antibióticos utilizados clínicamente cuando se cultivan en el modelo. El modelo podría incorporarse fácilmente en la investigación, las tuberías de desarrollo para la gestión o prevención de la formación de biopelículas y potencialmente en el diagnóstico de AST. La mayoría de los equipos utilizados (ver Tabla de Materiales) se pueden encontrar fácilmente en un laboratorio de microbiología típico, aunque un batidor de cuentas es esencial, y hemos encontrado en el trabajo con colaboradores que un gabinete germicida ultravioleta adecuado también puede necesitar ser adquirido. Como los pulmones provienen de carniceros o mataderos comerciales, el modelo no presenta preocupaciones éticas.

Protocol

Este protocolo utiliza pulmones de cerdo procedentes de un matadero comercial que suministra carne para el consumo humano. Según la legislación del Reino Unido, el uso de tejido sobrante de animales sacrificados para la producción de carne no requiere aprobación ética; aconsejamos a los lectores que revisen las leyes locales relevantes y las directrices institucionales antes de comenzar a trabajar. 1. Preparación de medios sintéticos de esputo CF (SCFM) Para hacer SCFM para su uso con tejido EVPL, siga la receta descrita por Palmer et al.24 con la modificación de que la glucosa se elimina de la receta.NOTA: La receta de Palmer et al. contiene aminoácidos libres, cationes, aniones y lactato a concentraciones representativas de las concentraciones medias encontradas en una selección de muestras de esputo de pacientes con FQ. Se ha demostrado que las vías de uso de carbono comparables y la expresión de señales de detección de quórum por P. aeruginosa PA14 para el crecimiento en el medio hecho de esputo de paciente liofilizado24. En el Cuadro S1se suministra una receta de SCFM modificado de 1 L. Filtrar esterilizar el SCFM inmediatamente después de la preparación y almacenar a 4 °C durante un hasta 1 mes. 2. Disección e infección del tejido pulmonar de cerdo ex vivo (EVPL) Antes de la disección, prepare una/s placa/s de agar de la/s cepa/s bacteriana/s requerida/s para la infección usando cualquier agar que sea estándar en el laboratorio para P. aeruginosa/S.aureus (por ejemplo, caldo de lisogenia + 1.2% de agar). Calcule cuántas piezas de tejido bronquiolar porcino se requieren para el experimento, incluidas las piezas de tejido de control no infectadas. Multiplique este número por dos para repetir el experimento en dos pulmones replicados para confirmar la repetibilidad de los resultados. Multiplique el número total de piezas de tejido necesarias por 0,5 para determinar el volumen de agarosa SCFM (mL) necesario para hacer almohadillas de agarosa para hacer suficiente medio para 400 μL / pieza de tejido más agar SCFM de repuesto para tener en cuenta cualquier error de pipeteo o evaporación durante la preparación. Añadir 0,12 g de agarosa a cada 15 mL de SCFM necesarios para hacer el volumen total deseado de SCFM con 0,8% de peso/volumen de agarosa. Calentar la solución de agarosa SCFM hasta que la agarosa se disuelva por completo. Se recomienda un microondas doméstico a baja potencia. El tiempo requerido depende de la potencia del microondas. Deje que la agarosa se enfríe a aproximadamente 50 °C (caliente al tacto pero cómodo de sostener). No permita enfriar más. Usando una pipeta, agregue 400 μL de la agarosa SCFM a un pozo de una placa de 24 pozos por pieza de tejido necesaria. Esterilice la placa/s de 24 pozos que contiene agarosa SCFM bajo luz ultravioleta durante 10 min. Prepare tres lavados de réplica para cada pulmón intacto que se disecciona utilizando 20 mL de medio eagle modificado de Dulbecco estéril (DMEM) más 20 mL de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 estéril complementado con 50 μg/mL de ampicilina. Haga una alícuota de 40 mL scfm como un lavado final para cada pulmón intacto que se disecciona. Todos los lavados pueden almacenarse durante la noche a 4 °C o utilizarse inmediatamente. Obtenga los pulmones de la fuente designada tan pronto como sea posible después del sacrificio, asegurándose de que se mantengan fríos transportándolos al laboratorio en una caja de refrigeración doméstica.NOTA: Los pulmones más cercanos al día de la matanza muestran menos moretones por el almacenamiento, pero también se puede utilizar tejido mantenido en cámara frigorífica hasta 4 días desde el sacrificio. Como la caja frial debe llevarse a la carnicería o matadero, debe descontaminarse siguiendo las directrices del laboratorio local después de cada uso y almacenarse fuera del laboratorio de microbiología cuando no esté en uso, para reducir el riesgo de contaminación y una violación de la contención. Trabajando en una superficie esterilizada y bajo una llama, coloque los pulmones en una tabla de cortar de plástico limpio cubierta con papel de aluminio en autoclave. Compruebe que los bronquiolos permanecen intactos. Si ha habido algún daño en el matadero o durante el transporte, los pulmones no son adecuados para su uso. Caliente un cuchillo de paleta bajo una llama y toque muy brevemente el cuchillo en el área del pulmón que rodea el bronquiolo para esterilizar la superficie del tejido. Corte el tejido superficial que rodea el bronquiolo usando una cuchilla de afeitar montada estérilmente. Haga incisiones paralelas al bronquiolo para prevenir cualquier daño. Una vez que el bronquiolo ha sido expuesto, haga una incisión transversal a través del bronquiolo en el punto más alto visible para liberar el bronquiolo. Usando fórceps estériles, sostenga ligeramente el extremo libre del bronquiolo y corte cualquier tejido no deseado restante usando una cuchilla de afeitar montada estérilmente. Haga una incisión transversal final a través del bronquiolo antes de que cualquier ramificación sea visible para eliminar el bronquiolo de los pulmones. Coloque el bronquiolo en el primer lavado DMEM/RPMI 1640. Deje el bronquiolo en el lavado y repita los pasos 2.11-2.14 para cosechar secciones adicionales de bronquiolo del mismo pulmón según sea necesario para producir suficientes secciones de tejido para el experimento planificado. Colocar cualquier sección bronquiolar adicional del mismo pulmón en el lavado (paso 2.16). Dejar en el lavado durante al menos 2 min. Retire los bronquiolos del primer lavado DMEM/RPMI 1640 y coloque las muestras en una placa de Petri estéril. Sostenga cada bronquiolo ligeramente usando fórceps estériles, asegurándose de no dañar el tejido. Retire tanto tejido blando restante como sea posible y corte el tejido en tiras de ~ 5 mm de ancho usando tijeras de disección estériles. Coloque todas las tiras de tejido bronquiolar en el segundo lavado DMEM/RPMI 1640. Dejar en el lavado durante al menos 2 min. Retire las tiras de tejido del segundo lavado con fórceps estériles, teniendo cuidado de no dañar el tejido. Coloque el tejido en una placa de Petri limpia y estéril. Retire cualquier tejido blando restante unido al bronquiolo y corte las tiras en cuadrados (~ 5 mm x 5 mm) usando tijeras de disección estériles. Añadir el tercer lavado DMEM/RPMI 1640 en la placa de Petri. Mezcle ligeramente las piezas de tejido en el lavado arremolinándose el plato. Vierta el tercer lavado de la placa de Petri sin quitar las piezas de tejido. Agregue el lavado final de SCFM a la placa de Petri que contiene tejido, asegurándose de que todas las piezas de tejido estén cubiertas. Esterilice las piezas de tejido en SCFM bajo luz UV durante 5 min. Use fórceps estériles para transferir cada pieza de tejido bronquiolar esterilizado a pocillos individuales de una placa/s de 24 pocillos que contienen almohadillas de agarosa SCFM. Para infectar cada pieza de tejido con la cepa bacteriana deseada, toque una colonia cultivada en una placa de agar con la punta de una aguja de 29 G unida a una jeringa de insulina estéril de 0,5 ml. Luego toque la colonia en la pieza de tejido, pinchando suavemente la superficie del tejido.NOTA: El uso de una jeringa de insulina equipada con una aguja de 29 G permite que la aguja se sostend sea sostenida con precisión y comodidad mientras se mantienen los dedos a una distancia segura de la aguja y del tejido pulmonar. Es posible realizar este paso usando agujas de 29 G que no están unidas a una jeringa, pero esto requiere una mayor destreza y aumenta el riesgo de una lesión por pinchazo de aguja. Las jeringas de insulina están fácilmente disponibles. Para los controles no infectados, pinche suavemente la superficie de cada pieza de tejido con la punta de una aguja de 29 G unida a una jeringa de insulina estéril de 0,5 ml. Utilice una pipeta para agregar 500 μL de SCFM a cada pozo. Esterilice una membrana de sellado transpirable para cada placa de 24 pozos bajo luz ultravioleta durante 10 min(Tabla de materiales). Retire la/s tapa/s de la/s placa/s de 24 pozos y reemplácela con la membrana transpirable. Incubar las placas a 37 °C durante el tiempo de incubación (infección) deseado sin agitar. Compruebe que no hay crecimiento visible del patógeno inoculado en las piezas de control no infectadas (control de contaminación).NOTA: Si se desea, se puede agregar ampicilina a las almohadillas de agarosa SCFM en el paso 2.5 y cubrir scfm en el paso 2.30 a una concentración final de 20 μg/mL. Esto suprimirá el crecimiento de la mayoría de las bacterias endógenas en los pulmones sin afectar el crecimiento de P. aeruginosa o S. aureus pero, como la presencia de ampicilina puede afectar la susceptibilidad a otros antibióticos, el lector debe tomar esta decisión dependiendo de las cepas y antibióticos que desee probar. 3. Determinación de la eficacia de los antibióticos NOTA: En la Figura S1se proporciona un esquema que detalla los pasos de este ensayo. Para medir la tolerancia a los antibióticos de las biopelículas formadas en evpl, conjuntos de réplicas de piezas pulmonares, de al menos dos pulmones independientes, deben configurarse durante la disección y la infección. Se requiere un conjunto de piezas para un control negativo (sin tratamiento antibiótico), y un conjunto se requiere para cada concentración de antibiótico que se va a probar. Después de 48 horas de incubación, inspeccione visualmente las piezas de tejido no infectadas. Un cierto crecimiento de bacterias endógenas al pulmón del cerdo pudo haber ocurrido, llevando el SCFM alrededor de estas secciones para ser turbio. Si se observa un crecimiento típico de las especies de estudio seleccionadas (por ejemplo, diagnóstico de pigmentación azul verdosa de P. aeruginosa),se vuelve a iniciar el experimento con pulmones frescos. Si las secciones de tejido no infectado muestran un crecimiento bacteriano nulo o sólo mínimo, prepare una placa de lavado de 24 pozos y una placa de tratamiento de 24 pozos, cada una conteniendo 500 μL de SCFM fresco sin antibióticos o con el antibiótico de interés por pozo por pieza de tejido pulmonar. Retire cada pieza de tejido infectada de la placa de incubación con fórceps esterilizados por llama, gire brevemente en un pozo fresco de la placa de lavado para eliminar cualquier célula bacteriana asociada a la biopelícula y transfile al pozo apropiado de la placa de tratamiento. Selle las placas de tratamiento con membrana transpirable fresca. Incubar la/s placa/s de tratamiento a 37 °C sin agitar durante 18-24 h. Usando fórceps esterilizados por llama, retire cada pieza pulmonar de la placa de 24 pocillos y coloque un tubo de homogeneización estéril de 2 mL que contenga 1 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y 1 g de perlas metálicas(Tabla de Materiales). El cordón batió durante 40 segundos a 4 m/s.NOTA: El batido de perlas con las perlas específicas y el homogeneizador sugeridos en la Tabla de materiales no causa una lisis significativa de bacterias, pero cada laboratorio que utiliza el protocolo debe verificar los efectos de sus perlas y homogeneizador elegidos antes de iniciar los ensayos de AST. Diluya en serie el homogeneato pulmonar usando PBS y placa en agar caldo de lisigenia (LB) para determinar las unidades formadoras de colonias (UFC) en piezas individuales de tejido no tratadas y tratadas con antibióticos de acuerdo con los métodos de revestimiento estándar.NOTA: Opcional: Prepare placas duplicadas en medios selectivos para confirmar las identidades de las colonias; por ejemplo, el uso de agar sal manitol para S. aureus.

Representative Results

El modelo EVPL proporciona una plataforma de ensayo de alto rendimiento, lo que permite examinar un gran número de aislados bacterianos para detectar la susceptibilidad a los antibióticos a la vez(Figuras 1 y 2)o detectar cepas contra un rango de concentraciones de antibióticos en un experimento(Figura 3). Con la práctica, hemos encontrado que aproximadamente 200 secciones de tejido bronquiolar se pueden preparar a partir de los pulmones en 2 horas. Todo el experimento para AST se puede completar dentro de las horas de trabajo normales. El crecimiento de los aislados de Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus y el establecimiento de biopelículas de 48 h en el modelo es fiable y, cuando se monitoriza mediante un recuento celular viable, produce cargasbacterianas consistentes (Figuras 1 y 2). Se pueden encontrar imágenes de biopelículas asociadas a tejidos de Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus cultivadas en EVPL, junto con protocolos de preparación para microscopía de luz y tinción histológica, en nuestras publicaciones21,23. Sin embargo, la reproducibilidad de los recuentos de UFC varía para diferentes especies bacterianas. Esto se puede cuantificar utilizando cálculos de repetibilidad estándar después de ANOVA25; Hemos encontrado que hay típicamente mayor variación entre la UFC en muestras pulmonares replicadas para S. aureus que para P. aeruginosa. Recomendamos que, al ser adoptada el modelo por un laboratorio, se realicen cálculos repetidos en experimentos piloto para optimizar las técnicas experimentales y determinar los tamaños de las muestras que se utilizarán en los experimentos finales (un ejemplo de esto se puede encontrar en el suplemento de datos para Sweeney et al26). Cuando se cultivan en el EVPL, las biopelículas de P. aeruginosa y S. aureus demuestran una mayor tolerancia a los antibióticos en comparación con la susceptibilidad en el MIC de caldo estándar aprobado por la industria(Figura 1)y los ensayos de disco utilizando medios estándar(Figura 2). Los diversos efectos de los diferentes antibióticos sobre el biofilm establecido en EVPL son distinguibles, por ejemplo, la muerte de P. aeruginosa se logra en EVPL con 4-16X MIC ciprofloxacina pero no con 4-8X MIC cloranfenicol(Figura 1). Una dosis dos veces al día de linezolid de 600 mg alcanza una concentración sérica superior a laMIC 90 para patógenos susceptibles (4 μg/mL)27 y se considera una exposición adecuada sin efectos secundarios adversos28. Los datos presentados en la Figura 2 muestran que las poblaciones de S. aureus, susceptibles a linezolid en el ensayo de disco, son capaces de sobrevivir a concentraciones séricas objetivo, y superiores (12 μg/mL), en EVPL. No existe una correlación clara entre la MIC y los efectos antibióticos sobre las biopelículas cultivadas con EVPL para P. aeruginosa (Figura 1). Obtener una medida más precisa de la tolerancia a los antibióticos in vivo es importante porque la dosificación subóptima de los antibióticos podría aumentar el riesgo de selección de resistencia en la infección crónica. Es bien sabido que el modo de crecimiento de la biopelícula puede reducir significativamente la susceptibilidad bacteriana a los antibióticos. Esto ha llevado al desarrollo de muchos ensayos de biopelículas in vitro y al uso de la concentración mínima de erradicación de biopelículas (MBEC)14,15 en lugar de mic como un predictor más preciso de la susceptibilidad en la infección crónica. También se ha recomendado el uso de SCFM (en diferentes formulaciones) para su uso en ensayos MIC o MBEC29. Aquí mostramos que incluso un ensayo in vitro optimizado no puede predecir con precisión la susceptibilidad de P. aeruginosa a la colistina en la EVPL. La cantidad de antibiótico necesaria para lograr la matanza de 3 log10 de bacterias cultivadas con EVPL es a menudo significativamente mayor que el MIC o el MBEC calculado a partir de ensayos in vitro estándar, incluso cuando se utiliza SCFM para estos ensayos(Figura 3). Esto es consistente con una revisión Cochrane que informó que las implementaciones actuales de las pruebas de susceptibilidad a las biopelículas in vitro no proporcionan ningún mayor poder predictivo para la prescripción de antibióticos en la FQ en comparación con las pruebas de susceptibilidad estándar16. También es sencillo utilizar el modelo para evaluar el impacto de los antibióticos en las bacterias del biofilm a lo largo del tiempo, ya que se pueden inocular suficientes piezas de réplica de pulmón para permitir el muestreo destructivo. Además de distinguir las diferencias entre los agentes antimicrobianos, el modelo puede destacar los cambios en la susceptibilidad en diferentes etapas de crecimiento bacteriano o edad de la biopelícula y para diferentes intervalos de dosificación de antibióticos. La Figura 4 ilustra el aumento de la tolerancia de las biopelículas de P. aeruginosa al meropenem a medida que maduran. Esto podría ser útil para determinar la eficacia de nuevos agentes, por ejemplo, si son más eficaces durante la división celular rápida. También puede ser una consideración importante al establecer las restricciones de un experimento, ya que puede ser necesario estandarizar y validar la edad de la biopelícula para evitar que la edad influya en los resultados. En la Figura 5,se midió la supervivencia de S. aureus a las 4 h y 24 h después de la exposición a flucloxacilina y fue posible observar diferencias en la reducción para los recuentos celulares bacterianos a través del tiempo y entre aislados. Esto puede ser útil para el desarrollo de fármacos, por ejemplo, al definir parámetros farmacocinéticos y farmacodinámicos o al dilucidar el modo de acción de un agente nuevo. Las variaciones en la carga bacteriana a menudo aumentan con los tiempos de cultivo prolongados. Esto se puede ver en el control no tratado en la Figura 5 después del desarrollo de biopelículas de 48 h y una exposición adicional de 24 h para tener en cuenta el intervalo de dosificación de antibióticos. La variación es intrínseca al modelo; cada muestra pulmonar es independiente de otras y refleja la variación natural de los pulmones. Por lo tanto, es importante asegurarse de que se incluye un número suficiente de réplicas para permitir la validación y una interpretación precisa de los resultados. Remitimos al lector de nuevo a nuestra recomendación de realizar cálculos repetidos en los datos para permitir la selección de tamaños de muestra robustos. Para simplificar, hemos presentado datos representativos tomados de secciones de tejidos replicados adquiridos de un solo par de pulmones en cada experimento, pero en la práctica es necesario realizar experimentos repetidos en secciones de tejido tomadas de animales replicados. Esto debe hacerse con el fin de tener en cuenta cualquier variación biológica entre cerdos individuales, y remitimos al lector a nuestro trabajo publicado para obtener ejemplos de cuán consistentes pueden ser los resultados entre los tejidos tomados de cerdos replicados y cómo se explica esta variación en el análisis estadístico de datos utilizando análisis de varianza (ANOVA)/modelos lineales generales (GLM)21,26. Figura 1. CFU total de 11 aislantes clínicos de la pseudomonas aeruginosa de los CF se recuperó del modelo de EVPL después del tratamiento con los antibióticos. Resultados representativos del tratamiento antibiótico de P. aeruginosa en el modelo EVPL. Cada tensión fue crecida en el tejido de EVPL por 48 h entonces transferida al antibiótico (triángulos) o a PBS como control (círculos) para 18 h y el CFU/el pulmón determinado. El MIC para el antibiótico apropiado determinado en MHB catión-ajustado estándar se muestra entre paréntesis al lado de cada tensión (eje x). Las cepas se ordenan aumentando los valores de MIC. Los datos se analizaron mediante pruebas t cuando fue apropiado y pruebas U de Mann-Whitney para conjuntos de datos no paramétricos. Las diferencias significativas entre los tejidos tratados antibióticos y no tratados se denotan con asteriscos(P < 0,05). A. Se recuperaron recuentos viables de biopelículas de P. aeruginosa cultivadas en el modelo EVPL y tratadas con cloranfenicol de 64 μg/mL (valor de MIC más alto registrado). Para cada aislante, la diferencia mala estandardizada en CFU entre las secciones cloranfenicol-tratadas y no tratadas del tejido era calculada usando Cohen’ s d. No había correlación entre el valor de MIC en la prueba estándar y la disminución de números viables de la célula en el modelo de EVPL según lo medido por d de Cohen (correlación espesa de Spearman, rs = 0,45, p = 0,16) B. Resultados de biopelículas de P. aeruginosa cultivadas en el modelo EVPL y tratadas con ciprofloxacina de 64 μg/mL (valor de MIC más alto registrado). Los valores por debajo de la línea discontinua estaban por debajo del límite de detección. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura. Figura 2. CFU total de 8 aislantes clínicos del cf del estafilococo áureo se recuperó del modelo de EVPL después del tratamiento con linezolid. Cada tensión fue crecida en el tejido de EVPL para 48 h entonces transferida al linezolid (triángulos) para 24 h o era no tratada como control (círculos). Se encontró que todas las cepas eran sensibles al linezolid utilizando el ensayo de difusión de disco estándar siguiendo las directrices30 de EUCAST (zona de inhibición > 21 mm). Los datos fueron analizados usando las t-pruebas cuando estaba apropiado y las pruebas de Mann-Whitney U para los conjuntos de datos no-paramétricos(P < 0,05). No se encontraron diferencias significativas entre los antibióticos tratados y no tratados para ninguna de las cepas. Los valores por debajo de la línea discontinua estaban por debajo del límite de detección. A. Resultados de biopelículas de S. aureus en el modelo EVPL tratadas con linezolid de 4 μg/mL (punto de interrupción clínico para sensible/resistente según la clasificación EUCAST31). B. Resultados de biopelículas de S. aureus en el modelo EVPL tratadas con linezolid de 12 μg/mL (datos reproducidos de Sweeney et al23). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura. Figura 3. Las cuentas de célula viables de la pseudomonas aeruginosa de la tensión pa14 del laboratorio y 4 aislantes clínicos de los CF se recuperaron del modelo de EVPL después del tratamiento con concentraciones cada vez mayores de colistin. Cada tensión fue crecida en el tejido de EVPL para 48 h entonces expuestas a la colistina para 18 H. El MIC determinado en el medio MHB estándar ajustado por cationes se muestra entre paréntesis junto al nombre de cada cepa. Las líneas verticales muestran el valor mbec determinado en MHB (sólido) y SCFM (discontinuo), con la excepción de SED6, en el que el valor era el mismo en ambos medios. Los puntos de datos no llenados representan la concentración más baja de colistina analizada que resultó en ≥ reducción de 3 log10 en UFC/pulmón en comparación con las muestras no tratadas (0 μg/mL de colistina) (datos reproducidos de Sweeney et al26). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura. Figura 4. Recuentos celulares de Pseudomonas aeruginosa viables representativas a partir de un curso temporal de crecimiento en el modelo EVPL de más de 24 h, y el tratamiento posterior con meropenem de 64 μg/mL. La cepa de laboratorio P. aeruginosa PA14 y 3 aislados clínicos cf fueron cultivados en el tejido EVPL durante el tiempo mostrado en el eje x, luego transferido a meropenem (triángulos) durante 24 h o dejado sin tratar como un control (círculos). El CFU/el pulmón entonces fue determinado. El MIC determinado en medio MHB ajustado por cationes se muestra entre paréntesis junto al nombre de cada cepa. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura. Figura 5. Recuentos de células de Staphylococcus aureus viables representativos después del crecimiento en el modelo EVPL luego tratado con flucloxacilina de 5 μg/mL durante un curso de tiempo de 24 h. La cepa control ATCC29213 y dos aislados clínicos de FQ fueron cultivados en tejido EVPL durante 48 h luego transferidos a flucloxacilina (triángulos) o dejados sin tratar como control (círculos) durante 4 h y 24 h, antes de que se determinara la UFC/pulmón (datos reproducidos de Sweeney et al23). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura. Figura S1. Haga clic aquí para descargar esta figura.   Tabla S1. Haga clic aquí para descargar esta tabla.  

Discussion

El modelo pulmonar ex vivo es de alto rendimiento y barato y, debido a que utiliza residuos post-consumo de la industria cárnica, no presenta preocupaciones éticas. Está diseñado para imitar las vías respiratorias FQ humanas crónicamente infectadas mejor que las plataformas de AST in vitro actualmente disponibles. Los resultados presentados aquí muestran que puede predecir con mayor precisión la susceptibilidad a los antibióticos en estas circunstancias.

Los pasos críticos en el protocolo, que garantizarán resultados confiables y reproducibles incluyen los siguientes:

  1. Utilice métodos consistentes de tiempo y almacenamiento entre el sacrificio, la recolección y el procesamiento de muestras de pulmón. Es importante utilizar los pulmones lo antes posible después del sacrificio y mantener el potencial de contaminación al mínimo. Se han observado diferencias en la capacidad de los cultivos experimentales para crecer en los pulmones si no son lo más frescos posible.
  2. Mantener la esterilidad en la producción de SCFM y la disección de piezas pulmonares es esencial. Los pulmones sanos no son estériles y, por lo tanto, la presencia de bacterias cómicas puede reflejar un entorno “natural” para la infección crónica. Sin embargo, como se señaló anteriormente, las interacciones bacterianas dentro de las poblaciones multiespeies pueden alterar los resultados y la susceptibilidad a los antibióticos, por lo que se debe evitar la contaminación y los pulmones deben esterilizarse antes de su uso. Abogamos por el uso de la esterilización UV, ya que no parece causar cambios en la integridad del tejido de estaño y, si es necesario, lavados antibióticos adicionales. Sin embargo, los antibióticos deben usarse con precaución, ya que pueden influir en los resultados mediante la introducción de presiones selectivas y pueden alterar la expresión génica en las poblaciones bacterianas de prueba.
  3. Utilice muestras de tejido de control negativo infectadas simuladas y placas de recuento celular cultivadas en un medio rico y no selectivo para resaltar el crecimiento de cualquier contaminante o bacteria comensal que no se haya eliminado durante la esterilización. Esto es esencial para mitigar cualquier impacto de estas bacterias en AST. También es útil producir placas de recuento celular duplicadas y selectivas específicas para el organismo de interés, ya que las placas duplicadas aceleran la identificación de colonias y la enumeración celular.
  4. Realizar experimentos piloto cuando se utiliza por primera vez el modelo y cuando se utiliza con nuevas cepas o genotipo de bacterias para evaluar las variaciones de biopelícula cfu entre las secciones de tejido, lo que permite la selección de tamaños de muestra experimentales óptimos (por ejemplo, cuántas secciones de tejido replican para adquirir de cuántos pulmones replicados) mediante el uso de cálculos de potencia.
  5. El ensayo utiliza un inóculo no estandarizado, ya que esto permite una inoculación rápida después de 48 horas de incubación y la formación de cargas de biopelículas relativamente consistentes (especialmente para P. aeruginosa). Para probar la eficacia antibacteriana en las primeras etapas de crecimiento de biopelículas, considere inocular con una UFC estandarizada de bacterias cultivadas en colonias suspendidas en la ASM. No recomendamos inocular con bacterias planctónicas: los primeros experimentos piloto mostraron que esto conduce a un crecimiento agudo e invasivo y no a una formación fiable de biopelículas.

Este protocolo produce un modelo prototipo robusto para su uso con P. aeruginosa,con un gran potencial de desarrollo para su uso con S. aureus,pero tiene algunas limitaciones que deberán abordarse para ciertas aplicaciones en el futuro. El tejido fue inoculado de solas colonias para permitir el desarrollo de poblaciones clónicas. Los resultados muestran que, para P. aeruginosa,esto tiene poco impacto en los números celulares a las 48 h. Sin embargo, se observó una mayor variabilidad en la carga bacteriana para S. aureus y, dado que diferentes bacterias pueden crecer de manera diferente dentro del modelo, un inóculo inicial estandarizado y una producción rigurosa de muestras de tejido de idéntico tamaño y peso pueden depender del organismo de estudio. También puede haber diferencias entre los laboratorios debido a las diferencias en las técnicas precisas de disección / infección o raza de cerdo local / variedad autóctona. Para evaluar la reproducibilidad de las poblaciones bacterianas para implementaciones individuales del modelo, sugerimos el uso de cálculos de repetibilidad como parte del análisis estadístico de los resultados25 y el uso de cálculos de repetibilidad/potencia basados en experimentos piloto para calcular el tamaño óptimo de la muestra para su uso en experimentos finales.

Una de las ventajas clave de EVPL sobre los ensayos de placas tradicionales es que, en lugar de probar bacterias que crecen planctonónicamente o en superficies abióticas, permite la estructuración espacial de biopelículas bacterianas dentro de un entorno huésped y con diferenciación celular. Esto tiene implicaciones importantes para considerar el impacto de los gradientes fisioquímicos y de nutrientes en la actividad de los agentes antimicrobianos, así como la entrega y disponibilidad de terapias activas en diferentes microambientes dentro de una infección crónica y la interacción célula-célula entre bacterias. Este último punto es particularmente significativo, ya que las infecciones multiespecie se observan rutinariamente en la FQ y se están volviendo cada vez más importantes para las infecciones asociadas con otras afecciones respiratorias, como el asma y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica. Existe el potencial de desarrollar este modelo para el AST para el muestreo individualizado de esputo de los pacientes en el diagnóstico clínico. Un ensayo análogo ya está en marcha utilizando un modelo in vitro que imita heridas para el crecimiento y AST de biopelícula desbridada de heridas crónicas (Southwest Regional Wound Care Center en Lubbock, Texas, Dr. R. Wolcott).

Además, el modelo utiliza tejido post mortem, por lo que la influencia de la respuesta inmune del huésped en la susceptibilidad a los antibióticos es limitada. Los modelos in vitro actuales tampoco tienen en cuenta las respuestas inmunitarias del huésped, por lo que no vemos esto como una barrera para el uso futuro del modelo en aplicaciones de AST. Sin embargo, la respuesta inmune se tiene en cuenta cuando se determinan los parámetros farmacocinéticos y farmacodinámicos y las pautas de dosificación de antibióticos. Aunque nuestros estudios han mostrado evidencia de células inmunes residuales y respuestas dentro del tejido23 (y S. Azimi, comunicación personal), esta es un área privilegiada para una mayor optimización y desarrollo del modelo si se desea una mayor coincidencia con las condiciones in vivo.

Proporcionar más AST clínicamente válido para la FQ ayudará a cumplir con una recomendación clave de la Ley de Salud y Atención Social del Reino Unido de 2008 de que “los procedimientos deben estar en su lugar para garantizar la prescripción prudente y la administración antimicrobiana”. Creemos que el EVPL es un modelo candidato ideal para ayudar a satisfacer esta necesidad.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a todos nuestros coautores de los trabajos originales de los que hemos sacado resultados ejemplares. El trabajo fue financiado por una beca de investigación para nuevos investigadores del MRC (número de subvención MR/R001898/1)otorgada a FH; por estudiantes de doctorado de la BBSRC Midlands Integrative Biosciences Training Partnership (MIBTP) otorgado a NEH e IA; y por el premio del Esquema de Apoyo a la Investigación de Pregrado de la Universidad de Warwick a la FA para llevar a cabo un proyecto de investigación de vacaciones de verano. Agradecemos a Steve Quigley, Sons (Cubbington, Warwickshire) y John Taylor, Son (Earlsden, Coventry) por suministrar pulmones. También nos gustaría agradecer la ayuda del Centro de Preparación de Medios en la Facultad de Ciencias de la Vida de la Universidad de Warwick, con un agradecimiento especial a Cerith Harries y Caroline Stewart, y la ayuda de Anita Catherwood en el Centro de Detección de Antimicrobianos de Warwick.

Materials

0.5 mL insulin syringes with 29G needle attached
24-well culture plates
70% ethanol or similar for surface sterilizaton and flamin gof dissection equipment
Agar plates to prepare streaks of P. aeruginosa/S. aureus (any suitable medium)
Agarose
Aluminum foil – pre-sterilised by autoclaving – to cover the chopping board on whcih you wil dissect lungs.
Bead beater designed to take 2 mL tubes MP Biomedicals 116004500 FastPrep-24 Classic bead beating grinder and lysis system
Breathe-easy or Breathe-easier sealing membrane for multiwell plates Diversified Biotech BEM-1 or BERM-2000
Bunsen burner 
Chopping board – we recommend a plastic board to allow for easy decontamination with alcohol.
Coolbox to transport lungs to lab
Dissection scissors in different sizes
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) 
Fisherbrand 2 mL reinforced tubes  Thermo Fisher 15545809
Fisherbrand 2.38 mm metal beads Thermo Fisher 15505809
Germicidal UV cabinet
Insulin syringes -  0.5 mL with 29G needle attached. VWR BDAM324892
Large pallet knife
LB agar plates to assess CFU in lung biofilm homogenate
Mounted razor blades
Nalgene RapidFlow PES 75 mm x 0.1 µm x 500 ml sterile filter unit Thermo Fisher 10474415 For filter-sterilizing SCFM
Petri dishes
Phosphate-buffered saline
Plastic chopping board and aluminium foil to create a sterile and cleanable dissection surface
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium
SCFM ingredients as listed in Table S1
Selection of forceps (blunt tips recommended)
Selective agar plates to specifically assess P. aeruginosa / S. aureus CFU in lung biofilm homogenate, if required.
Suitable containers for disposing of contaminated sharps and pig ung tissue, according to your institution's health & safety policies.
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References

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Harrington, N. E., Sweeney, E., Alav, I., Allen, F., Moat, J., Harrison, F. Antibiotic Efficacy Testing in an Ex vivo Model of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Biofilms in the Cystic Fibrosis Lung. J. Vis. Exp. (167), e62187, doi:10.3791/62187 (2021).
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